动脉粥样硬化（AS）是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因，可由大中动脉内膜脂质过度沉积所引发。近期研究表明，为了调控脂质代谢异常，机体可形成一种特定类型的自噬进程——脂自噬，通过溶酶体酸性脂肪酶选择性降解储存在脂滴中的细胞内胆固醇和甘油三酯（TG），从而维持脂质平衡［1］。脂自噬水平的降低可诱导由机体脂质过度沉积介导的血管壁内炎症介质的浸润及氧化应激损伤，加速AS斑块的形成［2］。无翅型MMTV整合位点家族成员5a（Wnt5a）/C1型尼曼-匹克蛋白（NPC1）通路对机体脂自噬水平起了关键的调控作用，Wnt5a是一种与脂质代谢密切相关的蛋白质，在AS患者的粥样病变区域内其表达量与AS的进展呈正相关［3］。NPC1是位于溶酶体限界膜上的一种胆固醇转运载体蛋白，可与Wnt5a结合，对机体脂自噬水平起了重要的调控作用［4］。因此，通过调控Wnt5a/NPC1通路调节机体脂自噬水平有望成为AS治疗的新靶点。小檗碱（BBR）又称黄连素，是一种常见的异喹啉生物碱，存在于黄连、黄柏、三颗针等小檗科10个属的植物中，具有显著的抗菌、降血脂、降血糖、调节肠道菌群失调等药理学作用［5］。最新研究证实BBR可通过抗炎、抗氧化应激、减轻血管内皮细胞损伤、纠正脂质代谢紊乱等途径抑制AS进展［6］；BBR还可通过抑制心肌梗死后小鼠心肌中巨噬细胞Wnt5a表达发挥心脏保护作用［7］。但BBR是否可靶向Wnt5a/NPC1通路调节机体脂自噬防治AS，目前尚未阐明。本研究建立AS小鼠模型，观察BBR对AS病变、炎症因子、氧化应激及脂自噬标记物的干预作用并探讨其分子机制，以期为BBR防治AS的临床应用提供更多实验依据。1 材料1.1　动物8周龄SPF级雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠50只及相同周龄及基因背景的C57BL/6J小鼠10只，体质量18~22 g，购自北京大学医学部实验动物中心，合格证号SCXK（京）2021-0012。所有小鼠饲养在温度20~24 ℃、湿度为45%~55%、光照与黑暗各12 h周期循环的环境。高脂饲料（加21%脂肪、1.25%胆固醇）及普通饲料由江西中医药大学实验动物中心配制。动物实验由江西中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准编号20220614003。1.2　药物与试剂BBR（美国Sigma公司，批号2086-83-1）；阿托伐他汀钙片（山东齐鲁制药有限公司，批号KC2H2298）；总胆固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（北京中生北控生物科技公司，批号分别为R2873、A1913、U3572、T1316）；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（美国eBioscience公司，批号分别为80020347、88748247、69045252、80216803）；超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为1013M、2086R）；Wnt5a、NPC1、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国CST公司，批号分别为24721、31258、16842）；羧甲基纤维素钠（国药集团药业股份有限公司，批号73953T）；苏木素-伊红（HE）染色液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号BSBA-4028）。1.3　仪器RM2235型切片机（德国Leica公司）；7600型自动生化分析仪（日本Hitachi公司）；STM7型光学显微镜（日本Olympus公司）；PowerPac 3000型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；ST8R型离心机（美国Thermo公司）。2 方法2.1　分组及干预ApoE-/-小鼠50只采用高脂饲料喂养并随机分为5组：AS模型组、阿托伐他汀组（用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解阿托伐他汀钙片并用生理盐水稀释成5 mg·kg-1·d-1灌胃）、BBR低、中、高剂量组（用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解BBR并用生理盐水稀释成所需浓度，分别采用BBR 2.5、5、10 mg·kg-1·d-1灌胃［8］），另设10只C57BL/6J小鼠采用普通饲料喂养作为空白组。