蒙医药是蒙古族人民宝贵的文化遗产，也是我国民族医药的重要组成部分［1］。草乌，蒙药名为泵嘎，是蒙医药的常用药材之一。草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii的干燥块根［2］，具有杀“黏”、燥黄水及止痛等功效［3］。现代研究发现草乌的主要成分是以乌头碱为代表的双酯型生物碱，该类成分既是药理成分也是毒性成分。因为草乌具有“毒”与“效”并存的特点，蒙医药多用诃子汤炮制法，诃子及甘草与其合用等方式来降低草乌的毒性［4-5］。诃子，蒙药名为“阿如拉”，为使君子科植物绒毛诃子或诃子的干燥成熟果实。诃子具有调和三根、解毒之功效，因此被誉为“蒙药之王”［6］。诃子果实中含有近30%的鞣质，其中具有抗氧化、抗炎作用的鞣花酸为代表成分之一［7］。甘草为豆科植物Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎，在中药与蒙医药中均具有解毒功效。甘草苷作为甘草黄酮类的代表成分之一，具有心脏保护的药理作用［8］。本课题组前期研究发现草乌可下调肝脏细胞色素（CYP）P450的表达，而诃子、甘草与草乌配伍后可上调其表达，减少乌头类生物碱在体内的蓄积时间，起到减毒的作用［9］。但是对于草乌的毒性靶器官心脏，诃子、甘草与其合用之后能否可通过调控心脏CYP产生减毒增效的作用尚未进行研究。在心脏CYP系统中CYP2J家族主要参与花生四烯酸（AA）的代谢，并可生成4种不同的环氧二十碳三烯酸（EETs）（5，6-EET、8，9-EET、11，12-EET、14，15-EET），而EETs在心肌疾病中具有重要的生理病理作用。因此有必要对诃子、甘草与制草乌及有效成分合用后对心脏CYP2J3的调控作用进行进一步研究。1 材料1.1　动物和细胞健康成年SD大鼠，SPF级，雄性，40只，鼠龄8~10周，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2021-0011。饲养于中国中医科学院中药研究所SPF级动物房，大鼠饲养条件：12 h明暗交替，温度（23±1） ℃，湿度（50±15）%，自主饮水及进食。动物实验相关操作通过中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会的批准，批准号2021B032。大鼠心肌细胞H9c2，购于中国医学科学院基础医学研究所，细胞复苏后传至3代用于后续实验。1.2　药物与试剂诃子为使君子科植物Terminalia chebula的干燥成熟果实，甘草为豆科植物G. uralensis的干燥根和根茎，草乌为毛茛科植物北乌头Aconitum Kusnezoffii的干燥块根。诃子与草乌购于安国市同利中药材有限公司，甘草购自北京同仁堂公主坟中医门诊部有限公司复兴路药店分公司，经中国中医科学院中药研究所叶祖光研究员鉴定，草乌购置后由内蒙古蒙药股份公司经与诃子汤炮制后使用。乌头碱（中国药品生物制品检定所，批号110720-200410，规格20 mg，纯度97%）；鞣花酸（北京百灵威科技有限公司，批号L941795，规格5 g，纯度98%），甘草苷（北京百灵威科技有限公司，批号L468830，规格10 mg，纯度97%）。细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（日本Dojindo公司，批号CK04-202107）；苏木素、伊红染液（安徽雷根生物技术有限公司，批号分别为0128A21、0226A21）；肌酸激酶（CK）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、Hoechst33342染料、甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠抗（北京碧云天生物科技有限公司，批号分别为20210603、20210714、040320200713、AF0006）；MitoTrackerTM Red CMXRos、CellROX® Green Reagents染料（美国Invitrogen公司，批号分别为2256813、2201587）；RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号U9225）；逆转录与实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time-PCR）试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司，批号分别为P20329、M51219）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo Scientific公司，批号VJ312549）；一抗CYP2J3兔抗鼠（美国Proteintech公司，批号00094025）；二抗辣根过氧化物酶标记的（HRP）山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G抗体（英国Abcam公司，批号ab205718）；其他试剂均为国产分析纯。