糖尿病肾脏疾病（DKD）是一种由糖尿病（DM）引起的慢性肾脏病，其临床特点是持续性的尿白蛋白增加和/或肾小球滤过率（GFR）进行性下降［1］。DKD的发病率不断上升，已成为终末期肾病（ESRD）的主要原因，据统计，全球30%~50%的ESRD由DKD引起［2］。铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡方式，其特征是铁依赖性的脂质过氧化物蓄积［3］。相关研究表明，铁死亡涉及DM及其多种并发症［4］，在DM机体中也存在铁过载和氧化/抗氧化失衡等条件［5］，所以调控铁死亡可能是缓解和治疗DKD的有效手段［6］。补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》，临床中多用于气虚血瘀证的治疗，为益气活血法之代表方。临床研究证实此法可通过抗氧化减少DKD患者尿蛋白，改善患者临床症状［7］。本课题组也通过基础研究表明该法可抑制DKD大鼠的氧化应激，减少大鼠尿蛋白［8-10］，但具体分子机制有待进一步研究。既往研究发现，补阳还五汤可通过调控铁死亡减轻机体缺血性损伤［11］。在前期研究基础上，本实验通过建立DKD小鼠模型，进一步探讨补阳还五汤对DKD小鼠肾组织铁死亡的影响，明确其作用机制，为临床应用提供科学依据。1 材料1.1　动物SPF级雄性C57BL/6小鼠73只，6~8周龄，体质量（22±2） g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2019-0010，饲养于河北中医学院实验动物中心标准化动物房，普通饲料及高糖高脂饲料喂养，自由饮水。本实验由河北中医学院动物伦理委员会批准，批号DWLL202212008。1.2　药物与试剂补阳还五汤由黄芪30 g、炒桃仁15 g、红花15 g、地龙10 g、当归15 g、川芎15 g、赤芍15 g组成，药材为免煎颗粒剂型，由广东一方制药有限公司提供，批号分别为A1123823、1107303、1101533、1106103、A1060923、A1055163、1103413；罗格列酮片（成都恒瑞制药有限公司，4 mg/片，批号H20030569），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，批号S0130）；尿总蛋白（UTP）试剂盒（石家庄长江生物实验科技开发有限公司，批号220926）；丙二醛（MDA）试剂盒、微量还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20220923、20221227）；小鼠4-Hydroxynonenal（4-HNE）试剂盒（华美生物工程有限公司，批号Y170107362）；铁蛋白重链（FTH-1）、转铁蛋白受体1（TFR1）抗体（武汉BOSTER公司，批号分别为BM4487、PB9233）；苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）三色染液、高碘酸希夫（PAS）染色液、活性氧（ROS）染液、长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为CR2303063、CR2303120、CR2209068、MPC2305051、GB113871、GB115276、GB113091、GB15001、GB23303、GB23301）。1.3　仪器ONETOUCH型血糖仪（美国强生LifeScan公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；RT-6100型酶标仪（美国Rayto公司）；SVE-2型垂直电泳仪、SVT-2型转印电泳仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Nikon Eclipse E100型正置光学显微镜、Nikon Eclipse C1型正置荧光显微镜、Nikon DS-U3成像系统（日本尼康公司）；Semi-Day型半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；D3024R型台式高速冷冻离心机（北京大龙公司）。2 方法2.1　模型制备、分组与给药73只C57BL/6小鼠适应性喂养，1周后按随机数字表法分为正常组10只，造模组63只，正常组普通饲料喂养，造模组高糖高脂饲料（66.5%大小鼠维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+2.5%胆固醇+1%胆酸钠）喂养，6周后参照文献［12］建立2型糖尿病小鼠模型，造模组小鼠禁食不禁水12 h，将STZ以0.1 mmol·L-1浓度溶于柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）中，连续5 d以50 mg·kg-1对小鼠进行腹腔注射，在最后一次注射后的第7天以剪尾法取血，小鼠空腹血糖≥16.7 mmol·L-1则DM模型制备成功，造模组小鼠继续高糖高脂喂养，8周后检测小鼠尿蛋白，尿蛋白阳性则判定为DKD模型建立成功［13］，最终有51只小鼠制备成功，成模率约81%。