溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的两大亚型之一［1］，临床多以腹泻反复、黏液脓血便为主症［2］。据流行病调查报道显示，近10年国内IBD发病率日趋上升［3］，仅2016年宁波市鄞州区IBD发病密度达24.62/10万人年［4］，已成为消化系统疾病中常见难治病之一。然UC病因不明，有研究提出其发病与肠黏膜屏障损伤存在内在关联［5］。肠黏膜屏障功能的改变诱导肠道炎症的发生。同时，肠道的炎症损伤又进一步加剧肠道屏障功能的缺陷［6-7］。本课题组前期实验也证实其发病与肠道黏膜屏障损伤有关［8］，通过人参败毒散干预UC模型大鼠能有效改善肠上皮紧密连接（TJ）蛋白功能，促进肠道黏膜屏障的修复［9］。现代研究发现，在肠道黏膜损伤时自噬及其调节机制对肠黏膜屏障有双重作用，即损伤和修复［10］。若自噬功能障碍，肠上皮细胞稳态失衡，氧化应激损伤加剧，肠道异常炎症增多［11］，最终导致肠道黏膜屏障损伤加重［12］。目前部分UC药物发现其免疫调节作用与自噬反应有直接或间接联系［13］。而人参败毒散作为治痢经典名方［14］，其治疗UC的作用是否通过调节肠道自噬反应达到目的，尚未见报道。因此，本课题基于前期研究探讨人参败毒散对腺苷酸活化蛋白激酶/Unc-51样激酶1（AMPK/ULK1）自噬通路介导的肠黏膜屏障功能的影响，以求进一步阐释人参败毒散对UC的内在作用机制。1 材料1.1　动物及环境雄性SPF级SD大鼠60只，体质量（180±20） g，购于成都Dossy公司，动物合格证号SCXK（川）2020-030。本实验经成都中医药大学动物伦理委员会审查，审查批号No.2020-21。动物饲养于成都中医药大学基础医学院科研创新实验中心动物房。饲养条件：光照循环（12 h/12 h明暗周期），动物房温度（23±2） ℃，相对湿度40%~60%。1.2　药物人参败毒散（人参片、前胡、桔梗、羌活、独活、茯苓、枳壳、生甘草各6 g，柴胡12 g，川芎9 g，薄荷、生姜各3 g），饮片购于成都同仁堂有限公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定均为正品；除薄荷、生姜以外的诸药浸泡后煎煮20 min，再加入薄荷、生姜煎煮5 min后过滤取汁；复加水再煎30 min取汁，将以上药汁混匀浓缩，于4 ℃冰箱保存，最终含生药质量浓度为1 g·mL-1。柳氮磺胺吡啶肠溶片（SASP）购于四川省中医院。SASP研细粉状，与纯水混匀配制为混悬液，现配现用。1.3　试剂紧密连接蛋白-2（Claudin-2）抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号AH07176016）；磷酸化（p）-AMPKα（Thr172）抗体、p-ULK1（Ser555）抗体、兔单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CST公司，批号分别为2535、5869、2188S）；重组抗闭合蛋白（Occludin）抗体、重组抗SQSTM1/p62抗体、兔单克隆微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）抗体（英国Abcam公司，批号分别为GR119583-77、GR3241806-16、GR3338049-5）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号BST18E24C18F54）；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，美国Sigma公司，批号#SLCG2384）；乙醇（成都市科隆化学品有限公司，批号CAS64-17-5）；苏木素-伊红（HE）染液套装（武汉谷歌生物科技有限公司，批号G1005）；TRIzol（美国Invitrogen公司，批号15596018）；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR） EasyTM-SYBR GreenⅠ、RT EasyTM Ⅱ（成都Foregene公司，批号分别为P211201、210701）。1.4　仪器VE-180B型电泳仪、VE-586型转膜仪（上海Tanon公司）；TST-ZNH-20型智能型超纯水机（石家庄泰斯特仪器设备有限公司）；K2800型核酸分析仪（北京Kaiko公司）；RM2016型病理切片机（德国Leica公司）；SLAN-96S型医用PCR分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）；KZ-Ⅲ-F型高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；Varistain™ Gemini ES型全自动染色机（赛默飞世尔科技公司）。