糖尿病是一种以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不断减少为特征的代谢紊乱性疾病，人口老龄化、肥胖症、不良饮食习惯、久坐不动的生活方式等使得其在全世界范围内流行，预计到2045年全球将有6.93亿糖尿病患者［1］。糖尿病性骨质疏松症（DOP）是由糖尿病诱发，严重影响患者健康和生活质量的全身代谢性骨疾病。在糖尿病患者中，糖尿病病程越长，骨质疏松症的发生率越高，可高达50%~60%［2］。DOP的主要病理特征是单位体积骨量减少，骨组织微观结构改变，骨强度降低，脆性增加和骨折风险增加，临床多表现为疼痛、相应部位功能活动障碍、畸形、甚至骨折［3-4］。目前，DOP的临床治疗方法是降糖辅以维生素D3、二膦酸盐、降钙素、钙等化学药物抑制骨吸收、促进骨形成、改善骨矿化为基础［5］，鲜少有一种药物能够在降糖的同时有效改善骨的症状，患者只能通过单一降糖的方式保护骨或同时服用降糖及强骨药进行治疗。此外，一些抗糖尿病药物如噻唑烷二酮类中的罗格列酮，可能对骨量有害，并会增加骨折的风险［6］。因此，探索并深入研究具有降糖及抗骨质疏松双重作用且副作用小的药物就显得尤为重要。Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路是调控细胞增殖、凋亡和组织修复的重要通路，其激活可以促进间充质干细胞（MSCs）和成骨细胞的增殖、分化，提高细胞活性，是调节骨骼系统发育的关键途径之一，参与了DOP的发生发展［7-9］。三黄糖肾康是国家级名中医李敬林教授的自拟方，由黄精、黄连、黄芪、泽兰、水蛭、虎杖组成，具有益气养阴、滋肾壮骨之功。本课题组先前研究证实，其可以通过降低血糖、改善瘦素抵抗、抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）、血清淀粉样蛋白A等炎症因子发挥对DOP的防治作用［10-13］。此外，本方中多种中药有效成分已被证实具有抗骨质疏松的作用，且机制多与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究旨在进一步探讨其防治DOP的机制，为三黄糖肾康防治DOP提供新的靶点，以进一步指导临床。1 材料1.1　动物3月龄雄性SD大鼠50只，体质量（260±20）g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物质量合格证号SCXK（辽）2020-0001。动物室室温（22±2）℃，湿度48%（相对湿度40%~70%），昼夜12 h，自由饮水、摄食，大鼠垫料及维持饲料购于沈阳茂华生物科技有限公司，高糖高脂饲料购于北京博爱港有限公司，已辐照消毒。本研究所涉及的动物相关操作均在辽宁中医药大学动物伦理委员会的批准下进行，伦理审查批号21000042021089。1.2　药物与试剂三黄糖肾康（黄精40 g、黄芪40 g、虎杖30 g、泽兰20 g、黄连6 g、水蛭6 g，均为配方颗粒剂，购于四川新绿色药业科技发展有限公司，生产批号分别为21030131、21090097、20050076、21050023、21020067、21030041），使用时称量相应颗粒药物溶于蒸馏水，水浴加热至完全溶解，4 ℃保存备用。阳性药骨疏康颗粒（辽宁康辰药业有限公司，批号J20130085，10 g/袋），20 g·d-1（成人剂量），受赠于辽宁中医药大学附属医院郑洪新教授。链脲佐菌素（STZ）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、改良番红O-固绿软骨染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为830F026、G1120、G1371）；空腹胰岛素（FINS）、骨特异性碱性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号分别为07/2022、12/2021、12/2021）；β-肌动蛋白（β-actin）、Wnt3a、β-catenin抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-0061R、bs-1170R、bs-1165R）；低密度脂蛋白受体相关蛋白-5（LRP-5）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号24899-1-AP）；骨组织蛋白提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，批号BB-3161）；BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW0014S）。