1.3　仪器RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Bioprep-24型生物样品均质仪（杭州奥盛仪器有限公司）；Finesse 325型切片机、Varistain Gemini ES型全自动染色机、HERA cell 150i型细胞培养箱、NANODROP ONE型核酸浓度测定仪（美国Thermo公司）；KD-BM型石蜡包埋机（科迪仪器设备有限公司）；NIKON CI-S型倒置显微镜（日本尼康公司）；Microfuge 22R型台式高速离心机（美国Beckman公司）；CKX53型倒置显微镜（日本Olympus公司）；MK100-4A型微孔板恒温孵育器（上海珂淮仪器有限公司）；Cytation 5型细胞成像多功能检测系统（美国Bio Tek公司）；SpectraMax i3x型多标记酶标仪（美国Molecular Devices公司）；CFX96型Real-time PCR仪、Mini-PROTEAN Tetra型电泳仪与转膜仪（美国Bio-Rad公司）；AI600型多功能成像仪（美国GE公司）。2 方法2.1　动物分组及给药2.1.1　药液制备制草乌粉：诃子称重后加入8倍量水，浸泡8 h，煎煮1 h，随后4层纱布滤过，留取诃子汤备用。向诃子汤中加等量草乌浸泡24 h。24 h后取出草乌肉切成薄片晾干后打粉，过200目筛得制草乌粉；诃子粉、甘草粉的制备：分别取适量诃子、甘草粉碎后过200目筛得诃子粉；诃子-甘草-制草乌粉：取诃子粉、甘草粉与制草乌粉称重后按照诃子-甘草-制草乌1∶1∶1比例混匀。配伍组分中的给药剂量均以制草乌为基础进行计算［9］。生药含量为0.025 g·mL-1，灌胃时，药物用蒸馏水配制相应浓度，现配现用。2.1.2　分组与给药动物到达后适应性观察3 d，按体质量随机分为5组：空白组、制草乌组、诃子组、甘草组、诃子+甘草+制草乌合用组。其中制草乌根据《中华人民共和国药典》一部规定的临床剂量按体表面积换算为大鼠剂量。制草乌组、诃子组、甘草组剂量均为0.25 g·kg-1·d-1，诃子+甘草+制草乌合用组剂量为0.25 g·kg-1·d-1+ 0.25 g·kg-1·d-1+0.25 g·kg-1·d-1，每组8只，假手术组的大鼠灌胃蒸馏水，灌胃体积为每100 g大鼠给药1 mL，连续灌胃给药8 d。末次给药后大鼠禁食不禁水16 h。2.2　血清心肌酶活性检测大鼠麻醉后打开腹腔，使用采血管自下腔静脉采血，室温放置1~3 h，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min（离心半径6 cm），取血清200 μL，严格按试剂盒说明书测定血清CK、LDH变化。2.3　心脏组织切片苏木素-伊红（HE）染色及病理学观察取血完毕后，摘取心脏并纵切心脏，取其一部分转移至4%的多聚甲醛溶液中，固定24 h，进行脱水、包埋、制成4 μm的石蜡切片，行HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化并记录。2.4　细胞培养H9c2细胞生长于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和100 mg·L-1青-链霉素的DMEM培养基中，并于37 ℃、5% CO2的条件下培养，待细胞融合至70%~80%时，以1∶3传代，取对数生长期细胞进行实验，实验时将细胞分为空白组、乌头碱组（20 μmol·L-1）、鞣花酸组（20 μmol·L-1）、甘草苷组（20 μmol·L-1）和合用组（20 μmol·L-1）［10］。2.5　高内涵分析技术检测H9c2细胞荧光强度H9c2细胞以2×105个/孔接种于96孔黑色板壁透明底板，常规培养，待细胞融合至80%时，分别加入乌头碱（20 μmol·L-1）、鞣花酸组（20 μmol·L-1）、甘草苷组（20 μmol·L-1）和乌头碱+鞣花酸+甘草苷（20 μmol·L-1），48 h后弃去原培养基，并用PBS洗细胞。将Hoechst33342、CellROX® Green Reagents及MitoTrackerTM Red CMXRos染料加入细胞孔板内（100 μL/孔），并于37 ℃、5%CO2条件下继续孵育，45 min后弃染料混合液，PBS清洗，最后每孔加入PBS 100 μL进行检测。本实验采用Gen5软件采集并分析图像。选择20×物镜，采集条件：第一通道波长为350/461 nm，检测Hoechst33342标记的细胞核并记录细胞数目、细胞核内DNA含量；第二通道波长为579/599 nm，检测MMP；第三道波长为485/520 nm，检测CellROX® Green Reagents标记的ROS。并运用Gen5软件分析图像的荧光强度，其中细胞数目为第一通道的荧光数目，细胞核内DNA含量为第一通道的荧光强度，MMP为第三通道中细胞质的荧光强度，ROS为第二通道中细胞质与细胞核的荧光强度。2.6　Real-time PCR检测大鼠心脏组织CYP2J3 mRNA表达利用RNA提取试剂盒提取大鼠心脏与H9c2细胞总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA纯度（A260/A280为1.8~2.0）与浓度。随后将总RNA 1 μg逆转录后进行Real-time PCR检测，PCR反应条件为后首先94 ℃预变性30 s，循环时94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。以2-ΔΔCt表示各目标基因mRNA相对表达水平，特异性引物购自北京博迈德基因技术有限公司，序列见表1［11］。