流感病毒性肺炎是由于机体感染流感病毒引起，其传染率高，流行面广，死亡率高，以甲型流感病毒变异性最强［1］。目前市面上常用的两类抗流感药物，M2离子通道阻滞剂（如金刚烷胺、金刚乙胺）和神经氨酸酶抑制剂（如扎那米韦、奥司他韦）［2］，但这两类药物长期使用极易产生耐药性［3］。近年来全球几乎所有季节性甲型流感病毒（H1N1、H3N2）对烷胺类药物耐药［4］，世界卫生组织（WHO）西太平洋地区的监测数据也显示中国的季节性甲型H1N1流感病毒的奥司他韦耐药株比例已达28%［5］。耐药性及副作用大困扰着现有抗流感病毒药物治疗［6］，因此，需要寻找一种安全有效的抗流感药物。流感病毒性肺炎属于中医“外感”疾病的范畴，中医辨证施治的特点在治疗流感方面显现出一定的优势。桂枝加葛根汤（GGT）始载于张仲景的《伤寒论》，由桂枝、葛根、白芍、生姜、甘草、大枣6味中药组成，用于治疗风寒客于太阳经输、营卫不和等证。临床上，GGT可用于小儿外感风寒所致发热，兼有呕吐、腹泻等症状的治疗［7］。课题组前期研究发现GGT能够缓解H1N1流感病毒引起的小鼠肺部炎症损伤，降低肺指数及肺表面活性蛋白（SP）-A、SP-D等的表达水平［8］。尽管已有学者对GGT的物质基础进行了研究与表征［9-10］，但依据中药经口给药的特点，只有进入血液、靶器官的化学成分或其代谢产物才有可能发挥药效。因此，有必要对GGT入血及入靶器官的成分进行检测。课题组基于中药血清药物化学方法，采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）对小鼠口服GGT后血清及肺组织中方剂原型及其代谢成分进行分析，基于这些化合物，利用网络药理学手段，对GGT干预流感病毒性肺炎的潜在机制进行探索。通过比较GGT入血及入肺的原型及代谢成分，筛选GGT干预H1N1流感病毒性肺炎的潜在功效组分，并通过网络药理学及代谢通路富集分析预测干预疾病的靶点与通路。1 材料Thermo Fisher UltiMate 3000型超高效液相色谱系统，Thermo Fisher Q-Exactive Orbitrap型高分辨质谱仪、ST16R型高速离心机（美国Thermo fisher公司），SCIENTZ-48型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。葛根、桂枝、白芍、炙甘草、大枣（安徽协和成药业饮片有限公司，批号分别为19030709、18112305、19022008、19031710、18052420），生姜购自济南匡山市场，由山东中医药大学徐凌川教授鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》要求。甘草酸、异甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草素对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号分别为G-004-171219、Y-120-161216、Q-093-171011、Y-008-161216，纯度均≥98%），甲醇、乙腈为质谱纯，其余试剂均为分析纯。SPF级雄性BALB/c小鼠12只，4周龄，体质量16~18 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2021-0006。动物实验在山东中医药大学中药抗病毒协同创新中心进行，饲养温度（22±2）℃，相对湿度40%~60%。本研究经山东中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，伦理编号SDUTCM20220908001。2 方法2.1　GGT提取物的制备称取葛根12 g、桂枝6 g、白芍6 g、炙甘草6 g、大枣7 g、生姜9 g，根据课题组前期工艺优化结果进行GGT制备［11］，即第1次加入10倍量水加热回流提取1.5 h，第2、3次分别为8倍量水提取1 h，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥即得GGT提取物（得率为30.09%）。2.2　血清及肺组织样品供试品溶液的制备Balb/c小鼠随机分为空白组和GGT组（n=6），适应性饲养3 d后，连续灌服GGT提取物水溶液（36 g·kg-1·d-1）5 d，1次/d，末次灌胃1 h后麻醉小鼠。摘眼球取其外周血并解剖取其肺组织。外周血4 000 r·min-1离心20 min（离心半径10 cm，下同），取上清合并。