后将小鼠按随机数字表法分为模型组、罗格列酮组、补阳还五汤低、中、高剂量组。按照小鼠用药剂量是70 kg成人临床用药剂量12.33倍的换算系数［14］，分别予罗格列酮水溶液（7.05×10-4 g·kg-1），补阳还五汤水溶液（3.21、6.41、12.82 g·kg-1）灌胃，正常组与模型组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续8周，期间每周监测小鼠体质量，根据体质量调整用药量。因在灌胃过程中死亡3只，最终纳入统计的小鼠分别为正常组10只，模型组10只，罗格列酮组9只，补阳还五汤低、中、高剂量组9、10、10只。2.2　标本采集药物干预8周后将小鼠置于代谢笼收集24 h尿液以待检测，小鼠禁食不禁水12 h后摘眼球取血以分离血清用于生化指标检测。快速解剖，取双肾，于冰上去除包膜及脂肪组织，经生理盐水冲洗，用滤纸吸干后称质量以计算肾重指数（KI）。取右肾沿纵轴切开，取肾皮质0.5 cm左右置于4%多聚甲醛中固定，取左肾皮质置于冻存管，放于液氮中速冻后转移至-80 ℃冰箱待检。2.3　小鼠一般指标检测分离血清检测小鼠空腹血糖（FBG）；计算KI［KI=肾重（mg）/体质量（g）×100%］；用磺基水杨酸法测定尿蛋白浓度［24 h尿总蛋白（24 h-UTP）=尿蛋白浓度×24 h尿总量］。2.4　HE染色、PAS染色及Masson染色观察小鼠肾组织病理学改变肾组织于4%多聚甲醛中固定48 h后进行石蜡包埋、4 μm切片，行HE、PAS及Masson染色，光学显微镜下放大400倍观察肾组织病理学变化。2.5　酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠肾组织4-HNE水平取小鼠肾组织匀浆上清液，采用ELISA检测4-HNE水平，操作步骤严格按照试剂盒标注的实验方法进行。2.6　荧光探针标记法检测小鼠肾组织ROS表达水平肾组织常规包埋，切片后滴加ROS染液，室温避光，浸入10 μmol·L-1二氢乙锭（DHE）溶液孵育30 min，滴加DAPI染液染核，3次磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，滴加抗荧光淬灭剂后封片，于荧光显微镜下观察红色荧光情况，其荧光强度可反映ROS的表达水平。2.7　MDA含量及GSH活性的测定取小鼠肾组织匀浆上清液，根据MDA、GSH试剂盒说明书，采用TBA法检测MDA含量，应用酶标仪于532 nm处测定MDA吸光度A；采用微量酶标法检测GSH活性，于405 nm处测定GSH活性。2.8　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠肾组织ACSL4、SLC7A11、GPX4、FTH-1、TFR-1蛋白表达按照试剂盒说明提取小鼠肾组织蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白溶液按4∶1的比例加入5×还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15 min，按照SDS-RAGE凝胶电泳说明书进行电泳，PVDF转膜90 min。脱脂牛奶室温封闭30 min，根据抗体说明书进行一抗FTH-1（1∶1 000）、TFR1（1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）、SLC7A11（1∶1 000）、GPX4（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）稀释，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗3次，二抗使用TBST按1∶5 000稀释并与膜接触，室温下孵育30 min，化学发光显影。使用Image J软件分析条带灰度值，用目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。2.9　统计学分析用Graphpad Prism 7.0软件对数据进行处理，并作统计学分析，计量资料以x¯±s表示，组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对小鼠一般情况的影响正常组小鼠反应灵敏，行动敏捷，毛发柔顺，日排尿量、饮水量均正常。模型组小鼠精神状态欠佳，体型瘦小，毛发偏枯黄，甚或呈束状，部分小鼠可见局部脱毛，反应迟缓，活动量减少，喜聚群，日排尿量、饮水量均明显增加。与模型组比较，各治疗组小鼠以上症状均有不同程度减轻。