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列（5'~3'）长度/bpCYP2J3上游GTTGGGGAGAATGGGGAAGTT268下游TCCTGCACATCACAACTCACGAPDH上游GGCGGCATTAACTCTGTCCT292下游TCACAAACATGGGGGCATCA2.7　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠心脏组织CYP2J3蛋白表达利用RIPA法提取大鼠心脏与H9c2细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白质定量，随后于100 ℃、5 min条件下进行变性，蛋白50 μg经8%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜，室温下脱脂牛奶封闭1 h，分别孵育CYP2J3（1∶1 000），TBST洗膜3次，孵育二抗（1∶2 000），ECL发光，显影，最后采用Image J软件计算灰度值，以目标蛋白/GAPDH灰度值表示蛋白的相对表达水平。2.8　统计学方法采用SPSS 25.0统计软件对各组数据进行统计分析，数据以x¯±s的形式表示，采用单因素方差分析，P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠心脏代谢酶CYP2J3的影响3.1.1　对大鼠血清心肌酶活性的影响与空白组比较，制草乌组大鼠血清中CK、LDH均明显升高（P0.05，P0.01）；诃子组的LDH明显降低（P0.05）；甘草组的CK显著降低（P0.01）；合用组的CK、LDH无明显变化。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T002表2诃子、甘草与制草乌合用对大鼠血清心肌酶活性的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of Chebulae Fructus， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and prepared Aconiti Kusnezoffii Radix Cocta on serum myocardial enzyme activity in rats （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1·d-1CKLDH空白组1.311±0.3061 710.880±228.177制草乌组0.251.940±0.5482）1 934.247±192.2931）诃子组0.251.348±0.1321 472.155±101.3851）甘草组0.250.774±0.2322）1 637.006±125.003合用组0.25+0.25+0.251.008±0.2211 640.983±161.933注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01（表3-表7同）U·L-13.1.2　对大鼠心脏组织病理的影响空白组、诃子组与甘草组心肌纤维排列整齐，细胞着色均匀，间质未见炎症细胞浸润，组织形态结构正常；制草乌组可见局灶性或小片状心肌纤维均质红染，心肌细胞排列紊乱，横纹消失，心肌细胞变性；诃子、甘草与制草乌合用后与制草乌组比较心肌细胞变性程度减轻，变性范围减小，心肌细胞排列紊乱程度改善，其余未见异常变化，表明诃子和甘草减轻制草乌心脏损伤。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.F001图1诃子、甘草与制草乌合用对大鼠心脏组织病理学的影响 （HE，×200）Fig. 1Effect of Chebulae Fructus， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and prepared Aconiti Kusnezoffii Radix Cocta on cardiac histopathology in rats （HE， ×200）注：A.空白组；B.制草乌组；C.诃子组；D.甘草组；E.合用组（图2同）3.1.3　对大鼠心脏组织CYP2J3 mRNA表达的影响与空白组比较，制草乌可明显下调CYP2J3 mRNA表达（P0.05）；诃子组可显著上调CYP2J3 mRNA表达（P0.01）；合用组能显著上调CYP2J3 mRNA表达（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T003表3诃子、甘草与制草乌合用对 CYP2J3 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 3Effect of combination of Chebulae Fructus， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and prepared Aconiti Kusnezoffii Radix Cocta on CYP2J3 mRNA expression （x¯±s，n=8）组别剂量/ g·kg-1·d-1CYP2J3空白组1.00±0.09制草乌组0.250.79±0.021）诃子组0.251.84±0.102）甘草组0.251.14±0.09合用组0.25+0.25+0.251.42±0.072）3.1.4　对大鼠心脏组织CYP2J3蛋白表达的影响与空白组比较，制草乌下调CYP2J3蛋白表达水平，但差异无统计学意义；诃子组可显著上调CYP2J3蛋白表达（P0.01）；合用组可明显上调CYP2J3蛋白表达（P0.05）。