肺组织以45 Hz进行组织匀浆90 s。分别取正常组和GGT组小鼠血清700 μL、肺组织匀浆500 mg，各加入甲醇-乙腈（1∶1）溶液4 mL，涡旋2 min，超声2 min （220 W，60 kHz），静置10 min取上清液，4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min，取上清，上清液室温下氮气吹干，加入甲醇200 μL复溶，4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min，取上清，经0.22 μm滤膜过滤，即得血清及肺组织供试品溶液。2.3　对照品溶液的制备取甘草酸、甘草苷、异甘草苷、芹糖异甘草苷和异甘草素对照品各约10 mg，精密称定，用甲醇溶解得质量浓度分别为0.220、0.216、0.218、0.224、0.216 g·L-1的混合对照品溶液。2.4　色谱条件采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流动相0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，3%~16%B；20~30 min，16%~40%B；30~40 min，40%~50%B；40~40.1 min，50%~98%B；40.1~45 min，98%B），流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量5 μL。2.5　质谱条件电喷雾离子源（ESI），正负离子监测模式，裂解电压3.0 kV，辅助气流量10 mL·min-1，离子传输管温度350 ℃，辅助气温度350 ℃，Full MS分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500，扫描范围m/z 80~1 200。MS/MS模式时，负离子模式下的碰撞能为30、50、70 eV，正离子模式下的碰撞能为10、30、50 eV。2.6　样品检测按2.2项下方法制备空白组及GGT组小鼠血清及肺组织的供试品溶液，按2.4和2.5项下条件对GGT提取物水溶液、空白组血清、空白组肺组织、GGT组血清及GGT组肺组织供试品溶液进行分析。2.7　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析利用SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）对同时存在于小鼠给药血清及给药肺组织中的GGT成分进行靶点检索，并对检索的结果去重得GGT功效组分的靶点。利用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）输入“Influenza viral pneumonia”关键词进行检索，得疾病靶点。将功效组分与流感病毒性肺炎共有的靶点输入STRING数据库构建PPI网络，并通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析。2.8　通路富集分析利用Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）在线分析工具对GGT干预流感病毒性的潜在通路进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集与统计分析。2.9　数据处理使用Xcalibur 3.0软件进行质谱数据处理，分析色谱图及各色谱峰信息，结合已报道文献和对照品信息，对GGT组和空白组小鼠血清及肺组织样品进行原型成分和代谢物的检测和分析。3 结果3.1　化学成分表征各组正、负离子模式下的总离子流图见增强出版附加材料。同时存在于小鼠给药血清及肺组织中且不存在于空白样本中的GGT成分被认为是潜在的功效组分。通过对照品比对，并结合相关文献报道，给药血清中共鉴定出57个移行成分，包括29个原型成分和28个代谢产物，其中11个原型成分（水杨酸、原儿茶醛、丹皮酚、葛根素、7-甲氧基香豆素、东莨菪内酯、大豆苷元、异甘草素、邻甲氧基肉桂醛、刺芒柄花素、β-紫罗兰酮）及4个代谢产物（葛根素水解产物、甘草酸水解产物、桂皮醛的还原产物及羟基化产物）同时在GGT组血清及肺组织中被鉴定得到。