2 方法2.1　动物模型复制［9］60只SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药SASP组、人参败毒散高、中、低剂量组，每组10只。适应性喂养7 d后，选择TNBS/乙醇法诱导UC模型。通过乙醇损伤肠黏膜屏障后，TNBS经受损屏障与结肠组织蛋白结合形成全抗原，诱发T淋巴细胞活化并释放相关促炎性细胞因子，导致肠道炎症的发生。大鼠麻醉后，以灌肠手段将TNBS/50%乙醇混合液（100 mg·kg-1）注入大鼠肠腔，并提尾倒置3~5 min，以防药液漏出。正常组则予同等体积的生理盐水灌肠。大鼠结肠组织肠壁增厚，充血、水肿，有溃疡及肠道粘连表示造模成功。2.2　动物死亡情况造模期间，正常组未见死亡，而其余组UC模型大鼠出现死亡情况，分别为：模型组2只、SASP组1只、人参败毒散高剂量组2只、人参败毒散中剂量组1只、人参败毒散低剂量组2只。经解剖后发现，死亡大鼠结肠见大面积的梗阻或穿孔，部分甚至腹腔出现积液。治疗期间，模型组死亡1只，解剖结果同上。2.3　给药给药剂量参照《药理实验方法学》［15］，以成人（60 kg）临床剂量为例，则大鼠（200 g）的人参败毒散中剂量组剂量为15.6 g·kg-1，人参败毒散高剂量组（中剂量的2倍）剂量为31.2 g·kg-1，人参败毒散低剂量组（中剂量的1/2倍）剂量为7.8 g·kg-1。造模后第8天，以上3组均灌胃给药，每日1次，连续2周。SASP组予0.312 5 g·kg-1 SASP混悬液灌胃给药，模型组予同体积无菌生理盐水灌胃。2.4　标本采集末次给药结束后，大鼠禁食不禁水24 h。腹腔麻醉处死后，暴露大鼠腹腔，分离结肠，取肛门上约2 cm至盲肠肠道组织，经预冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，平铺于冰砖，测量长度、质量并肉眼评分。取结肠组织2 cm置于10%中性甲醛溶液固定，余肠段分装于1.5 mL离心管，转入-80 ℃冰箱保存。2.5　检测指标2.5.1　一般情况记录大鼠的体质量、粪便性状、精神状态等。2.5.2　结肠组织损伤评分测量结肠组织长度与质量，计算结肠指数。经肉眼、光镜下评估结肠组织损伤程度，肉眼评估结肠黏膜损伤程度［16］（CMDI），评分细则如下：无明显损伤，0分；局部黏膜充血水肿，无糜烂或溃疡，1分；黏膜充血水肿，伴有肠壁增厚，轻度糜烂，无溃疡，2分；黏膜充血水肿明显，呈中度糜烂，有肠黏连明显，肉眼见单个溃疡形成，3分；黏膜重度充血水肿，呈重度糜烂，肉眼见多个溃疡形成，最大直径1 cm，4分；4分基础上，肉眼见2个或以上溃疡形成，最大直径≥1 cm，5分。结肠组织固定后，进行脱水、包埋、切片及HE染色等流程，光学显微镜镜下观察并进行结肠病理损伤（TDI）评分，评分细则如下：无损伤，0分；黏膜层炎性细胞呈散在状浸润，黏膜下层呈轻度水肿，1分；在1分基础上，炎性细胞呈灶状浸润，黏膜下层中度水肿，2分；在2分基础上，炎性细胞弥散浸润，黏膜下层组织呈重度水肿，3分；在3分基础上，溃疡面积达1/2，4分；在4分基础上，有大面积溃疡生成，伴有黏膜坏死，甚至坏死达黏膜固有肌层，5分。2.5.3　Real-time PCR检测结肠组织AMPKα mRNA表达TRIzol法提取结肠组织总RNA，行反转录，获取cDNA，逆转录条件为25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。PCR条件为95 ℃预变性10 min，循环1次；95 ℃变性15 s，循环40次；60 ℃退火60 s，循环40次。按要求加入上下游引物并进行反应，测量Ct值。通过相对定量法2-ΔΔCt法计算其mRNA相对表达量。AMPKα（100 bp）引物序列上游5'-GCCGAGAAGCAGAAGCACGAC-3'，下游5'-GCTTGCCCACCTTCACTTTCCC-3'；GAPDH（92 bp）上游5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。引物序列由生工生物工程（上海）有限公司设计合成。2.5.4　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织p-AMPK、p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ、Occludin、p62、Claudin-2蛋白表达提取结肠蛋白样品，BCA法行蛋白定量，样本稀释后与上样缓冲液混匀于金属浴行蛋白变性（95 ℃，10 min）。根据蛋白大小选制不同浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝胶，取变性蛋白样本10 μL进行上样。调整电压行电泳、转膜、封闭等操作。封闭结束后，进行一抗孵育（LC3BⅡ/Ⅰ、p62、p-AMPK、p-ULK1、Occludin、Claudin-2，稀释倍数分别为1∶2 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃过夜。一抗封闭结束后，行HRP标记羊抗兔二抗（1∶50 000）孵育1 h。