溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、复发性、进行性的肠道炎症性疾病［1］。临床症状以间断性腹泻、黏液脓血便、腹痛为特征［2］，肠镜下表现为直结肠黏膜呈弥漫性充血、水肿，甚者出血［3］。肠道异常炎症与自噬功能障碍存在内在联系［4-6］。自噬作用于肠上皮细胞，使其维持自我更新及细胞自身稳态。一旦自噬功能障碍，内部环境失衡，会引起肠上皮细胞异常损伤［7］。本课题前期实验发现人参败毒散通过激活自噬实现肠黏膜屏障损伤后修复［8］，然其作用机制不详。有研究表明肠道修复能力减弱与肠干细胞的内在自噬缺陷相关［9］。肠道自噬障碍，致活性氧自由基（ROS）不断累积，从而降低肠干细胞的再生、分化能力。另有学者报告，通过促进细胞自噬功能，可有效减轻氧化应激损伤，修复受损的血管内皮细胞，增强内皮祖细胞增殖、迁移能力［10］。基于此，课题组拟从调控自噬功能清除过氧化物角度，探究人参败毒散修复UC肠黏膜的具体机制，以期为该方治疗UC提供实验依据。1 材料1.1　动物60只SPF雄性C57BL/6J小鼠，体质量（20±2） g，6周龄，购于斯贝福生物科技有限公司。动物合格证号SCXK（京）2019-0010。SPF级动物房环境：温度（23±2） ℃、湿度40%~60%。本实验通过《成都中医药大学动物实验伦理审查条例》，伦理审查编号No.2022-35。1.2　药物人参败毒散：柴胡、川芎、前胡、生甘草、人参片、桔梗、羌活、独活、茯苓、枳壳各9 g，薄荷2 g，生姜3 g。该方饮片购于新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学药学院李敏教授鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》饮片标准。遵《太平惠民和剂局方》载人参败毒散的煎服法：“上十味，各三十两，为粗末，每服二钱……生姜、薄荷各少许，同煎七分”［11-12］，本次研究以煮散剂制备药物。参照仝小林等［13-15］考据煮散剂的制备方式，取饮片粉碎为粗末，一号筛过末，水煎并浓缩后得生药质量浓度为1 g·mL-1的药液，保存备用。美沙拉嗪肠溶片购于四川省中医院，研细粉状，与纯水混匀配制为混悬液，现配现用。1.3　试剂兔单克隆SQSTM1/p62抗体、兔单克隆增殖核抗原（PCNA）抗体、兔单克隆微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）抗体、兔单克隆富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（LGR5）抗体（英国Abcam公司，批号分别为GR3241806-16、GR3396553-14、GR3338049-5、GR3361103-17）；兔单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CST公司，批号2118）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗、蛋白酶抑制剂（PMSF）（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为EST17K05A17L54、17E31C79）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成研究所，批号分别为20231214、20231215）；活性氧（ROS）染料（美国Aladdin公司，批号104821-25-2）；葡聚糖硫酸钠（DSS）［西宝生物科技（上海）股份有限公司，批号OU1803A］；苏木素-伊红（HE）染液套装（北京雷根生物技术有限公司，批号DH0020）；阿利新蓝-过碘酸雪夫氏（PAS/AB）染液套装（南京森倍伽生物科技有限公司，批号BP-DL031）；苏木素（武汉谷歌生物科技有限公司，批号G1004）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、卡诺氏固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号分别为G1012、GR2205002）。1.4　仪器VE-180B型电泳仪、VE-586型转膜仪（上海天能科技有限公司）；HS6型数字病理扫描系统（舜宇恒平科学仪器有限公司）；KZ-Ⅲ-F型高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Touch Imager XLi型接触式无损定量成像仪（上海易孛特光电科技有限公司）；Microfuje 20R型高速冷冻离心机［贝克曼库尔特（美国）股份有点公司］；SpectraMax Id5型多功能酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司］；FA2004B型电子天平［上海越平科学仪器（苏州）制造有限公司］。