见表1、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230964.T001表1GGT吸收入血及入肺原型成分Table 1Prototype components of GGT absorbed into blood and lungsNo.tR/min化合物分子式离子模式m/z实测值δ/ppm碎片离子来源P14.06邻苯三酚［12］C6H6O3［M+H］+127.039 00.231109.101 4、85.065 3、67.054 9、55.055 1cP22）4.32没食子酸甲酯［13］C8H8O5［M+H］+185.115 38.754167.106 2、149.096 1、125.985 8bP32）4.67水杨酸［14］C7H6O3［M+H］+139.111 60.355121.101 2、93.070 4、69.034 2cP42）5.03原儿茶醛［15］C7H6O3［M+H］+139.111 61.003121.101 3、93.070 3、69.034 2bP52）5.65丹皮酚［14］C9H10O3［M+H］+167.069 1-6.948149.095 7、125.986 1、121.084 3cP62）13.90葛根素［16］C21H20O9［M+H］+417.117 8-0.572399.107 0、381.096 2、363.085 5、297.075 1、267.064 6、255.065 3aP714.0 9大豆苷［17］C21H20O9［M+H］+417.116 4-1.939381.095 9、363.085 1、335.090 4、297.075 1、267.064 5aP815.083′-甲氧基大豆苷［18］C22H22O10［M-H］-445.113 50.607283.063 7、225.054 2aP915.263′-甲氧基葛根素［19］C22H22O10［M-H］-445.113 92.172310.048 2、282.053 1aP1015.65葛根素芹菜糖苷［18］C26H28O13［M-H］-547.14612.637295.060 8、267.066 0aP1115.84葛根素-6″-O-木糖苷［16］C26H28O13［M+H］+549.159 7-1.033417.118 1、297.075 1、267.064 5aP1219.22牡荆苷［20］C21H20O10［M+H］+433.112 21.670257.080 2、137.023 2cP131）20.57芹糖甘草苷C26H30O13［M-H］-549.159 7-0.978255.065 8、135.007 2、119.048 4dP1420.60乔松素［14］C15H12O4［M+H］+257.079 73.172147.044 0、137.023 3、119.049 1dP152）22.957-甲氧基香豆素［21］C10H8O3［M+H］+177.054 5-0.738134.096 2、106.069 8bP161）23.96异甘草苷C21H22O9［M-H］-417.116 22.281135.043 6、121.027 9dP172）24.03东莨菪内酯［14］C10H8O4［M+H］+193.049 1-2.151175.147 8、147.116 9、133.101 4dP181）24.13甘草苷C21H22O9［M-H］-417.119 02.281135.043 7、119.048 6dP1924.84对羟基苯乙醇［21］C8H10O2［M+H］+139.111 60.963121.101 2、95.086 0bP2025.68黄杞苷［14］C21H22O10［M+H］+435.128 01.318153.054 5、107.049 4dP212）26.25大豆苷元［22］C15H10O4［M+H］+255.231 3-1.981237.054 3、227.069 9、137.023 2aP221）26.19甘草素C15H12O4［M-H］-255.066 03.939153.018 1、135.007 4、119.048 6dP232）31.39邻甲氧基肉桂醛 ［23］C10H10O2［M+H］+163.075 2-1.203135.117 0、121.100 7、93.070 2、79.054 7bP242）31.46刺芒柄花素［24］C16H12O4［M+H］+269.080 3-1.915254.052 8、226.062 1、213.090 8cP251）32.12甘草酸C42H62O16［M-H］-821.396 