AS模型组和空白组小鼠灌胃等体积生理盐水，各组小鼠连续给药12周。2.2　HE染色及油红O染色检测小鼠主动脉AS斑块病变12周后，随机抽取AS模型组小鼠1只，戊巴比妥钠150 mg·kg-1腹腔注射对小鼠实施麻醉，观察颈总动脉分叉处，镜下见到内膜增生和/或显著的脂质斑块突起作为AS模型建立成功的标志［9］。分离主动脉，用4%多聚甲醛固定，分级乙醇脱水，石蜡包埋后用切片机将主动脉切成5 μm的连续切片，复水后用HE染色，光学显微镜下计算主动脉AS病变（AS斑块面积/主动脉管腔面积×100%）。此外，为了进一步检测AS病变，清除心脏至髂分叉主动脉外周组织，纵向切开，平钉，用油红O染色，异丙醇染色后，光学显微镜下拍照，应用Image J软件定量分析主动脉AS病变区域。2.3　生化法检测小鼠血清脂质水平腹主动脉采血，在离心管中室温静置2 h，以3 000 r·min-1离心10 min（离心半径4 cm），取上清，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平。2.4　ELISA检测小鼠血清炎症因子及黄嘌呤氧化酶法检测氧化应激标记物水平采用ELISA检测小鼠血清IL-6、TNF-α水平及ROS含量；采用黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活力，具体步骤按照试剂盒说明书进行。2.5　ELISA检测小鼠血清脂自噬标记物测定检测小鼠血清脂自噬标记物Beclin1、LC3Ⅱ水平，具体步骤按照试剂盒说明书进行。2.6　免疫组化检测小鼠主动脉Wnt5a、NPC1分布取5 μm主动脉组织切片脱蜡脱水后，用甲醇中H2O2孵育封闭。抗原修复后，加Wnt5a、NPC1一抗（1∶200）在4 ℃下孵育过夜，再加二抗（1∶1 000）检测。在显微镜下拍摄图像，使用Image J软件进行分布分析。2.7　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测小鼠主动脉Wnt5a、NPC1蛋白表达小鼠主动脉加裂解缓冲液分离蛋白，经BCA蛋白定量后将20 mg蛋白和Marker上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳将蛋白转运到PVDF膜。加Wnt5a、NPC1抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。加二抗（1∶2 000）在37 ℃下孵育1 h，加ECL发光液，用β-actin作为内参蛋白。采用Quantity One软件进行灰度值分析，以条带灰度值计算蛋白表达。2.8　统计学分析采用SPSS 20.0软件分析数据，数据以x¯±s表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐时用最小显著性差异法（LSD）比较组间多重数据，方差不齐时用Dunnett's T3法比较组间多重数据，P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对AS小鼠主动脉斑块病变的影响空白组小鼠主动脉内膜光滑，未见AS斑块形成；与空白组比较，AS模型组小鼠主动脉AS斑块面积显著增加（P0.01）；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠AS斑块面积均明显降低（P0.05，P0.01）。见图1和图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.F001图1BBR对AS小鼠主动脉斑块面积的影响 （HE，×40）Fig.1Effect of BBR on Aortic plaque area in AS mice （HE，×40）注：A.空白组；B.AS模型组；C.阿托伐他汀组；D.BBR低剂量组；E.BBR中剂量组；F.BBR高剂量组（图2-图5同）10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.F002图2BBR对AS小鼠主动脉斑块形成的影响Fig.2Effect of BBR on aortic plaque formation in AS mice3.2　