1.3　仪器血糖仪、试纸（恒康血糖仪公司）；SHZ-88型水浴恒温振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；MK3型酶标仪、ST16R型高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；Quantum GX型计算机微断层扫描（Micro-CT）仪（美国PerkinElmer公司）；RM2245型半自动轮转式切片机、EG1150H型石蜡包埋机（德国Leica公司）；ECLIPSETS100型倒置显微镜（日本Nikon公司）；Power PacTM Basic型电泳仪、1658001型垂直电泳槽、170-3932型转移电泳槽（美国Bio-Rad公司）；5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。2 方法2.1　动物模型制备50只SD大鼠按随机数字表法分为正常组10只、糖尿病造模组40只。糖尿病造模组于高糖高脂饲料喂养4周后，大鼠均禁食不禁水12 h，按30 mg·kg-1一次性腹腔注射新鲜配置的溶于0.1 mmol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）的STZ，使用过程中冰浴并用锡箔纸进行遮光保护。造模72 h后尾尖取血测大鼠随机血糖，随机血糖≥16.7 mmol·L-1为糖尿病大鼠造模成功［14］。正常组给予左下腹腔注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后将大鼠放置回原笼中正常饲养，适宜条件下（室温20~24 ℃、相对湿度40%~70%）自由饮水、摄食，饲料喂养同前。2.2　分组及给药将造模成功大鼠分为模型组、三黄糖肾康高、低剂量组及骨疏康组，每组10只。正常组、模型组均于造模成功次日始给予10 mL·kg-1蒸馏水灌胃，其余各组造模成功次日后，分别给予相应药物灌胃，连续给药12周。按照大鼠等效剂量：大鼠每kg体质量每日用药剂量=成人用药量/70 kg×6.3计算，三黄糖肾康低、高剂量组分别给药12.8、38.4 g·kg-1·d-1，其中低剂量为等效剂量，高剂量为等效剂量的3倍［13］。骨疏康颗粒给药剂量为1.8 g·kg-1·d-1。将三黄糖肾康颗粒溶于蒸馏水制成浓度为3.84 g·mL-1的药液，供高剂量组使用，将其稀释3倍至1.28 g·mL-1，供低剂量组使用。骨疏康颗粒溶于蒸馏水制成质量浓度为0.18 g·mL-1的药液，供骨疏康组使用，各组给药量均为10 mL·kg-1。以上药物溶液4 ℃冰箱保存，每次灌胃前加热到37 ℃。共灌胃12周，对各组大鼠每周称体质量1次，按体质量调整给药剂量。2.3　样本采集大鼠最后一次灌胃结束后，禁食不禁水12 h，次日按体质量腹腔注射乌拉坦5 mL·kg-1进行麻醉，开胸暴露胸腔，腹主动脉取血约5 mL，3 000 r·min-1离心10 min（离心半径10 cm），取上层血清，-80 ℃保存，用于空腹血糖（FBG）、FINS、BALP、TRAP的检测；完整离断左右两侧股骨，仔细剥离软组织，左侧股骨放入装有4%多聚甲醛的离心管中，用于HE染色、免疫组化（IHC）、骨密度（BMD）、骨组织微结构测定，其余股骨及胫骨用0.9%氯化钠浸湿的纱布包裹，-80 ℃保存，用于蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。2.4　指标检测2.4.1　生化指标检测各组大鼠最后1次灌胃后隔夜禁食12 h，取腹主动脉血全自动生化分析仪测FBG；按照ELISA试剂盒说明书，设置空白孔、标准品孔及样品孔，加酶标试剂后以37 ℃温育60 min，洗涤、显色后以450 nm波长测量吸光度A，计算血清中FINS、BALP、TRAP的含量。2.4.2　BMD及骨微结构测定处死大鼠后分离左侧股骨，应用Micro-CT设置测量参数，扫描股骨观察骨组织微结构并检测BMD。2.4.3　HE染色和番红O-固绿染色观察股骨病理形态学变化大鼠处死后分离左侧股骨并放入4%多聚甲醛中固定72 h后，10% EDTA脱钙液脱钙处理，共脱钙10周，进行常规石蜡包埋、切片、HE染色和番红O-固绿染色，在显微镜下观察各组股骨组织病理形态。2.4.4　IHC观察股骨相关蛋白的表达取左股骨上段，4%多聚甲醛固定，再以10% EDTA脱钙液脱钙，石蜡包埋，制成5 μm切片，将石蜡切片，经脱蜡、脱水、灭酶、抗原修复等处理，加入Wnt3a、LRP-5及β-catenin抗体（1∶200），于37 ℃孵育90 min后，加入二抗，孵育，DAB显色，苏木素复染、二甲苯透明、脱水和封片等，用显微镜观测阳性细胞（呈棕黄色）的表达。随机选择不同的视野，拍照并保存。使用Image J分析软件定量分析Wnt3a、LRP-5及β-catenin阳性染色面积，测取平均积分吸光度AA。2.4.5　Western blot检测股骨相关蛋白表达取粉末状骨组织置于离心管，加入蛋白提取液和钢珠，用组织研磨仪研磨90 s后冰上静置1 h，待其充分裂解后4 ℃、12 000×g离心10 min（离心半径10 cm），取上清即为提取的蛋白。