70.609645.363 0、469.331 0、351.056 4、113.022 8、99.007 0、85.027 7、71.012 1dP2632.51吐昔酸［25］C18H16O4［M-H］-295.097 83.389277.086 3、233.096 4、205.101 6、147.043 5cP272）32.66β-紫罗兰酮［26］C13H20O［M+H］+193.158 2-2.702149.132 2、133.102 1、109.085 5、135.116 9、105.070 3、79.054 7eP2837.79甘草次酸单葡萄糖醛酸苷［27］C36H54O10［M-H］-645.363 80.775469.333 1、102.955 1、75.007 0dP2926.12仙茅苷［14］C22H26O11［M+Na］+489.138 33.271123.048 3、107.049 4d注：1）与对照品对比确认；2）存在于肺组织的化合物；a.葛根；b.桂枝；c.白芍；d.甘草；e.生姜（表2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20230964.T002表2GGT血清及肺组织代谢成分Table 2Metabolic components of GGT in serum and lung tissueNo.tR/min化合物分子式离子模式m/z实测值δ/ppm碎片离子来源M110.64葛根素的羟基化+硫酸化产物C21H20O13S［M-H］-511.055 83.326431.097 4、266.057 4、119.945 1aM214.91葛根素的羟基化+甲基化产物C22H22O10［M-H］-445.112 90.023325.071 8、283.057 1aM320.30葛根素的还原+硫酸化产物C21H22O12S［M-H］-497.076 02.414451.331 1、417.119 1aM423.30葛根素的甲基化产物C22H22O9［M-H］-429.118 20.466295.058 0、265.050 2aM525.00葛根素的水解+甲基化+硫酸化产物C18H14O8S［M-H］-389.031 13.856321.043 5aM625.45葛根素的还原产物C21H22O9［M-H］-417.120 35.565269.045 4、121.027 9aM725.74葛根素的水解+葡萄糖醛酸化产物C22H20O10［M+H］+445.111 9-2.247269.080 2、114.091 3aM825.75葛根素的水解+葡萄糖醛酸化产物C22H20O10［M-H］-443.098 42.483267.066 1、252.042 2aM926.10葛根素的水解+还原+葡萄糖醛酸化产物C23H22O11［M+H］+475.123 1-0.842299.090 8、284.066 8aM1028.23葛根素的水解+硫酸化产物C16H12O7S［M-H］-347.023 13.170267.066 2、223.038 3aM122）31.46葛根素的水解产物C16H12O4［M+H］+269.080 3-1.858255.059 0、223.09 84aM1318.86甘草苷的水解+葡萄糖醛酸化产物C21H20O10［M+H］+433.112 2-1.616257.080 4、119.049 1dM1419.09甘草苷的水解+葡萄糖醛酸化产物C21H20O10［M-H］-431.098 12.414255.065 8、135.007 2、119.048 6dM1526.40甘草苷的羟基化产物C21H22O10［M-H］-433.113 61.616255.066 7、137.015 0，119.048 7dM1626.47甘草苷的羟基化产物C21H22O10［M+H］+435.128 0-1.379137.059 6、119.049 2dM1728.06甘草苷的水解+硫酸化产物C15H12O7S［M-H］-335.023 33.880255.065 9、137.010 7、119.048 6dM1837.79甘草酸的水解产物C36H54O10［M-H］-645.363 80.775469.333 1，113.022 8、99.007 2、85.027 8、71.012 0dM192）38.64甘草酸的水解产物C36H54O10［M+H］+647.378 2-1.236471.346 3、86.969 