糖尿病肾病（DKD）作为糖尿病最主要的微血管并发症之一，其在临床上以持续性白蛋白尿和（或）肾小球滤过率进行性下降为主要特征，是进展为终末期肾脏疾病（ESRD）的重要原因［1］。近年来，随着糖尿病发病率升高，作为重要靶器官的肾脏损害逐渐增多，据统计约有40%的糖尿病患者可发展为DKD患者，给家庭及社会均带来沉重的负担［2］。因此，如何早期防治DKD，探索有效的治疗方案，具有重要的临床及社会意义。研究表明，DKD与代谢紊乱及转录失衡密切相关，纠正代谢紊乱及转录失衡可有效改善DKD［3-4］。中医认为DKD病机总以脾肾亏虚为本［5］，治疗上重在益肾补脾。临床常用药物益肾化湿颗粒，来源于李东垣《脾胃论》中的名方“升阳益胃汤”，由人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜及大枣组成，功擅升阳补脾，益肾化湿，利水消肿［6］。课题组前期研究及Meta分析发现益肾化湿颗粒能有效降低慢性肾小球肾炎患者尿蛋白，其主要成分人参、黄芪具有改善肾脏病模型大鼠血清代谢、调节转录等作用［7-8］。临床研究中也发现其可调节DKD患者炎症反应、氧化应激、内皮功能及脂质代谢，降低蛋白尿、改善肾功能［9-10］。但益肾化湿颗粒通过调控代谢与转录改善DKD的具体作用机制尚未完全阐明。因此，本研究基于超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）及高通量转录组测序技术（RNA-seq），分析益肾化湿颗粒干预后DKD大鼠血清代谢物及肾脏mRNA的变化，并采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）对差异mRNA及差异蛋白的表达进行验证，探寻益肾化湿颗粒通过调节代谢-基因共表达改善DKD的具体机制，为药物的临床应用提供依据。1 材料1.1　动物SPF级SD大鼠24只，雄性，4周龄，体质量（260±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［合格证号SCXK（鲁）20190003］。饲养于山东中医药大学附属医院SPF级动物实验室，室温（22±2） ℃，12 h光照/12 h昼夜交替，自由饮食。本文所涉及的动物实验经山东中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准（伦理批号2020-34）。1.2　药物及试剂益肾化湿颗粒（广州康臣药业有限公司，规格10g/袋，批号Z20090250），链脲佐菌素（北京索莱宝科技有限公司，批号S8050），尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、尿蛋白及尿肌酐测定试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，批号分别为C010、C011、C061、C063、C008、C074），β2-微球蛋白（β2-MG）、胱抑素-C（Cys-C）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）及白细胞介素-6（IL-6）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（江苏晶美生物技术有限公司，批号分别为210129KE10、210129KE5、210129KE9、210129KE7），苏木素-伊红（HE）染液套装、马松（Masson）染液套装、过碘酸雪夫反应（PAS）染液套装、RIPA裂解液、蛋白定量法（BCA）检测试剂盒、增强型化学发光（ECL）试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G、鼠源β-肌动蛋白（β-actin）抗体、兔源前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G1003、G1006、G1008、G2002、G2026、G2014、GB23303、GB12001、GB11077-2），兔源细胞质磷酸酶1（Phospho1）抗体、兔源线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶（Gpam）抗体、兔源Akr1b10抗体、兔源Ugt2b35抗体（英国Abcam公司，批号分别为AB101520、AB69990、AB192865、AB154864），兔源腺苷酸环化酶3（ADCY3）抗体、兔源过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶2（Acox2）抗体（江苏亲科生物有限公司，批号分别为DF2370、DF9154），SPARKeasy组织/细胞RNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒及SYBR定量试剂盒（山东思科捷生物技术有限公司，批号分别为AC0201、AG0304-B、AH0104-A），RNeasy Mini Kit（250）试剂盒（德国Qiagen公司，批号74106）。