待二抗孵育后，于凝胶成像系统显影、拍照，分析其蛋白条带灰度值。2.6　统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，实验数据以x¯±s表示。若实验数据满足正态分布，则选单因素方差分析；若满足方差齐性，则两组间比较选最小显著性差异法（LSD）分析；若不满足方差齐性，则两组间比较选T3检验。P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠一般情况的影响与正常组比较，模型组体质量呈下降趋势，差异具有统计学意义（P0.05），大鼠精神萎靡、反应迟钝、毛发稀疏少光泽，肛周见潮湿、臭秽，有黏液脓血便；与模型组比较，人参败毒散高、中、低剂量组及SASP组大鼠体质量明显上升（P0.05），大鼠精神转佳、反应敏捷，毛发渐见光泽，大便渐成型，肉眼血便消失。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.T001表1人参败毒散对大鼠体质量的影响 （x¯±s）Table 1Effect of Renshen Baidusan on body weight of rats （x¯±s）组别治疗前n治疗后n剂量/g·kg-1治疗前体质量治疗后体质量正常组1010254.30±7.07366.70±12.69模型组87176.13±7.241）297.14±13.061）SASP组990.312 5177.11±7.011）327.33±10.092）人参败毒散高剂量组8831.2174.63±6.161）312.50±4.812）人参败毒散中剂量组9915.6175.89±6.011）326.33±12.342）人参败毒散低剂量组887.8175.38±5.501）318.88±13.982）注：与正常组比较1）P0.05，与模型组比较2）P0.05（表2-表5同）g3.2　对UC大鼠结肠指数、结肠质量的影响与正常组比较，模型组结肠质量、结肠指数均明显增长（P0.05），结肠长度明显缩短（P0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠结肠质量、结肠指数均有下调趋势，长度有不同程度增加，其中以人参败毒散中剂量组、SASP组最明显（P0.05）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.T002表2人参败毒散对UC大鼠结肠质量、结肠长度、结肠指数的影响 （x¯±s）Table2Effect of Renshen Baidusan on colonic weight， colonic length and colonic index of UC rats （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1结肠质量/g结肠长度/cm结肠指数/%正常组101.62±0.2016.83±1.304.27±0.49模型组72.00±0.371）13.06±2.001）6.37±1.131）SASP组90.312 51.70±0.222）14.99±1.952）5.50±0.792）人参败毒散高剂量组831.21.78±0.2014.73±0.885.86±0.72人参败毒散中剂量组915.61.71±0.272）15.16±2.092）5.53±0.752）人参败毒散低剂量组87.81.75±0.2214.14±1.635.69±0.413.3　对UC大鼠结肠组织病理形态学变化的影响与正常组比较，模型组肉眼见结肠组织长度缩短，肠壁增厚，充血、水肿明显，有溃疡及肠道粘连，CMDI评分明显增加（P0.05）。光镜下见结肠黏膜大面积溃疡，损伤达肌层，伴有大量中性粒细胞、巨噬细胞浸润，肠腺腔重度扩张且异形，局部黏膜下层见水肿，TDI评分明显增加（P0.05）。与模型组比较，各治疗组肉眼见结肠长度增加，充血、水肿见明显减轻，CMDI评分明显下调（P0.05）。光镜下观察，见各治疗组肠各层结构较清晰，肠腺上皮中杯状细胞清晰，局部黏膜下层水肿见不同程度减轻，TDI评分下调（P0.05）。见图1、图2、表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.F001图1人参败毒散对大鼠结肠组织形态学的影响Fig. 1Effect of Renshen Baidusan on colonic histomorphology in rats注：A.正常组；B.模型组；C.SASP组；D.人参败毒散高剂量组；E.人参败毒散中剂量组；F.