0、73.029 1dM2038.53甘草酸的水解+还原+去甲基化产物C35H54O13S［M-H］-713.322 63.505469.332 1、425.342 7、283.263 8dM2142.35甘草酸的水解+去甲基化产物C29H44O4［M-H］-455.316 92.855411.325 7、223.133 1dM2242.47甘草酸的水解产物C30H46O4［M-H］-469.331 81.278425.342 8、405.318 5dM2342.86甘草酸的水解+还原+去甲基化产物C28H44O4［M-H］-443.318 24.963399.325 3、381.316 1dM2443.30甘草酸的水解+还原产物C30H48O4［M-H］-471.276 51.697427.358 4、409.347 9dM251.97肉桂酸的羟基化产物C9H8O4［M-H］-179.034 42.973135.043 7、122.892 6、109.699 1bM262.16肉桂酸的还原+羟基化产物C9H9O4［M-H］-165.054 3-1.818119.048 5、103.038 4bM272）2.20肉桂醛的还原产物C9H10O［M+H］+135.080 40.001105.070 2，79.054 7bM282）3.51肉桂醛的羟基化产物C9H8O2［M+H］+149.059 5-1.342120.080 8、107.049 4、94.073 5b3.1.1　原型成分的鉴定在GGT组小鼠血清中共鉴定出的29种原型成分中，11种在给药肺组织中发现，下面举例说明化合物的鉴定过程。P2的准分子离子峰为m/z 185.115 3 ［M+H］+，推测分子式为C8H8O5。根据其分子式推测化合物含有苯环结构，准分子离子通过连续丢失2分子H2O，分别得到碎片离子m/z 167.106 2和m/z 149.096，说明结构中含羟基；此外，化合物失去C2H3O2形成离子m/z 125.985 8，说明结构中可能含有羧甲基结构。结合文献报道［13］，推测该化合物为没食子酸甲酯。P6的准分子离子峰为m/z 417.117 8 ［M+H］+，推测分子式为C21H20O9。准分子离子丢失一系列H2O形成碎片离子m/z 399.107 0，m/z 381.096 2和m/z 363.085 5，说明结构中存在多个羟基；m/z 297.075 1 ［M+H-H2O-C4H6O3］+为化合物发生糖降解及丢失1分子H2O后形成的碎片离子，根据文献报道［16］，鉴定P6为葛根素，裂解途径见增强出版附加材料。P15的准分子离子峰为m/z 177.054 5 ［M+H］+，推测分子式为C10H8O3。准分子离子失去C2H3O得到碎片离子m/z 134.096 2，说明化合物可能含有甲基和羰基或甲氧基；继续失去中性碎片CO形成离子m/z 106.069 8。结合文献报道［21］，P15被初步鉴定为7-羟基香豆素。利用类似方法，且对照品比对，P18、P25被鉴定为甘草苷和甘草酸。P17准分子离子峰为m/z 193.049 1 ［M+H］+，推测分子式为C10H8O4。准分子离子脱水，得m/z 175.147 8，再失去中性碎片CO，得m/z 147.116 9；继续失去CH2形成碎片离子m/z 133.101 4。结合文献报道［14］，鉴定P17为东莨菪内酯。P21准分子离子峰为m/z 255.231 3 ［M+H］+，推测分子式C15H10O4。准分子离子脱水，形成碎片离子m/z 237.054 3；失去1分子CO形成碎片离子m/z 227.069 9；失去碎片C8H6O，形成m/z 137.023 2，结合文献报道［22］，P21鉴定为大豆苷元。P24的准分子离子峰为m/z 269.080 3 ［M+H］+，确定分子式为C16H12O4。准分子离子失去CH3得到碎片离子m/z 254.052 8，继续失去1分子CO形成m/z 226.062 1 ［M+H-CH3-CO］+；碎片离子m/z 161.370 1 ［M+H-C7H8O］+为化合物失去-C7H8O所得，推测P24有可能含有芳环，且芳环上可能有甲氧基取代。基于获得的数据，结合文献报道［24］，判断P24为刺芒柄花素。3.1.2　代谢产物的鉴定在给予GGT的小鼠血清中鉴定出28个代谢产物，其中4个代谢产物在小鼠GGT组肺组织中检出。主要代谢途径包括还原、羟基化、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等。