对AS小鼠血清脂质的影响与空白组比较，AS模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低（P0.01）；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低，HDL-C明显升高（P0.05，P0.01）；与阿托伐他汀组比较，BBR低、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C均明显升高，HDL-C明显降低（P0.05，P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.T001表1BBR对AS小鼠血清脂质水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of BBR on serum lipid levels in AS mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL-C/μmol·L-1HDL-C/μmol·L-1空白组29.52±5.4318.65±3.44109.23±10.4279.31±7.73AS模型组48.52±6.561）31.43±4.781）146.46±13.751）52.05±6.541）阿托伐他汀组534.71±4.923）22.51±3.833）118.57±11.523）71.53±8.763）BBR低剂量组2.545.41±6.355）30.17±4.725）140.22±12.835）55.21±7.645）BBR中剂量组536.15±4.843）24.01±3.923）122.74±9.693）68.37±7.783）BBR高剂量组1040.78±5.892，4）27.35±3.632，4）129.32±10.632，4）61.95±6.612，4）注：与空白组比较1）P0.01；与AS模型组比较2）P0.05，3）P0.01；与阿托伐他汀组比较4）P0.05，5）P0.01（表2-表4同）3.3　对AS小鼠血清炎症因子及氧化应激标记物的影响与空白组比较，AS模型组小鼠血清炎症因子IL-6、TNF-α及ROS显著升高，SOD显著降低（P0.01）；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠血清IL-6、TNF-α、ROS明显降低，SOD明显升高（P0.05，P0.01）；与阿托伐他汀组比较，BBR低、高剂量组小鼠血清IL-6、TNF-α、ROS明显升高，SOD明显降低（P0.05，P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.T002表2BBR对AS小鼠血清IL-6、TNF-α、ROS、SOD水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of BBR on serum levels of IL-6， TNF-α， ROS and SOD in AS mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1IL-6/mg·L-1TNF-α/mg·L-1ROS/U·mL-1SOD/U·mL-1空白组156.23±13.26114.05±12.3654.48±5.2367.43±5.03AS模型组247.16±17.371）198.25±17.821）107.64±9.361）43.17±3.481）阿托伐他汀组5175.48±15.283）134.38±14.073）68.25±7.213）60.25±4.133）BBR低剂量组2.5239.11±16.395）191.06±15.235）102.23±8.375）45.23±3.835）BBR中剂量组5181.54±14.493）141.16±16.273）65.42±7.443）61.73±3.863）BBR高剂量组10199.83±15.632，4）169.07±14.322，4）81.23±8.052，4）51.36±4.172，4）3.4　对AS小鼠血清脂自噬标记物的影响与空白组比较，AS模型组小鼠血清Beclin1、LC3Ⅱ显著降低（P0.01）；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠血清Beclin1、LC3Ⅱ明显升高（P0.05，P0.01）；与阿托伐他汀组比较，BBR低、高剂量组小鼠血清Beclin1、LC3Ⅱ明显降低（P0.05，P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.T003表3BBR对AS小鼠血清Beclin1、LC3Ⅱ水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of BBR on serum Beclin1 and LC3Ⅱ levels in AS mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1Beclin1/μg·L-1LC3Ⅱ/ng·L-1空白组7.61±0.461 636.47±124.74AS模型组4.76±0.371）1 125.03±95.471）阿托伐他汀组57.25±0.423）1 562.35±113.633）BBR低剂量组2.54.91±0.325）1 154.26±102.395）BBR中剂量组57.29±0.443）1 547.69±107.263）BBR高剂量组106.45±0.332，4）1 428.04±99.052，4）3.5　对AS小鼠主动脉Wnt5a、NPC1分布的影响与空白组比较，AS模型组小鼠主动脉Wnt5a分布显著升高，NPC1分布显著减少；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠主动脉Wnt5a分布明显降低，NPC1分布明显增多；与阿托伐他汀组比较，BBR低、高剂量组小鼠主动脉Wnt5a分布明显升高，NPC1分布明显减少。见图3和图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.F003图3BBR对AS小鼠主动脉Wnt5a分布的影响 （免疫组化，×200）Fig.3Effect of BBR on distribution of Wnt5a in aorta of AS mice （IHC， ×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.F004图4BBR对AS小鼠主动脉NPC1分布的影响 （免疫组化，×200）Fig.4Effect of BBR on distribution of NPC1 in aorta of AS mice （IHC， ×200）3.6　对AS小鼠主动脉Wnt5a、NPC1蛋白表达的影响与空白组比较，AS模型组小鼠主动脉Wnt5a蛋白表达升高，NPC1蛋白表达降低（P0.01）；与AS模型组比较，阿托伐他汀组、BBR中、高剂量组小鼠主动脉Wnt5a蛋白表达降低，NPC1蛋白表达升高（P0.05，P0.01）；与阿托伐他汀组比较，BBR低、高剂量组小鼠主动脉Wnt5a蛋白表达升高，NPC1蛋白表达降低（P0.05，P0.01）。见图5、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.F005图5AS小鼠主动脉Wnt5a、NPC1蛋白表达电泳Fig.5Electrophoresis of protein expression of Wnt5a and NPC1 in aorta of AS mice10.13422/j.cnki.syfjx.20230936.T004表4BBR对AS小鼠主动脉Wnt5a、NPC1蛋白表达的影响 （x¯±s，n=10）Table 4Effect of BBR on protein expression of Wnt5a and NPC1 in aorta of AS mice （x¯±s，n=10）组别剂量/mg·kg-1Wnt5a/β-actinNPC1/β-actin空白组0.26±0.040.94±0.04AS模型组0.91±0.031）0.15±0.031）阿托伐他汀组50.58±0.043）0.84±0.053）BBR低剂量组2.50.87±0.055）0.19±0.035）BBR中剂量组50.53±0.043）0.79±0.043）BBR高剂量组100.69±0.032，4）0.35±0.052，4）4 讨论机体脂质代谢紊乱与AS形成密切相关，浸润的单核细胞分化为巨噬细胞后，可吞噬大量的修饰脂质和低密度脂蛋白。随着时间的推移，过度积累的脂质和脂蛋白以脂滴的形式储存在这些巨噬细胞中形成泡沫细胞，促进了AS的发展。自噬是一种细胞内降解系统，可使用细胞内溶酶体分解受损的细胞器或受损的蛋白质，各种形式的选择性自噬在机体不同微环境中可起特定的生理作用［10］。脂滴主要存在于脂肪细胞中，是储存TG的动态细胞器，对维持机体脂质代谢平衡至关重要。脂自噬是靶向脂滴选择性自噬的一种形成，也是维持脂滴稳态的关键机制。被吞噬的富含TG的脂滴在线粒体中可通过β-氧化降解为自由脂肪酸，生成三磷酸腺苷（ATP）；同时，富含胆固醇酯的脂滴在ATP-结合盒转运体A1（ABCA1）的介导下，通过脂自噬水解为游离胆固醇外排［11-12］。因此，脂自噬在调节巨噬细胞内脂质积累和胆固醇外排方面发挥了重要作用，脂自噬功能的下降会导致组织脂质堆积过多，促进AS形成。脂质合成、储存和降解是一类高度调控过程，脂质代谢紊乱与炎症和氧化应激密切相关。