2 方法2.1　分组与造模SPF雄性C57BL/6J小鼠（60只）随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、人参败毒散高、中、低剂量组，每组10只。适应性喂养7 d后，选用DSS诱导UC模型小鼠。造模小鼠予3.0%的DSS溶液连续7 d自由饮用，以大便隐血检验、疾病活动指数（DAI）评分判断造模是否成功［16］。2.2　给药剂量依范佳佳等［13］考证《太平惠民和剂局方》煮散剂的用量，换算人参败毒散的用药量为30 g。给药剂量参照《中医药动物实验方法学》［17］，以成人70 kg、等效剂量折算系数0.002 6为据，换算20 g小鼠每日给药剂量：高剂量12.35 g·kg-1、中剂量8.22 g·kg-1、低剂量4.11 g·kg-1、美沙拉嗪组0.3 g·kg-1。造模7 d后开始给药，人参败毒散高、中、低组及美沙拉嗪组予相应药物灌胃；正常组及模型组予等体积生理盐水灌胃，日1次，共7 d。2.3　标本取材与制备末次给药后，各组小鼠禁食不禁水24 h。麻醉后经眼球取血并处死小鼠。暴露小鼠腹腔，钝性分离并去除结肠。用预冷磷酸缓冲盐液（PBS）洗净后，分别取长度约1 cm的结肠组织置于4%多聚甲醛溶液、卡诺氏固定液固定待检。余结肠段于冻存管保存，置于-80 ℃冰箱待用。2.4　观察指标及方法2.4.1　一般情况记录UC模型小鼠体质量变化，观察每日粪便、活动、摄食等变化情况。2.4.2　HE染色检测结肠组织病理变化采用HE染色观察各组小鼠结肠组织病理改变情况。结肠组织置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出，行乙醇梯度脱水操作。经脱水处理后的组织置入二甲苯及无水乙醇中透明，待组织呈完全透明状态后进行浸蜡、包埋等操作。组织包埋后，取蜡块行切片、染色操作。切片经苏木素、伊红染色后，进行脱水封片处理，并置于数字病理扫描系统扫描、拍照，观察视野内结肠组织基本病理改变并评分。结肠病理损伤（TDI）评分［18］标准：未见损伤，0分；黏膜层见散在炎性细胞，呈轻度水肿，1分；在1分基础上，黏膜层见局部炎性细胞集中，呈中度水肿，2分；在2分基础上，黏膜层见弥散炎性细胞，呈重度水肿，3分；在3分基础上，溃疡面积达1/2，4分；在4分基础上，有大面积溃疡生成，黏膜结构丧失，有坏死达肌层，5分。2.4.3　PAS/AB法检测结肠组织杯状细胞变化采用PAS/AB染色观察各组小鼠结肠组织杯状细胞变化。新鲜结肠组织于卡诺氏固定液中固定，经脱水、包埋、切片等处理后行PAS/AB染色。染色条件：阿利新蓝液浸染10 min；水洗后0.5%高碘酸水氧化5 min；雪夫试剂浸染15 min；水洗后苏木素染色3 min；返蓝后行脱水、封片等操作，并置于数字病理扫描系统扫描、拍照。2.4.4　免疫荧光法检测结肠组织ROS表达采用免疫荧光观察各组小鼠结肠组织ROS表达水平。切片复温后行淬灭组织自发荧光操作，自发荧光淬灭剂5 min；水洗后行ROS染色，ROS染液37 ℃避光孵育30 min。染色后，玻片用PBS洗3次。玻片干燥后行DAPI复染操作，DAPI染液避光室温孵育10 min。复染后洗涤并封片，于荧光显微镜下观察并采集图像，使用Image-pro plus 6.0进行分析。2.4.5　生化法检测结肠组织SOD、MDA表达采用生化法观察各组小鼠结肠组织SOD、MDA表达。取结肠组织于研磨管并依次加入适量的组织裂解液、PMSF进行研磨，组织研磨仪条件：70 Hz，10次，4 ℃；待组织研磨成浆低温静置60 min，于低温高速离心机进行离心，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min（离心半径5 cm），离心后取上清，经BCA法蛋白定量，采用WST-1法检测结肠组织中SOD活性，硫代巴比妥酸（TBA）法检测结肠组织中MDA含量。严格按照SOD及MDA试剂盒操作流程进行检测，设置酶标仪波长SOD（450 nm）、MDA（532 nm）。检测组织匀浆吸光度A，计算SOD活性及MDA含量。2.4.6　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织LC3BⅡ/Ⅰ、p62、LGR5、PCNA蛋白表达结肠组织匀浆经BCA法蛋白定量后行蛋白变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）固定后行电泳、转膜操作。