由M6的准分子离子峰m/z 417.120 3 ［M-H］-，推测其分子式为C21H22O9，比葛根素（C21H20O9）多2 Da，碎片离子m/z 269.045 4由该产物发生糖降解脱去C5H8O5后得到，裂解规律与葛根素中碎片离子m/z 267.064 6类似，故推测M6为葛根素的还原产物，但具体还原位置未确定。M24的准分子离子峰m/z 471.347 7 ［M-H］-，比M22多2 Da，且其产生碎片离子峰均比M22多2 Da，推测M24为M22的还原产物。M27的准分子离子峰为m/z 135.080 4 ［M+H］+推测化学式为C9H10O，比肉桂醛（C9H8O）多2 Da，离子碎片m/z 105.070 2为肉桂醛结构失去CO形成，m/z 79.054 7为肉桂醛结构脱去C3H2O侧链得到，故推测M30为肉桂醛的还原产物。代谢途径见增强出版附加材料。根据M15和M16准分子离子峰推测二者具有相同分子式C21H22O10，比P18甘草苷（C21H22O9）多16 Da。m/z 255.066 7为P18发生糖降解脱去碎片C6H10O5（162 Da）及一个氧原子所得；M15和M16均发生RDA裂解产生碎片C8H7O（m/z 119.048 7）及C7H5O3（m/z 137.015 0），裂解规律与甘草苷相同，故推测M15和M16分别为甘草苷在负离子和正离子模式下的羟基化产物。M25在负离子模式下准分子离子峰m/z 179.034 4 ［M-H］-，推测分子式为C9H8O4，比桂皮酸（C9H8O2）多32 Da（2O），推测其为桂皮酸的双羟基化产物。碎片m/z 135.043 7为M25脱去羟基化的桂皮酸结构中的COO（44 Da）产生，再脱去支链的CH（13 Da）得到碎片m/z 122.892 6，再次脱去与苯环相连的CH产生m/z 109.699 1，得到双羟基化的单取代苯环结构，因此，M25为桂皮酸的双羟基化产物。此外，M28的准分子离子峰m/z 149.059 5 ［M+H］+，比肉桂醛多16 Da，在碎片离子中，具有脱去醛基及一系列CH的离子峰，如m/z 120.080 8 ［M+H-CHO］+，m/z 107.049 4 ［M+H-CHO-CH］+和m/z 94.073 5 ［M+H-CHO-CH-CH］+，根据碎片信息可得出M31为肉桂醛的羟基化产物。代谢途径见增强出版附加材料。M4的准分子离子峰m/z 429.118 2 ［M-H］-，与该模式下的葛根素相比多了14 Da（CH2），推测其可能为葛根素的甲基化产物。m/z 295.058 0为化合物脱去CH2、H2O及C4H6O3产生；m/z 265.050 2为化合物脱去CH2及C5H10O5所得，该裂解规律与葛根素类似。故认为M4为葛根素的甲基化产物。糖苷类化合物在体内容易发生降解，可脱去1个或多个糖基，亦可脱去糖基的一部分。根据M18及M19的准分子离子峰m/z 645.363 8 ［M-H］-和m/z 647.378 2 ［M+H］+可推测出二者具有相同的分子式C36H54O10，且M18的准分子离子峰与甘草酸失去1分子葡萄糖后的碎片离子相同，且两者具有相似的裂解规律，产生相同的碎片离子如m/z 113.022 8 ［M-H-C6H8O6-C24H36O2］-、99.007 2 ［M-H-C6H8O6-C24H36O2-CH2］-、85.027 8 ［M-H-C6H8O6-C24H36O2-2CH2］-、71.012 0 ［M-H-C6H8O6-C24H36O2-3CH2］-，故推测M18为甘草酸脱去1分子葡萄糖的降解产物；同理，M19为甘草酸在正离子模式下脱去1分子葡萄糖的降解产物。代谢途径见增强出版附加材料。多步代谢反应会产生复杂的代谢产物，如M12的准分子离子峰m/z 269.080 3 ［M+H］+与葛根素m/z 417.117 8 ［M+H］+在丢失1分子中性糖碎片C5H8O5（148 Da）后产生的碎片离子峰相同，且与葛根素具有相似的裂解规律，产生碎片离子m/z 255.059 0 ［M+H-CH2］+、223.09 84 ［M+H-2CH2-H2O］+，推测M12为葛根素的水解产物；根据M7和M8的准分子离子峰m/z 445.111 9 ［M+H］+与m/z 443.098 4［M-H］-，推测二者具有相同的分子式C22H20O10，在其碎片离子中均出现了葛根素的水解产物M12，且两个化合物的准分子离子峰分别比M12多176 Da（C6H8O6）和174 Da（C6H6O6），故推测M7和M8分别为正负离子模式下葛根素的水解+葡萄糖醛酸化产物。