IL-6与TNF-α是机体重要的炎症因子，均可由脂肪组织分泌释放，当机体IL-6与TNF-α高表达时可刺激血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖和迁移从而促进AS形成［13］。当脂质代谢功能的下降时，作为生物活性氧化脂素衍生物的前体，脂肪酸可通过调节细胞膜流动性影响不同免疫细胞亚群如T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等的炎症活性，并直接激活膜相关模式识别受体，如Toll样受体（TLR）及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）诱导炎症因子IL-6、TNF-α释放并加速AS形成［14］。此外，AS的形成、发展与氧化应激的关系十分密切，正常机体的细胞内具有抗氧化物质如SOD可清除ROS维持细胞氧化还原稳态。当某些因素使ROS的产生大于清除速度时，出现ROS蓄积可氧化修饰低密度脂蛋白损伤血管内皮，并诱发单核细胞趋化蛋白-1、血管细胞黏附分子、巨噬细胞集落刺激因子表达上调，吞噬大量的氧化低密度脂蛋白形为泡沫细胞从而促进AS形成［15］。脂质代谢功能的下降可诱导机体氧化和抗氧化能力失衡，SOD活性下降，ROS含量增高，导致血管内皮下间隙的脂质和脂蛋白被氧化形成低密度脂蛋白，并影响血管壁正常结构及功能而加快AS发展［16］。本研究结果显示，与AS模型组比较，BBR中、高剂量小鼠AS斑块面积显著减少，血清TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α、ROS、主动脉Wnt5a分布及蛋白表达均显著降低，血清HDL-C、SOD均显著升高，提示BBR可调节脂质代谢，减轻炎症反应及氧化应激损伤而抑制ApoE-/-小鼠AS进展。Beclin1基因是第一个确认的哺乳动物自噬基因，也是第一个确认在自噬的溶酶体降解途径中起抑制AS作用的基因，Beclin1基因缺陷可导致AS的发生［17］。LC3Ⅱ是一种可靠的自噬标志物，固定在自噬体的膜上，是唯一在自噬过程中特异性定位于自噬结构的特征良好的蛋白质。LC3Ⅱ与自噬小体及自噬溶酶体的数量呈正相关，因此可被广泛应用于定量细胞自噬的活性［18］。在脂自噬中，脂滴膜蛋白被LC3Ⅱ识别并隔离，与从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，然后这些自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体，降解其所包裹的脂滴内容物，以分解代谢脂质和蛋白质［19］。LC3Ⅱ还可直接识别脂滴，与磷脂和脂肪TG脂肪酶结合，促进脂滴降解。Wnt5a是与脂质代谢紧密相关的蛋白质，其表达增高可通过调控机体胆固醇跨膜转运相关蛋白如ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）加快巨噬细胞的泡沫化，并招募AS病灶区域内的单核细胞促进AS形成［3］。NPC1是位于溶酶体限界膜上的一种胆固醇转运载体蛋白，其表达增高后可与Wnt5a结合，Wnt5a/NPC1通路通过溶酶体酸性脂肪酶选择性降解储存在脂滴中的细胞内胆固醇及TG，从而对机体脂自噬发挥关键的调控作用［4］。本研究结果显示，AS模型组小鼠可见显著的AS病灶，血清TC、TG、LDL-C升高，血清IL-6、TNF-α水平、ROS含量升高且SOD活性下降，血清Beclin1、LC3Ⅱ显著降低，主动脉Wnt5a分布及蛋白表达显著升高，NPC1分布及蛋白表达显著降低，说明脂自噬水平的降低可诱导炎症介质的释放及氧化应激损伤而加速AS斑块形成，其机制与靶向Wnt5a/NPC1通路后活化Wnt5a并抑制NPC1有关。与AS模型组比较，BBR中剂量组及BBR高剂量小鼠主动脉Wnt5a分布及蛋白表达显著降低，血清Beclin1、LC3Ⅱ水平及主动脉NPC1分布及蛋白表达显著升高，证实BBR可能通过竞争性结合Wnt5a激活NPC1表达，上调脂自噬水平降低血脂，抑制炎症介质IL-6、TNF-α的释放减轻血管平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，并通过增加SOD活性以清除机体ROS抑制氧化应激，减轻内皮损伤及单核细胞聚集从而抑制AS的进展；此外，BBR竞争性结合Wnt5a后可能通过调控机体胆固醇跨膜转运相关蛋白减少巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的吞噬作用抑制泡沫细胞形成，从而发挥防治AS的功效。本研究发现可为中药有效提取物治疗心血管疾病的应用提供一定的理论依据，但脂自噬的调控机制十分复杂，本研究中的血脂及炎症标记物的改变如何影响Wnt5a/NPC1通路，以及BBR调节脂自噬的分子机制尚需进一步研究以明确。