见图2、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.F002图2诃子、甘草与制草乌合用对CYP2J3蛋白表达电泳Fig. 2Electrophoresis of combination of Chebulae Fructus， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and prepared Aconiti Kusnezoffii Radix Cocta on expression of CYP2J3 protein10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T004表4诃子、甘草与制草乌合用对CYP2J3蛋白表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 4Effect of combination of Chebulae Fructus， Glycyrrhizae Radix et Rhizoma and prepared Aconiti Kusnezoffii Radix Cocta on expression of CYP2J3 protein （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1·d-1CYP2J3/GAPDH空白组1.00±0.00制草乌组0.250.72±0.07诃子组0.251.73±0.422）甘草组0.251.22±0.12合用组0.25+0.25+0.251.56±0.521）3.2　对H9c2心肌细胞代谢酶CYP2J3的影响3.2.1　对H9c2细胞数目、DNA含量、ROS和MMP的影响与空白组比较，乌头碱组的细胞数量、DNA含量与MMP的荧光值显著降低（P0.01）；鞣花酸组的细胞数量、DNA含量与MMP的荧光值明显升高（P0.05）；合用组的细胞数量、DNA含量与MMP的荧光值也明显降低（P0.05，P0.01），但其相应荧光值均高于乌头碱组。见图3、表5。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.F003图3鞣花酸、甘草苷与乌头碱合用对H9c2细胞数目、DNA含量、ROS和MMP的影响（免疫荧光，×200）Fig. 3Effect of ellagic acid， liquiritin and aconitine on number， DNA content， ROS and MMP of H9c2 cells （IF，×200）注：A.空白组；B.乌头碱组；C.鞣花酸组；D.甘草苷组；C.合用组注（图4同）10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T005表5鞣花酸、甘草苷与乌头碱合用的高内涵分析结果 （x¯±s，n=9）Table 5High content analysis results of combination of ellagic acid， liquiritin and aconitine （x¯±s，n=9）组别浓度/μmol·L-1细胞数目DNA含量MMPROS空白组7 890.9±293.046 183±4 4957 127.5±594.8978.3±92.7乌头碱组202 081.3±197.52）27 575±3 1842）5 065.9±426.52）1 037.6±76.5鞣花酸组208 522.4±165.11）53 328±3 0721）8 042.4±241.91）1 230.6±60.9甘草苷组207 646.9±384.641 540±2 9017 994.7±482.11）881.2±30.7合用组204 099.7±121.72）38 761±2 6021）5 869.7±369.92）957.9±130.63.2.2　对H9c2心肌细胞CYP2J3 mRNA表达的影响与空白组比较，乌头碱可下调CYP2J3 mRNA表达（P0.05）；鞣花酸与甘草苷均可上调CYP2J3 mRNA表达（P0.01）；合用组可上调CYP2J3 mRNA表达（P0.05）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T006表6鞣花酸、甘草苷与乌头碱合用对CYP2J3 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of combination of ellagic acid， liquiritin and aconitine on CYP2J3 mRNA expression（x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1CYP2J3空白组1.00±0.08乌头碱组200.76±0.051）鞣花酸组201.45±0.122）甘草苷组201.57± 0.042）合用组201.18±0.101）3.2.3　对H9c2心肌细胞CYP2J3蛋白表达的影响与空白组比较，乌头碱可下调2J3蛋白表达，但差异无统计学意义；鞣花酸可显著上调2J3蛋白表达（P0.05）；甘草苷组与合用组可上调2J3蛋白表达，但未产生显著性影响。