代谢途径见增强出版附加材料。3.2　PPI网络的构建利用SwissTargetPrediction数据库对同时存在于小鼠给药血清及给药肺组织中15个功效组分的相关靶点进行检索，共检索到567个靶点，去除重复值后得271个靶点；利用GeneCards数据库输入“Influenza viral pneumonia”关键词进行检索，得1 677个疾病靶点，两者取交集得88个共有靶点。将GGT的15个功效成分与疾病共有的88个靶点输入STRING数据库构建PPI网络，并通过Cytoscape 3.7.2进行可视化。该网络涉及88个节点，1 522条边。度值评分前10位的靶点基因分别是白蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、类固醇受体辅助活化因子（SRC）、Toll样受体4（TLR4）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、环加氧酶2（PTGS2）、人雌激素受体1（ESR1）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、一氧化氮合酶3（NOS3）、MMP2。3.3　KEGG富集分析将GGT干预流感病毒性肺炎的88个靶标基因利用Metascape在线分析工具进行KEGG富集分析，GGT干预流感病毒性肺炎的靶基因主要涉及核转录因子-κB（NF-κB）、黏附连接等信号通路。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230964.F001图1GGT干预流感病毒性肺炎的KEGG通路富集分析Fig. 1KEGG pathway enrichment analysis of GGT in interfering with influenza viral pneumonia4 讨论本文采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS在正、负离子模式下对GGT提取物及不同组小鼠的血清及肺组织样本进行检测分析，选择GGT中共同存在于给药血清及给药肺组织的化合物作为GGT干预流感病毒性肺炎的功效成分。推测11个原型成分（水杨酸、原儿茶醛、丹皮酚、葛根素、7-甲氧基香豆素、东莨菪内酯、大豆苷元、异甘草素、邻甲氧基肉桂醛、刺芒柄花素、β-紫罗兰酮）及4个代谢产物（葛根素水解产物，甘草酸水解产物，桂皮醛的还原产物及羟基化产物）为潜在功效成分。据报道，其中的葛根素及大豆苷元具有直接抗甲型H1N1流感病毒的作用［28］；来源于桂枝的原儿茶醛，具有良好的抗炎作用，能够抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活的NF-κB和转录激活因子-1（AP-1）的DNA位点，特异性下调TNF-α诱导的血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1），二者均是与炎症相关的靶点基因，下调该类因子能够缓解机体因病毒感染引起的炎症损伤［29］；异甘草素是甘草中所含的查尔酮类化合物，同样具有抗炎生物学活性［30-31］；此外，复方中桂枝挥发油和桂皮醛具有广谱的抗病毒作用，作用机制与激活TLR7信号通路和诱导β干扰素（INF-β）的高表达有关［32-33］。因此，GGT治疗流感病毒性肺炎的机制可能与直接抗病毒和干预炎症反应有关。本研究利用网络药理学预测了GGT中功效组分干预流感病毒性肺炎的潜在靶点及通路，发现主要涉及TLR4、PTGS2、ALB、SRC等靶点及NF-κB等信号通路。研究表明，机体受到外界刺激后，TLR4会与相应配体结合，释放TLR4/NF-κB信号轴上相关蛋白，进一步促进下游促炎因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ的成熟和释放［34］，造成机体炎症。感染流感病毒的小鼠肺组织NF-κB p65及TLR4的表达显著增高［35］，表明TLR4能够参与介导流感病毒诱导的急性肺损伤［36］，此外，PPI预测得到PTGS2及ALB具有抗炎、抗氧化的作用，水平变化与机体炎症程度密切相关［37-38］。综上所述，存在于小鼠含药血清及肺组织中的11个原型成分及4个代谢产物是GGT干预流感病毒性肺炎的潜在功效组分，作用机制可能涉及ALB、SRC、TLR4等靶点及NF-κB等信号通路，该研究为GGT后续具体作用机制研究提供理论指导。