3.2　对小鼠KI、FBG、24 h-UTP水平的影响与正常组比较，模型组小鼠KI、FBG、24 h-UTP显著升高，差异具有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，罗格列酮组及补阳还五汤中、高剂量组小鼠KI、24 h-UTP水平均明显降低，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01），罗格列酮组小鼠FBG水平明显降低（P0.05），补阳还五汤低、中、高剂量组小鼠FBG均有下降趋势，但差异无统计学意义。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.T001表1补阳还五汤对小鼠KI、FBG、24 h-UTP的影响 （x¯±s）Table 1Effect of Buyang Huanwutang on KI， FBG， and 24 h-UTP in mice （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1KI/g·kg-1FBG/mmol·L-124 h-UTP/mg正常组1016.77±0.486.47±0.512.29±0.60模型组1023.35±0.791）24.45±2.811）8.90±1.111）罗格列酮组97.05×10-420.03±0.813）20.92±2.152）7.18±0.563）补阳还五汤低剂量组93.2121.45±3.3123.09±2.418.49±0.93补阳还五汤中剂量组106.4120.92±2.422）22.59±2.377.84±0.632）补阳还五汤高剂量组1012.8219.71±0.493）22.43±2.057.08±0.623）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01（表2-表4同）3.3　对小鼠肾组织病理学的影响与正常组比较，HE染色显示模型组小鼠肾小球内系膜增生，系膜外基质增加；Masson染色显示模型组小鼠肾组织中肾小管基底部胶原纤维增生，肾小管萎缩；PAS染色显示模型组小鼠肾小球内大量系膜增生，肾小管基底膜增厚，间质增宽，肾小管上皮细胞内糖原颗粒样物质沉积。与模型组比较，各干预组小鼠肾组织病理均有不同程度改善。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.F001图1补阳还五汤对小鼠肾组织病理学的影响 （×400）Fig. 1Effect of Buyang Huanwutang on renal histopathology in mice （×400）注：A.正常组；B.模型组；C.罗格列酮组；D.补阳还五汤低剂量组；E.补阳还五汤中剂量组；F.补阳还五汤高剂量组（图2-图4同）3.4　对小鼠肾组织FTH-1、TFR-1蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组FTH-1蛋白表达显著降低（P0.01）、TFR-1表达显著增加（P0.01），与模型组比较，罗格列酮组、补阳还五汤中、高剂量组FTH-1蛋白表达显著升高（P0.01），TFR-1表达明显减少（P0.05，P0.01）。见表2、图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.T002表2补阳还五汤对小鼠肾组织FTH-1、TFR-1蛋白表达水平的影响 （x¯±s）Table 2Effect of Buyang Huanwutang on expression levels of FTH-1 and TFR-1 proteins in mouse kidney tissue （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1FTH-1/β-actinTFR-1/β-actin正常组102.41±0.020.23±0.03模型组100.85±0.021）0.64±0.051）罗格列酮组97.05×10-42.02±0.173）0.35±0.033）补阳还五汤低剂量组93.210.86±0.020.62±0.05补阳还五汤中剂量组106.411.28±0.013）0.52±0.042）补阳还五汤高剂量组1012.821.58±0.163）0.43±0.033）10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.F002图2小鼠肾组织FTH-1、TFR-1蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of expression levels of FTH-1 and TFR-1 proteins in mouse kidney tissue3.5　对小鼠肾组织ROS表达水平的影响与正常组比较，模型组小鼠肾组织中的红色荧光表达显著增多，说明ROS表达明显增多；与模型组比较，各治疗组红色荧光表达均有减少，其中罗格列酮组和补阳还五汤高剂量组明显减少。