见图4、表7。10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.F004图4鞣花酸、甘草苷与乌头碱配伍对CYP2J3蛋白表达电泳Fig. 4Electrophoresis of combination of ellagic acid， liquiritin and aconitine on expression of CYP2J3 protein10.13422/j.cnki.syfjx.202202326.T007表7鞣花酸、甘草苷与乌头碱合用对细胞CYP2J3蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 7Effect of combination of ellagic acid， liquiritin and aconitine on expression of CYP2J3 protein （x¯±s，n=3）组别浓度/μmol·L-1CYP2J3/GAPDH空白组1.00±0.00乌头碱组200.81±0.08鞣花酸组201.59±0.301）甘草苷组201.22±0.15合用组201.38±0.544 讨论蒙族医药在我国内蒙古自治区被广泛应用，近些年随着蒙族医药事业的发展，蒙族药也逐渐应用于全国各地。与此同时，伴随着科学技术发展和人们对药物安全性问题认识的不断深化，研究者发现蒙族药在具有较好治疗效果的同时也会发生一些药物的不良反应［12］。蒙族药与中药相似，以草药为主。草乌，蒙族医学认为其味辛，性温、效轻，有大毒，草乌为蒙族医最常用的燥“协日乌苏”、杀“粘”的药材。临床应用十分广泛，如治疗肺心病、脑血管病、痛风、丹毒与肠刺痛等疾病。根据中华人民共和国药品标准（蒙药分册）记载［13］，在145个蒙药中含草乌成分的约占19.3%。同时现代医学研究发现，草乌具有镇痛、强心、抗炎、抗氧化、抗肿瘤及降血糖等药理作用［14-15］。蒙族医自古以来都强调草乌的毒性，特别是心脏损伤。药理学研究发现，草乌主要成份为总生物碱，其中作为毒效并存的经典成分，乌头碱（Aconitine）、次乌头碱（Hypaconitine）及新乌头碱（Mesaconitine）这类双酯型二萜类生物碱为草乌的主要毒性代表［16］。蒙族医用草乌大多搭配诃子以调和药性［17］。蒙族医认为草乌有大毒，而诃子味酸、苦，性平。具有祛邪、调和三根、解毒之功效，用诃子汤炮制药材，或与其合用，可以钝化一些药材的锐性，同时降低毒性药物的毒［18］。在蒙族医与中医理论中，甘草均有降低毒性与调和众药的作用［19-20］，因此临床治疗疾病过程中草乌多于诃子、甘草合用。现代研究发现，诃子与甘草降低草乌的毒性的机制主要有配伍后物质基础改变［21］、胃肠道吸收动力的改变与影响吸收、分布及排泄过程［22］等，然而相关作用机理尚未明确。CYP450是人体最重要的代谢酶，其中表氧化酶CYP2J2家族在心肌细胞、心脏内皮细胞、血管内皮细胞、肝脏和肠道中均有丰富的表达［23］。与其他CYP450酶一样CYP2J2（人源为CYP2J2，鼠源为CYP2J3）参与了多种内源物与外源物的代谢，其中主要包括AA［24］。CYP2J2可将AA代谢生成EETs，EETs具有促血管生成、抗心肌缺血、舒张血管等心血管保护作用。本课题组前期研究发现，含有乌头类生物碱成分的药物，例如附子和草乌可抑制CYP2J3的活性，导致EETs生成量减少，药效降低［11］。而其与诃子、甘草合用后，能否影响CYP2J3酶活性导致乌头类生物碱在体内代谢发生变化，对药物的疗效或毒性产生影响尚不得知。因此本研究针对制草乌代表成分乌头碱的毒性靶器官心脏，选择心脏CYP探讨诃子、甘草与草乌及有效成分合用后通过调控CYP2J的减毒机制。本实验拟先通过检测大鼠血液心肌酶、心脏组织病理学、CYP2J3 mRNA转录水平与蛋白翻译水平改变来探讨基于CYP2J3的诃子、甘草与制草乌三药合用减毒增效作用机制。血清LDH与CK是评判心肌损害程度的客观指标［25］，当该指标升高时，提示药物出现心脏损伤。本实验中，制草乌组大鼠血清中CK和LDH均明显升高，反映出制草乌组大鼠心脏受损，而诃子、甘草与制草乌合用后逆转血清过高水平的CK和LDH，表明诃子、甘草对制草乌具有减毒作用，联合大鼠心脏组织病理学观察明确了制草乌组大鼠发生心脏损伤，与诃子、甘草合用后损伤减轻。同时，制草乌可明显下调CYP2J3 mRNA表达，而合用组则能明显上调CYP2J3 mRNA表达。蛋白翻译水平与mRNA转录水平的结果相一致，推测调控CYP2J3的作用始于转录环节。与此同时，本实验选择了诃子、甘草与制草乌的代表成分鞣花酸、甘草苷与乌头碱，进一步探讨代表成分对CYP2J3的调控作用是否与诃子、甘草和草乌一致。高内涵分析结果显示，乌头碱在20 μmol·L-1下DNA含量、ROS和MMP产生明显差异，合用后DNA含量和MMP并无显著性改变。同时，乌头碱可显著下调H9c2细胞中CYP2J3 mRNA表达，而合用组则能显著上调CYP2J3 mRNA表达，且蛋白翻译水平与mRNA转录水平的结果相近。因此，本研究推测诃子、甘草与制草乌的减毒增效机制主要是鞣花酸、甘草苷和乌头碱合用后，上调了CYP2J3 mRNA转录及蛋白翻译水平，促进AA代谢生成EETs，使EETs含量增加，降低制草乌的心脏损伤的同时产生心脏保护作用。综上所述，本研究基于心脏CYP2J3角度来揭示诃子、甘草与制草乌合用的减毒机制，为蒙族医药临床使用的安全性与有效性提供实验数据，并为推动传统医药的现代化研究提供新思路。