转膜后封闭90 min，孵育一抗（LC3BⅡ/Ⅰ、p62、LGR5、PCNA，稀释倍数分别为1∶2 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃过夜。一抗孵育后洗膜。待洗膜结束后，加二抗（1∶50 000）孵育。孵育结束后行洗膜操作，于电子压片成像仪进行显影并拍照。Image J软件分析其灰度值表达。2.5　统计学分析所有数据采用SPSS 26.0统计软件进行分析，数据资料以x¯±s表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对UC小鼠一般情况的影响造模前，各组小鼠体质量差异无统计学意义。造模后，除空白组外，各组小鼠毛发稀疏明显、活动减少，进食减少，肉眼见血便及黏液，体质量明显减轻（P0.05）；经治疗后，与正常组比较，模型组小鼠体质量持续下降（P0.05），毛发稀疏，肉眼仍见黏液、脓血便。与模型组比较，人参败毒散高、中、低剂量组及美沙拉嗪组小鼠体质量上升（P0.05），进食渐增，毛发渐佳，肉眼黏液、血便明显消失。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.T001表1人参败毒散对UC模型小鼠体质量的影响 （x¯±s）Table 1Effect of Renshen Baidusan on body weight of UC mice （x¯±s）组别剂量/g·kg-1造模前体质量造模后体质量治疗后体质量正常组20.28±0.6021.66±0.5323.20±0.56模型组20.21±0.8118.89±0.471）17.04±1.651）美沙拉嗪组0.320.27±0.5418.70±0.601）21.86±0.892）人参败毒散高剂量组12.3520.22±0.5118.68±0.761）19.17±1.382）人参败毒散中剂量组8.2220.16±0.7118.86±0.791）21.03±0.612）人参败毒散低剂量组4.1120.28±0.4118.58±0.431）22.06±0.922）注：与正常组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05g3.2　对UC小鼠结肠组织病理学改变的影响HE染色结果显示，正常组小鼠结肠组织结构清晰，黏膜上皮完整，肠腺整齐；PAS/AB染色见肠腺中杯状细胞清晰可见，数量充足，形态完整；与正常组比较，模型组小鼠结肠组织黏膜大面积上皮结构缺失，肠腺消失，大量炎性细胞浸润，TDI评分明显上升（P0.05）；PAS/AB染色见大量杯状细胞丧失，排列不齐。与模型组比较，各治疗组小鼠结肠组织黏膜上皮结构改变均有所减轻，黏膜炎性浸润有不同程度的改善，PAS/AB染色见肠腺内杯状细胞数量见不同程度增生，TDI评分明显下调（P0.05）。见图1、图2、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.F001图1人参败毒散对UC模型小鼠结肠组织的影响 （HE，×200）Fig. 1Effect of Renshen Baidusan on colon tissue in UC mouse colon tissue （HE， ×200）注：A.正常组；B.模型组；C.美沙拉嗪组；D.人参败毒散高剂量组；E.人参败毒散中剂量组；F.人参败毒散低剂量组（图2-图4同）10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.F002图2人参败毒散对UC模型小鼠结肠组织杯状细胞的影响（PAS/AB，×200）Fig. 2Effect of Renshen Baidusan on goblet cells in UC mouse colon tissue （PAS/AB， ×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.T002表2人参败毒散对UC模型小鼠TDI的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of Renshen Baidusan on TDI of UC mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1TDI/分正常组0.33±0.52模型组4.17±0.751）美沙拉嗪组0.31.67±0.822）人参败毒散高剂量组12.353.17±0.752，3）人参败毒散中剂量组8.222.50±0.552）人参败毒散低剂量组4.111.83±0.752）注：与正常组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05；与人参败毒散低剂量组比较3）P0.05（表3-表5同）3.3　对UC小鼠结肠组织ROS的影响与正常组比较，模型组结肠组织ROS相对荧光强度明显增强（P0.05）；与模型组比较，各治疗组ROS相对荧光程度均有不同程度减弱，差异具有统计学意义（P0.05），以人参败毒散低剂量组减弱最明显。