人参败毒散低剂量组（图2和图3同）10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.F002图2人参败毒散对大鼠结肠组织病理学的影响 （HE，×200）Fig. 2Effect of Renshen Baidusan on colonic histopathology in rats （HE， ×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.T003表3人参败毒散干预UC大鼠CMDI、TDI的影响 （x¯±s，n=6）Table 3Effect of Renshen Baidusan on CMDI and TDI of UC rats （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1CMDITDI正常组0.00±0.000.17±0.41模型组3.86±0.691）3.67±0.781）SASP组0.312 51.89±0.602）1.89±0.602）人参败毒散高剂量组31.22.25±0.462）2.33±0.71人参败毒散中剂量组15.61.89±0.602）1.67±0.712）人参败毒散低剂量组7.82.00±0.932）2.00±0.87分3.4　对UC大鼠结肠组织AMPKα mRNA表达的影响与正常组比较，模型组AMPKα mRNA水平明显下调（P0.05）；与模型组比较，经人参败毒散、SASP干预后，各药物组的AMPKα mRNA表达均有不同程度上调，差异具有统计学意义（P0.05）。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.T004表4人参败毒散对大鼠AMPKα mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Renshen Baidusan on mRNA expression of AMPKα in rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1AMPKα正常组3.67±1.01模型组1.15±0.341）SASP组0.312 52.93±0.582）人参败毒散高剂量组31.22.67±0.572）人参败毒散中剂量组15.63.36±0.642）人参败毒散低剂量组7.83.23±0.722）3.5　对UC大鼠结肠组织、LC3BⅡ/Ⅰ、Occludin、p62、Claudin-2蛋白表达的影响与正常组比较，模型组p-AMPK、p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ、Occludin蛋白表达明显下调（P0.05），p62、Claudin-2蛋白表达水平明显增加（P0.05）；与模型组比较，SASP组及人参败毒散各剂量组p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达均明显上调，p62、Claudin-2蛋白表达均明显下调（P0.05），人参败毒散中、低剂量组p-AMPK、人参败毒散中剂量组Occludin蛋白表达明显增加（P0.05）。见表5、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.T005表5人参败毒散对大鼠结肠组织p-AMPK、p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ、Occludin、p62、Claudin-2蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Renshen Baidusan on p-AMPK， p-ULK1， LC3BⅡ/Ⅰ， Occludin， p62 and claudin-2 proteins in colon tissue of rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1p-AMPK/GAPDHp-ULK1/GAPDHLC3BⅡ/ⅠOccludin/GAPDHp62/GAPDHClaudin-2/GAPDH正常组0.58±0.150.47±0.100.45±0.130.73±0.130.19±0.100.58±0.07模型组0.31±0.131）0.24±0.121）0.20±0.051）0.42±0.101）0.82±0.381）0.98±0.151）SASP组0.312 50.52±0.112）0.58±0.122）0.32±0.072）0.55±0.140.47±0.142）0.77±0.122）人参败毒散高剂量组31.20.40±0.110.45±0.132）0.34±0.062）0.54±0.080.30±0.072）0.80±0.102）人参败毒散中剂量组15.60.56±0.132）0.53±0.082）0.46±0.082）0.69±0.122）0.27±0.062）0.72±0.112）人参败毒散低剂量组7.80.64±0.122）0.50±0.092）0.40±0.062）0.48±0.080.39±0.112）0.76±0.122）10.13422/j.cnki.syfjx.20222142.F003图3大鼠结肠组织p-AMPK、p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ、Occludin、p62、Claudin-2蛋白表达电泳Fig. 