BCA法测蛋白浓度，95 ℃变性5 min。取适量蛋白上样、电泳、转膜。5%的脱脂奶粉封闭1 h后，β-actin（1∶10 000）、Wnt3a（1∶1 000）、LRP-5（1∶1 000）及β-catenin（1∶1 000）抗体4 ℃孵育过夜。孵育二抗（1∶10 000）。TBST洗膜后ECL曝光显影，使用Image J软件测定灰度值。2.5　统计学分析实验数据采用SPSS 25.0统计软件进行处理，结果用x¯±s表示，满足正态分布、方差齐时，各组数据的组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较运用最小显著性差异法（LSD）；方差不齐时，运用Dunnett T3法，不满足正态分布，则使用非参数检验，以P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠一般状况的影响空白组大鼠活动自由，饮食饮水正常，注射STZ后，模型组大鼠出现多饮、多食、多尿，体质量减轻，弓腰塌背、懒动、反应迟钝等表现，在后续饲养过程中随机血糖一直维持在较高水平，稳定性良好。体质量随生长周期增长缓慢，明显低于空白组，说明糖尿病造模效果显著。给药12周，各组症状有所改善。3.2　对大鼠糖代谢指标FBG、FINS水平的影响给药12周后，与正常组比较，模型组大鼠FBG、FINS水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，三黄糖肾康低、高剂量组FBG水平明显降低（P0.05），三黄糖肾康低剂量组FINS水平明显降低（P0.05），骨疏康组FBG水平虽有下降趋势，但差异无统计学意义。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.T001表1三黄糖肾康对糖尿病大鼠FBG、FINS水平的影响 （x¯±s，n=8）Table 1Effect of Sanhuang Tangshenkang on levels of FBG，FINS in serum of diabetic rats （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1FBG/mmol·L-1FINS/mU·L-1空白组8.40±1.1433.16±1.53模型组29.57±2.932）41.91±2.652）三黄糖肾康低剂量组12.821.75±5.373）38.92±2.083）三黄糖肾康高剂量组38.424.27±3.113）39.68±3.03骨疏康组1.826.91±4.9739.95±2.36注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2-表5同）3.3　对大鼠骨代谢指标BALP、TRAP含量的影响给药12周后，与空白组比较，模型组大鼠BALP含量显著降低（P0.01），TRAP含量显著升高（P0.01）；与模型组比较，三黄糖肾康低、高剂量组大鼠BALP含量明显升高（P0.05），三黄糖肾康低、高剂量组和骨疏康组TRAP含量显著降低（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.T002表2三黄糖肾康对糖尿病大鼠BALP、TRAP含量的影响 （x¯±s，n=7）Table 2Effect of Sanhuang Tangshenkang on levels of BALP，TRAP in serum of diabetic rats （x¯±s，n=7）组别剂量/g·kg-1BALPTRAP空白组179.15±14.1582.91±4.72模型组138.49±4.932）97.73±5.182）三黄糖肾康低剂量组12.8155.80±20.523）88.45±3.344）三黄糖肾康高剂量组38.4159.37±12.413）84.70±3.984）骨疏康组1.8145.91±15.0582.55±8.764）μg·L-13.4　对大鼠BMD及骨组织微结构的影响给药12周后，与空白组比较，模型组大鼠BMD水平显著降低（P0.01）；与模型组比较，三黄糖肾康低、高剂量组、骨疏康组均有不同程度提高（P0.05，P0.01）。见表3。给药12周后，Micro-CT扫描结果显示，空白组大鼠骨组织皮质骨均匀，骨小梁互相连接成网状结构，较为致密、排列规整；与空白组相比，模型组大鼠骨小梁断裂并且稀疏；与模型组比较，各给药组大鼠股骨骨小梁增多、增粗，排列较紧密、整齐，骨微结构形态得到一定的改善。