见表3、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.T003表3人参败毒散对UC模型小鼠ROS的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Renshen Baidusan on ROS of UC mice （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1ROS正常组0.068±0.003模型组0.093±0.0031）美沙拉嗪组0.30.075±0.0022）人参败毒散高剂量组12.350.085±0.0052，3）人参败毒散中剂量组8.220.078±0.0062，3）人参败毒散低剂量组4.110.069±0.0102）10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.F003图3人参败毒散对UC模型小鼠结肠组织ROS的影响 （免疫荧光，×200）Fig. 3Effect of Renshen Baidusan on ROS in UC mouse colon tissue （IF，×200）3.4　对UC小鼠结肠组织SOD、MDA水平的影响与正常组比较，模型组结肠组织SOD活力明显减弱（P0.05），MDA含量明显上升（P0.05）；与模型组比较，各给药组SOD活力均有不同程度上调，而MDA含量明显降低（P0.05），以人参败毒散低剂量组最明显。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.T004表4人参败毒散对UC模型小鼠SOD、MDA水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of Renshen Baidusan on SOD and MDA of UC mice （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1SODMDA正常组80.26±3.4536.79±4.17模型组17.66±4.081）68.04±3.911）美沙拉嗪组0.357.09±5.952，3）49.87±3.932，3）人参败毒散高剂量组12.3536.08±3.022，3）57.64±2.372，3）人参败毒散中剂量组8.2255.24±3.472，3）46.28±4.322，3）人参败毒散低剂量组4.1178.56±4.342）39.16±3.382）U·mg-13.5　对UC小鼠结肠组织LC3BⅡ/Ⅰ、p62、LGR5、PCNA蛋白表达的影响与正常组比较，模型组LC3BⅡ/Ⅰ、PCNA蛋白表达明显下调（P0.05），p62、LGR5蛋白表达明显上升（P0.05）；与模型组比较，各给药组LC3BⅡ/Ⅰ、LGR5、PCNA（除人参败毒散低剂量组LGR5外）表达水平均有不同程度上调，p62蛋白表达明显下降（P0.05），其中以人参败毒散低剂量组效果最明显。见表5、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.T005表5人参败毒散对小鼠结肠组织LC3BⅡ/Ⅰ、p62、LGR5、PCNA蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Renshen Baidusan on expression levels of LC3BⅡ/Ⅰ，p62，LGR5 and PCNA proteins in mice colon tissue （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1LGR5/GAPDHp62/GAPDHLC3BⅡ/ⅠPCNA/GAPDH正常组0.47±0.090.28±0.010.81±0.021.00±0.09模型组0.65±0.041）1.14±0.041）0.62±0.021）0.51±0.111）美沙拉嗪组0.31.03±0.102，3）0.98±0.082，3）1.03±0.112，3）1.41±0.072，3）人参败毒散高剂量组12.350.62±0.083）0.76±0.022，3）0.98±0.072，3）0.63±0.083）人参败毒散中剂量组8.220.71±0.073）0.67±0.022，3）1.37±0.022，3）1.27±0.052，3）人参败毒散低剂量组4.111.24±0.112）0.57±0.012）1.56±0.022）1.75±0.052）10.13422/j.cnki.syfjx.20231039.F004图4小鼠结肠组织LC3BⅡ/Ⅰ、p62、LGR5、PCNA蛋白表达电泳Fig. 