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.F003图3补阳还五汤对小鼠肾组织ROS表达水平的影响 （DHE，×400）Fig.3Effect of Buyang Huanwutang on ROS expression level in mouse kidney tissue （DHE，×400）3.6　对小鼠肾组织MDA、GSH、4-HNE含量的影响与正常组比较，模型组MDA、4-HNE含量显著升高，GSH活性显著降低，差异具有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，罗格列酮组、补阳还五汤中、高剂量组MDA含量明显降低（P0.05，P0.01），罗格列酮组和补阳还五汤高剂量组GSH活性升高、4-HNE含量明显降低，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.T003表3补阳还五汤对小鼠肾组织MDA、GSH、4-HNE含量的影响 （x¯±s）Table 3Effect of Buyang Huanwutang on content of MDA， GSH， 4-HNE in kidney tissue of mice （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1MDA/μmol·g-1GSH/μmol·g-14-HNE/nmol·L-1正常组100.45±0.1126.47±0.7768.67±12.88模型组101.29±0.111）13.29±1.831）176.89±24.861）罗格列酮组97.05×10-40.85±0.093）20.94±1.263）107.35±22.343）补阳还五汤低剂量组93.211.04±0.1014.46±2.42164.22±25.47补阳还五汤中剂量组106.410.98±0.142）17.03±2.55142.92±24.72补阳还五汤高剂量组1012.820.87±0.093）18.97±2.342）122.50±22.022）3.7　对小鼠ACSL4、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组小鼠肾组织中ACSL4蛋白表达显著升高，SLC7A11、GPX4显著降低（P0.01）；与模型组比较，罗格列酮组和补阳还五汤高剂量组ACSL4蛋白表达明显降低（P0.05），罗格列酮组和补阳还五汤各剂量组SLC7A11蛋白表达明显增加（P0.05，P0.01），罗格列酮组和补阳还五汤各剂量组GPX4蛋白表达显著增加（P0.01）。见表4、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.T004表4补阳还五汤对小鼠ACSL4、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平的影响 （x¯±s）Table 4Effect of Buyang Huanwutang on expression levels of ACSL4， SLC7A11， and GPX4 proteins in mice （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1ACSL4/β-actinSLC7A11/β-actinGPX4/β-actin正常组100.11±0.032.48±0.222.21±0.49模型组100.94±0.051）0.82±0.081）0.17±0.061）罗格列酮组97.05×10-40.34±0.062）1.59±0.063）1.36±0.303）补阳还五汤低剂量组93.210.78±0.051.07±0.112）0.48±0.143）补阳还五汤中剂量组106.410.58±0.061.38±0.093）1.03±0.253）补阳还五汤高剂量组1012.820.42±0.012）1.96±0.083）1.72±0.443）10.13422/j.cnki.syfjx.20230839.F004图4小鼠ACSL4、SLC7A11、GPX4蛋白表达电泳Fig.4Electrophoresis of expression levels of ACSL4， SLC7A11， and GPX4 proteins in mice4 讨论DKD是DM的主要并发症之一，随着DM的发病率不断升高，DKD的发病率也在不断增加，该病发展迅速，已成为ESRD的主要原因。在临床中，多采用控制血糖、血脂、血压等基础治疗，以及二甲双胍等药物治疗，但肾脏出现肾损伤的风险依旧很高［15］。近年来，中医药在减轻DKD患者临床症状、保护肾功能方面逐渐凸显优势。