3Electrophoresis of p-AMPK， p-ULK1， LC3BⅡ/Ⅰ， Occludin， p62 and claudin-2 proteins in colon tissue of rats4 讨论UC因其病程缠绵、病情反复、常规治疗欠佳，故属消化系统难治性疾病之一［17］。据临床回顾性研究报道近10年UC的累计复发风险可达80%［18］，其中有近半数患者需住院治疗［19］，而国内UC确诊人数近10年内增至3.08倍［20］。目前UC发病机制未明，涉及遗传、免疫、心理等多方面因素影响，其病理表现为肠黏膜持续性炎性损伤。自噬是细胞进化过程中一种高度保守的分子过程［21］，其通过分解、代谢、清除异常细胞器来维护自身稳态［22］。有证据表明自噬功能变化在UC疾病进程中发挥重要作用［23］。一旦自噬功能出现障碍，肠道内部稳态被破坏，进一步加剧肠道黏膜屏障的损伤［24-25］。目前研究认为AMPK/ULK1通路介导自噬相关进程［26-28］，AMPK通过协同ULK1磷酸化以调控机体自噬水平［29］，维持细胞稳态。AMPK为真核细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［30］，以高度保守性为特征，其通过调节能量代谢以实现细胞能量稳态，是参与细胞自噬的关键因素之一。AMPK活化后，通过结合磷酸化后的UNK1［31］位点（Ser317、Ser555、Ser777）形成AMPK/ULK1复合物，进一步促进下游相关自噬通路的启动，调控自噬体的成核过程。LC3是自噬的特异性蛋白，LC3亚型比值（LC3Ⅱ/Ⅰ）与自噬体的数量呈正比［32］，即LC3Ⅱ/Ⅰ越高，细胞自噬水平越高。p62通过识别泛素链与LC3结合参加自噬启动进程，其表达水平与自噬活化程度呈反比［33］，即自噬激活时p62表达下调。有研究发现当LC3Ⅱ/Ⅰ降低时，TJ蛋白Occludin、Claudin-1、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）表达水平下调，肠黏膜屏障则受损［34］。TJ蛋白为肠道机械屏障的标志性蛋白。在肠道炎症发生时，TJ蛋白Claudin-2表达增加［35］。而自噬通过降解Claudin-2的溶酶体能改善肠上皮TJ通透性，增强肠道屏障作用［36］。此外，白藜芦醇通过促进自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1表达，能有效减轻肠道机械屏障损伤，改善肠道通透性，上调TJ蛋白Occludin、ZO-1水平［37］。人参败毒散为“逆流挽舟”法之代表方［38］，方以羌活、独活、柴胡、前胡等诸风药为核心，又伍手经肺药如枳壳、桔梗，足经脾胃药人参、茯苓等，其意在提领邪气透达于表，逆挽下陷之清阳，使邪浊去而清阳升，清浊复位，则气血自清，肠腑功能得以恢复，下利遂止。课题组前期发现人参败毒散对UC模型大鼠黏膜屏障损伤具有较好的修复作用，能有效降低结肠组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达［9］。基于此，课题组提出：人参败毒散的黏膜修复作用与细胞自噬相关。为此，笔者检测了UC模型大鼠自噬相关蛋白p-AMPK、p-ULK1、LC3BⅡ/Ⅰ、p62，发现p-AMPK、p-ULK1蛋白水平及LC3Ⅱ/Ⅰ比值下调，而p62蛋白表达上升。同时，UC模型大鼠Occludin表达降低，而Claudin-2表达上升，提示UC模型大鼠肠道黏膜损伤时，自噬功能受到抑制。与模型组比较，各治疗组经人参败毒散干预后，p-AMPK、p-ULK1蛋白活化水平、Occludin及LC3Ⅱ/Ⅰ表达上升，p62、Claudin-2表达下调，以人参败毒散中剂量组疗效最佳，提示人参败毒散可能通过AMPK/ULK1通路启动细胞自噬，加速LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，促进自噬体形成，从而修复肠道黏膜屏障，减轻结肠组织损伤程度。前期研究证明中剂量优于高、低剂量，能有效缓解UC的肠道黏膜损伤［8-9］。在本实验中，人参败毒散中剂量组达到修复黏膜屏障、减轻肠道损伤的最佳疗效。这可能与人参败毒散属祛邪剂主要作用相关。正如《本草思辨录》言：“因人参败毒散虽有人参，究属劫剂”。UC因风湿毒内陷肠胃，正气受伤，轻剂不足以逐邪，重剂又增损正气。败毒散虽有人参，主辅正以止大队风药行耗，又兼使鼓舞阳气，升阳举陷，托毒以劫邪，即是“辅正匡邪”之义。故人参败毒散中剂量组为原方剂量换算而成正符合此义。其具体机制，本课题后续实验将进行研究分析。综上所述，人参败毒散能改善肠道黏膜屏障功能，减轻结肠组织损伤程度。其机制可能与激活AMPK/ULK1自噬通路有关，通过启动自噬以恢复肠上皮细胞自身稳态，改善肠黏膜的通透性，从而促进肠黏膜屏障损伤后修复，发挥对UC的治疗作用。