4Electrophoresis of expression levels of LC3BⅡ/Ⅰ， p62， LGR5 and PCNA proteins in mice colon tissue4 讨论UC是一种慢性、进行性、炎症性的肠道疾病。目前亚州地区UC患病率日趋上升［19］，中国仅2017年患者增至45万［20］。有研究报道UC发病与结肠组织自噬功能异常有关［6］，自噬功能障碍会造成肠上皮细胞异常损伤，肠道内环境失衡。中医药有关自噬与UC的考察，多集中于自噬抑制肠道炎症反应方面［21-23］。课题组前期实验也发现人参败毒散通过激活AMPK/ULK1自噬通路，可减轻肠道炎症从而改善肠黏膜屏障功能［8，24］。现已有研究表明自噬功能异常与氧化应激相关［25-27］，认为氧化应激（OS）是UC的发生、发展的关键因素［27］。当肠道处于炎症状态时，机体氧化还原能力障碍，过量的ROS聚集，会导致肠道组织氧化损伤，肠屏障功能被破坏。MDA与SOD共同反应机体氧化应激水平，前者是脂质氢过氧化物的分解产物，后者是抗氧化酶，两者在机体的含量呈负相关［28］。若OS持续失衡，MDA含量持续增加，SOD活性不断减弱，肠道炎症程度则会加剧［29］。而肠道上皮细胞通过启动自噬能清除过量的ROS，有效抑制炎症部位的过度氧化，减轻肠上皮细胞异常损伤，从而修复受损黏膜，抑制结肠炎和直结肠癌的发生［30-31］。另有报道称ROS的大量集聚可诱导p62（SQSTM1）介导的自噬通路失活，造成肠干细胞的发育异常及屏障功能障碍［32］。反之，自噬功能障碍也会引起ROS的积累，降低LGR5+肠干细胞的数量及分化能力，进一步削弱肠上皮损伤后的修复能力［33］。肠上皮损伤后修复分为3个持续而重叠的阶段：炎性反应、细胞增殖迁移及重建［34］。而肠干细胞是重建肠上皮、修复黏膜损伤的核心细胞，其通过增殖、分化以实现修复目的。位于肠隐窝的LGR5+细胞是肠干细胞的重要类型之一，除维持自我更新外，尚可分化为杯状细胞、簇细胞、内分泌细胞等［35］。当UC发生时，肠干细胞向杯状细胞分化受阻，致使杯状细胞数量减少，有害菌易于侵入黏膜，加重肠道炎症，损伤肠黏膜屏障。临床研究亦证实UC患者结肠组织中杯状细胞数量明显减少，黏液层变薄［36］。PCNA是评价细胞增殖活性的常见指标［37-38］，当UC小鼠肠道炎症严重时，其表达水平明显抑制，提示肠道自身修复能力明显减弱［39］。应用黄芪多糖干预，能明显增强UC大鼠的肠道修复能力，上调PCNA蛋白的表达水平，促进其肠道黏膜组织的再生［40］。基于此，课题组从自噬清除过氧化物方面入手，探究人参败毒散修复肠黏膜的具体机制。实验选择LC3及p62判断结肠组织的自噬水平。前者是自噬的特异性蛋白，其亚型比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）反应自噬活性。后者是自噬衔接蛋白，其表达水平与氧化应激程度成正比。本次研究结果显示，UC模型小鼠结肠组织LC3Ⅱ/Ⅰ下调，p62蛋白、MDA水平上升，SOD活性明显减弱，ROS相对荧光表达增强，提示自噬功能受损时，肠道氧化应激明显增强。进一步检测肠干细胞增殖水平，结果显示结肠干细胞增殖、分化能力减弱，PCNA表达下调，PAS/AB染色见结肠组织中杯状细胞大量消失、排列不齐，表明自噬功能受损时，肠干细胞增殖、分化能力明显减弱，这与ASANO等［9］研究结果一致。予人参败毒散干预后，UC模型小鼠结肠组织中p62含量下调，LC3Ⅱ/Ⅰ上升。同时，人参败毒散各组结肠组织中MDA、ROS水平下调，SOD活性增强，PAS/AB染色也可见各组肠腺中不同数量的新生杯状细胞。细胞增殖相关蛋白LGR5、PCNA表达水平上升，值得一提的是，模型组LGR5表达水平也见上调，但上调水平远不及人参败毒散低、中剂量组及美沙拉嗪组，表明在肠道损伤时，UC模型小鼠肠道依旧存在一定的修复能力，但始终不及人参败毒散中、低剂量组，提示人参败毒散的修复肠上皮的内在机制可能与启动细胞自噬恢复肠道自身稳态，减轻氧化应激损伤，增强肠干细胞的增殖、分化能力有关。本次实验仅从动物层面探讨人参败毒散修复黏膜损伤的部分药效机制，后期课题组拟结合细胞实验进一步验证人参败毒散调节自噬促肠黏膜修复的机制研究。综上所述，人参败毒散对肠黏膜损伤具有修复作用，其通过调控细胞自噬功能，能有效清除肠道过氧化合物，从而增强肠道损伤后的修复能力。