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.T003表3三黄糖肾康对糖尿病大鼠BMD的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Sanhuang Tangshenkang on changes of BMD in diabetic rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1BMD/mg HA·cm-3空白组1 565.5±22.6模型组1 440.1±6.82）三黄糖肾康低剂量组12.81 542.3±23.44）三黄糖肾康高剂量组38.41 519.4±63.23）骨疏康组1.81 551.4±10.14）10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F001图1三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨微结构的影响Fig.1Effect of Sanhuang Tangshenkang on microstructure of femur in diabetic rats注：A.空白组；B.模型组；C.三黄糖肾康低剂量组；D.三黄糖肾康高剂量组；E.骨疏康组（图2-图7同）3.5　对大鼠股骨病理形态的影响HE染色结果显示，空白组大鼠股骨骨小梁排列规则、紧密，结构完整，未见明显病理学变化。与空白组比较，模型组大鼠股骨骨小梁结构松散不规则，细长疏稀，出现断裂，脂滴增多。与模型组比较，各给药组大鼠股骨骨小梁增多、增粗，排列紧密、整齐，脂滴数量减少，骨微结构形态得到改善。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F002图2三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨病理形态的影响 （HE，×100）Fig.2Effect of Sanhuang Tangshenkang on pathological morphology of femur in diabetic rats （HE，×100）番红O-固绿染色结果显示，空白组大鼠股骨骨小梁排列、结构较为规则、完整，软骨形态整齐、规则。与空白组比较，模型组大鼠股骨骨小梁排列不规则，细长疏稀，出现断裂，软骨形成分散、紊乱。与模型组比较，各给药组大鼠股骨软骨形态规则，有明显新骨形成，骨组织微结构形态得到一定的改善。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F003图3三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨病理形态的影响 （番红O-固绿，×40）Fig.3Effect of Sanhuang Tangshenkang on pathological morphology of femur in diabetic rats （Safrain O-Fast green，×40）3.6　对大鼠骨组织Wnt3a、LRP-5、β-catenin表达的影响骨组织中Wnt3a、LRP-5及β-catenin免疫组化阳性表达区域呈棕黄色，给药12周后，空白组阳性免疫产物数量较多，染色较深，排列密集，细胞核染成蓝色；与空白组比较，模型组Wnt3a、LRP-5、β-catenin阳性蛋白表达量明显降低，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01）；与模型组比较，各给药组Wnt3a、LRP-5、β-catenin蛋白阳性表达明显提高，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01）。见图4-图6、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F004图4三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨组织Wnt3a蛋白表达的影响 （免疫组化，×400）Fig.4Effect of Sanhuang Tangshenkang on Wnt3a expression in diabetic rats femur tissue （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F005图5三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨组织LRP-5蛋白表达的影响 （免疫组化，×400）Fig.5Effect of Sanhuang Tangshenkang on LRP-5 expression in diabetic rats femur tissue （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F006图6三黄糖肾康对糖尿病大鼠股骨组织β-catenin蛋白表达的影响 （免疫组化，×400）Fig.6Effect of Sanhuang Tangshenkang on β-catenin expression in diabetic rats femur tissue （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.T004表4三黄糖肾康对糖尿病大鼠Wnt3a、LRP-5、β-catenin蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Sanhuang Tangshenkang on Wnt3a，LRP-5，β-catenin expression levels in diabetic rats femur tissue （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1Wnt3aLRP-5β-catenin空白组0.327 6±0.004 40.315 6±0.003 80.340 6±0.007 6模型组0.304 6±0.006 12）0.295 8±0.004 72）0.322 6±0.003 61）三黄糖肾康低剂量组12.80.319 8±0.003 14）0.307 0±0.002 44）0.334 2±0.005 43）三黄糖肾康高剂量组38.40.316 0±0.001 24）0.305 6±0.004 04）0.335 2±0.001 54）骨疏康组1.80.316 6±0.003 44）0.309 0±0.004 14）0.336 8±0.003 74）3.7　对大鼠骨组织Wnt3a、LRP-5、β-catenin表达的影响与空白组比较，模型组Wnt3a、LRP-5和β-catenin蛋白表达显著下降（P0.01）；与模型组比较，各用药组Wnt3a、LRP-5和β-catenin蛋白表达明显升高（P0.05，P0.01）。见表5、图7。10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.T005表5三黄糖肾康对糖尿病大鼠Wnt3a、LRP-5、β-catenin蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Sanhuang Tangshenkang on Wnt3a，LRP-5，β-catenin expression levels in diabetic rats femur tissue （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1Wnt3a/β-actinLRP-5/β-actinβ-catenin/β-actin空白组0.94±0.141.03±0.141.11±0.10模型组0.42±0.122）0.48±0.052）0.41±0.032）三黄糖肾康低剂量组12.80.69±0.104）0.77±0.153）0.75±0.034）三黄糖肾康高剂量组38.40.61±0.053）0.70±0.093）0.67±0.124）骨疏康组1.80.82±0.054）0.89±0.104）0.83±0.094）10.13422/j.cnki.syfjx.20230842.F007图7各组大鼠股骨组织中Wnt3a、LRP-5和β-catenin蛋白表达电泳Fig.7Electrophoresis of Wnt3a，LRP-5，β-catenin expression levels in diabetic rats femur tissue4 讨论DOP是由糖尿病诱发的慢性骨代谢疾病，建立稳定、高效的DOP动物模型是找寻治疗DOP新药的重要基础。目前，国内外许多研究通过高糖高脂饮食联合小剂量STZ来建立DOP大鼠模型［15-17］，不但减少了去卵巢这一实验操作，同时也减少了因手术感染而死亡的动物的数量，减少了经济损失。本研究即采用喂食高糖高脂饮食饲料4周加腹腔注射STZ方式来建立DOP模型，骨质疏松效果显著。骨微结构是评价骨骼健康的重要依据，可以被视为预测骨质疏松中骨丢失和结构恶化的决定性参数，在本研究中，笔者应用骨微CT和骨组织病理染色技术来评估骨结构，结果显示模型组大鼠BMD降低，骨髓腔增大，骨小梁数目减少，结构细薄疏松，部分断裂，脂肪空泡增多，组织形态受到了一定程度的破坏，出现了骨质疏松。这些结果显示糖代谢异常性疾病可影响骨代谢，进而影响骨形成、吸收和转换，引起股骨微结构受损，呈现出典型的骨质疏松状态。而给予三黄糖肾康干预12周后，各给药组大鼠BMD升高，股骨骨小梁增多、增粗，排列紧密、整齐，脂滴数量减少，有明显新骨形成，骨微结构形态得到了改善。骨重塑在调节骨结构中起着独特的作用，成骨细胞和破骨细胞是维持骨形成和吸收平衡的生理事件的参与者，在调节骨重塑和维持骨形成与吸收平衡中起主导作用。骨转化生化指标是实验室诊断骨质疏松的重要指标，不仅可以反映骨形成和骨吸收的过程，而且可以揭示代谢性骨病的发病机制，预测骨丢失率和骨折风险，反映抗骨质疏松药物的治疗效果［18-20］。BALP和TRAP分别是骨形成和骨吸收标志物，在本研究中，模型组大鼠血清BALP含量下降、TRAP含量升高，提示STZ诱导的DOP模型大鼠骨形成和骨吸收的平衡关系被打破。