中医学认为，DKD当属“肾消”“水肿”等范畴。患者阴津亏损，燥热偏盛，后久病及肾，肾体受损，肾气亏虚，则为肾消。气虚无力运血，加之阴虚血行不畅而为瘀血，所以DKD的关键病机为气虚血瘀［16］。基于此，本病治法应为益气活血，化瘀通络。正如《医学衷中参西录》所言：“爰立补阳还五汤，方中重用黄芪四两，以峻补气分，此即东垣主气之说也。然王氏书中全未言脉象何如，若遇脉之虚而无力者，用其方原可见效”，正是阐明了补阳还五汤“不在逐瘀以活血，重在补气以活血”的用药特点。在临床中导师常以补阳还五汤为基础方进行辨证论治，方中黄芪大补元气，气旺则血行，瘀去则络通，又可利尿消肿，缓解患者水湿内停之证，改善肢体浮肿；当归活血通络而不伤血；赤芍、川芎、桃仁、红花合用使活血祛瘀之效大增；地龙是治疗瘀血之证常用的虫类药，可剔络除瘀，直达病所。诸药合用，补气则气旺血行，活血则瘀消络通。在本研究中，模型组小鼠KI、FBG、24 h-UTP明显升高，光镜下可见肾小球内系膜增生，基底膜增厚，肾小管上皮细胞内糖原颗粒沉积，结合小鼠一般情况，均符合DKD模型的评估标准，说明造模成功。经补阳还五汤干预后，小鼠蛋白尿水平明显下降，其功效与罗格列酮相似，并减轻了小鼠肾组织病理损伤，说明补阳还五汤对DKD小鼠具有肾脏保护作用。与模型组比较，补阳还五汤各剂量组FBG变化较小，说明补阳还五汤可能不是通过控制血糖对小鼠肾脏发挥保护作用的。铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡方式，铁含量是铁死亡发生的重要条件。在机体铁环境的动态平衡过程中，FTH-1发挥重要的铁储存功能，TFR-1则发挥铁离子的转运作用［16］。当FTH-1表达减少，TFR-1表达上调，就会使细胞内Fe2+含量上升，以致铁环境失衡引起芬顿反应，催化ROS和大量羟基自由基（OH-）的产生，引起细胞膜改变而诱发铁死亡［17］。本研究中，FTH-1表达减少、TFR-1表达升高提示模型组小鼠肾组织中出现明显的铁过载，经罗格列酮及补阳还五汤干预后，FTH-1表达上调，TFR-1下调，说明该干预措施可有效缓解DKD小鼠肾组织中的铁负荷。氧化应激是DKD发生发展的关键因素之一，高糖环境下ROS大量增多，GSH等抗氧化剂耗竭，就会造成抗氧化能力减弱［18］，同时ROS的不断蓄积也是铁死亡发生的中心环节，在本实验中，模型组小鼠肾组织ROS表达增加，GSH下调，说明DKD小鼠出现明显的氧化损伤，与模型组比较，罗格列酮和补阳还五汤明显减少了ROS的表达，提高GSH活性，提示罗格列酮和补阳还五汤可有效减轻DKD小鼠的氧化应激损伤。脂质过氧化属于生物体氧化还原系统的失衡，在铁死亡发生过程中起到主要的驱动作用，可通过破坏细胞膜磷脂双分子层结构，及其产物如MDA和4-HNE的细胞增殖抑制作用诱发铁死亡［19］。ACSL4将长链多不饱和脂肪酸催化合成相应的多不饱和脂酰辅酶A（PUFA-CoA），用于合成磷脂和甘油三酯等物质，是调节脂质过氧化底物产生的酶。ACSL4可加重外周胰岛素抵抗，并产生大量脂质过氧化物［20］，噻唑烷二酮类（TZD）降糖药罗格列酮属于胰岛素增敏剂，可通过增加外周组织对胰岛素的敏感性来改善胰岛素抵抗。此外，已有相关研究证实，罗格列酮可作为ACSL4的抑制剂，可通过抑制铁死亡减轻DKD小鼠的肾脏病理损害［21］，故实验选择罗格列酮作为阳性药物。在本研究中，模型组小鼠肾组织中MDA、4-HNE显著增加，ACSL4蛋白表达上调，说明DKD小鼠肾组织出现明显的脂质过氧化物蓄积，经干预后，上述指标的表达均有下调，提示罗格列酮和补阳还五汤可减轻DKD小鼠的脂质过氧化反应，其中罗格列酮可通过调控ACSL4抑制铁死亡，差异更明显，也与既往研究一致［21］。胱氨酸/谷氨酸逆向转运体（xCT）是磷脂双分子层中的逆向转运蛋白，以1∶1的比例实现对胱氨酸和谷氨酸的转运，摄入的胱氨酸会参与GSH的合成，来维持细胞内GSH含量，抑制细胞氧化应激损伤。其中xCT的亚基SLC7A11对转运具有高度特异性。GPX4是一种抗氧化酶，其通过抑制脂质过氧化，清除脂质过氧化物来维持细胞内氧化还原稳态［22］，其下调通常被认为是铁死亡发生的关键。在本研究中，模型组小鼠SLC7A11、GPX4的表达明显降低，从而引起细胞内发生氧化应激，导致铁死亡。Western blot检测结果显示，补阳还五汤上调了DKD小鼠肾组织中SLC7A11、GPX4的表达，与罗格列酮作用一致，说明补阳还五汤可通过激活SLC7A11、GPX4来减少铁死亡造成的肾脏损伤，对DKD小鼠起到肾保护作用。本研究结果显示，补阳还五汤可减轻DKD小鼠肾组织中的铁负荷，提高GSH活性、减少ROS表达，缓解氧化应激，降低MDA、4-HNE、ACSL4水平，上调SLC7A11、GPX4蛋白表达，这提示补阳还五汤可减轻DKD小鼠肾组织病理损伤，其机制与调节铁死亡相关因子，调控铁死亡有关。然而本研究未对足细胞进行离体实验，以进一步探索铁死亡与足细胞损伤之间的具体联系，这些局限性有待于进一步研究，以明确其作用机制。