BALP下降可能是由于高血糖诱发的非酶促糖基化反应使骨胶原积累了大量的糖基化终产物（AGEs），AGEs可以促进Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂硬化素增加，进而抑制成骨细胞的分化增殖和凋亡，抑制成骨细胞表达BALP，与文献［21-23］的结果一致。目前发现很多单味中药、中药单体及中药复方都能通过抑制骨吸收标志物如TRAP、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b （TRACP-5b）、β-Ⅰ型胶原交联C-末端肽（β-CTX），增加骨形成标志物如BALP、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和骨保护素（OPG）等来调节骨代谢平衡。LU等［24］研究发现金雀异黄素治疗8周后可改善糖尿病大鼠骨代谢，30 mg·kg-1金雀异黄素显著增加了BMD、血清OCN和BALP，其还能有效降低FBG、TRACP-5b、TNF-α、IL-6及脂肪细胞和破骨细胞的数量。GUO等［21］研究发现STZ诱导的DOP大鼠TRACP-5b、TRAP、β-CTX升高，葛根素可明显降低；与STZ诱导的DOP大鼠ALP、OCN、BALP和OPG降低相比，葛根素可明显使其提高。LI等［25］研究发现滋肾降糖丸通过抑制糖尿病大鼠TRACP-5b和CTX的升高，减弱BALP和BGP的降低来改善DOP。LIU等［26］研究发现六味地黄丸也可以通过降低TRAP的含量来改善DOP。在本研究中，给予三黄糖肾康干预12周，中药低剂量组、中药高剂量组大鼠BALP也得到了升高，三黄糖肾康低、高剂量组和骨疏康组TRAP发生显著降低。研究发现，长期高血糖、氧化应激、炎症反应、AGEs的增加等可能是引起DOP发生发展的深层次机制［27-28］。骨代谢相关信号通路异常转导造成的来源于骨髓的间充质干细胞异常增殖分化、骨代谢平衡失调、骨小梁破坏增加也是引起DOP的重要原因，主要涉及Wnt/β-catenin、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、Notch、核转录因子-κB（NF‐κB）等信号通路［29］。其中研究较多的Wnt/β-catenin信号传导通路在促进成骨细胞形成中起着重要作用，是调控成骨细胞分化和骨基质形成的关键途径。Wnt参与成骨细胞分化形成的过程，稳定表达Wnt 1/Wnt3a能促进具有可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等多种细胞的多潜能干细胞系C3H10T1/2细胞系的增殖，并激活骨形成标志物ALP的活性［30］。LRP-5表达于成骨细胞的表面，对骨量的积累过程起到重要的作用，其功能丧失性突变可导致骨量减少，骨质疏松；功能获得性突变能够导致高骨密度症，其还是Wnt蛋白的跨膜蛋白，通过Wnt/LRP-5信号通路调节成骨细胞的增殖和分化，从而影响人体骨量的积累［31］。有研究证明，LRP-5的表达改变或者功能丢失，可阻止骨质的获得，致使体外培养鼠的头盖骨质密度降低，骨质厚度变薄［32-33］。β-catenin是成骨细胞增殖和分化的主调节因子，去卵巢骨质疏松大鼠β-catenin蛋白表达会受到抑制［34］，去除大鼠β-catenin基因会使骨密质、骨小梁的骨量都大大减少，并伴随骨基质矿化困难及成骨细胞分化障碍；敲除β-catenin基因的大鼠胚胎会出现骨形成障碍。近年来发现如固本活血壮骨颗粒［35］、滋阴补肾方［36］、滋肾降糖丸［25］等许多中药复方通过调节Wnt/β-catenin信号传导通路来防治DOP。在本研究中，模型组大鼠Wnt3a、LRP-5及β-catenin表达量较正常组明显降低，而使用三黄糖肾康防治12周后，Wnt3a、LRP-5及β-catenin表达量明显升高，表明糖尿病大鼠骨组织Wnt/β-catenin信号通路中重要的信号传导分子得到了抑制，其表达量下降，而三黄糖肾康能上调其表达，促进成骨细胞的形成分化，抑制骨破坏，提高BMD，进而改善骨组织形态，发挥对糖尿病大鼠骨量减少及骨质疏松形成防治作用。综上可知，三黄糖肾康防治T2DOP的可能机制为降低血糖、促进骨形成、抑制骨吸收、调控Wnt/β-catenin信号通路中重要的信号传导分子表达。本研究仍存在不足，如在通过高脂饮食联合STZ诱导建立DOP大鼠模型部分，未动态分析并找出成功造模的最佳造模时间；在药物干预部分，未按照时间梯度如4、8、12、16周动态分析指标，探究出三黄糖肾康发挥功效的最佳时间；只依靠Micro-CT来测量骨量，缺少生物力实验对骨强度的测试；未通过细胞实验观察三黄糖肾康对骨代谢相关信号通路的影响；没有使用Wnt/β-catenin信号转导抑制剂，未来的研究应该应用抑制剂来确定骨丢失或微结构损伤是否被阻止或逆转。此外仍有许多细节及问题需要未来进一步通过大样本、更加深入精细地研究来阐明三黄糖肾康对DOP的防治作用。