1.3　仪器Chemray 240型全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技），AB TripleTOF 6600 plus型高分辨质谱仪及AB ExionLC型高效液相色谱仪（美国AB Sciex公司），RT-6100型酶标仪（深圳雷杜生命科学有限公司），Light Cycler480 Ⅱ型Real-time PCR仪（瑞士Roche公司），Arktik Thermal Cycler 96孔型PCR仪（美国Thermo Scientific公司），SVE-2型垂直电泳仪及电源（武汉赛维尔生物科技有限公司）。UHPLC-MS/MS非靶向代谢组分析委托上海鹿明生物科技有限公司完成，肾脏mRNA测序委托上海鲸舟基因科技有限公司完成。2 方法2.1　分组及给药24只SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、益肾化湿颗粒组，每组8只。正常组给予普通饲料，模型组及益肾化湿颗粒组大鼠给予高糖高脂饲料喂养30 d后，腹腔注射链脲佐菌素构建DKD模型，以连续2次随机血糖≥16.7 mmol·L-1，尿微量白蛋白与尿肌酐比值（UACR）30 mg·g-1为造模成功标准［11］，成模后益肾化湿颗粒组给予益肾化湿颗粒5.54 g·kg-1·d-1灌胃［12］、正常组与模型组给予等量生理盐水，连续给药6周。2.2　血糖、血脂及肾功能指标检测实验期间，每周测量体质量，针刺尾静脉测血糖，均连续测量3次，取平均值。末次给药24 h后用3%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）对大鼠进行腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，分离血清，取一侧肾脏用液氮速冻，存于-80 ℃冰箱备用。ELISA检测大鼠血清Cys-C、IL-6、T-SOD及β2-MG，全自动生化分析仪检测SCr、BUN、UACR、TG及TC。2.3　大鼠肾脏HE、Masson及PAS染色将大鼠另一侧肾脏固定于中性多聚甲醛48 h，4 μm切片，石蜡包埋，进行HE、Masson与PAS染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察。2.4　血清UHPLC-MS/MS分析色谱条件：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温45 ℃，流速0.35 mL·min-1，流动相A-水（含0.1%甲酸），流动相B-乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱（0~2 min，95%A；2~4 min，95%~70%A；4~8 min，70%~50%A；8~10 min，50%~20%A，10~15 min，20%~0%A；15~16 min，0%~95%A）。质谱条件，采用正负离子扫描模式，帘气压力35 psi（1 psi≈6.895 kPa），雾化气与辅助气压力均为55 psi，离子源温度550 ℃，正离子模式喷射电压5.5 kV，负离子模式喷射电压-4.5 kV，去簇电压80 V，碰撞电压10 eV，质量扫描范围m/z100~1 000。应用Progenesis QI v2.3软件对数据进行基线过滤、保留时间校正及峰对齐等处理，与人类代谢组学数据库（HMDB，https：//hmdb.ca/）、脂质图结构数据库（LMSD，https：//www.lipidmaps.org/）和Metlin数据库（https：//metlin.scripps.edu）比对定性与定量代谢物。Meta X代谢组学数据处理平台（http：//metax.genomics.cn/）对数据进行无监督的主成分分析（PCA）和有监督的正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。根据OPLS-DA模型得到重要性投影（VIP），结合T检验的P值（VIP值1，且P0.05）筛选差异代谢物，采用z-score标准化法将其处理，根据Complete-Link参数进行聚类分析，应用Venny 2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）筛选共同代谢物并绘制韦恩图，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析差异代谢物的特异性和敏感性。2.5　代谢通路分析采用Metabo Analyst 5.0软件平台的通路分析功能对筛选出的代谢物进行通路分析，选择京都基因与基因组百科全书（KEGG），选择超几何分布、相对中心性，参考代谢组选择使用选定路径中的所有化合物，并绘制气泡图。2.6　肾脏mRNA测序及分析采用RNeasy Mini Kit（250）Qiagen试剂盒抽提总RNA，并对其定量，构建mRNA文库。进行序列过滤及比对后，采用Stringtie与TMM计算FPKM值以表征基因表达量，并计算差异表达倍数（FC），应用edgeR 3.30.3软件计算基因表达的Q值，根据Q值0.05且FC2或者FC0.5筛选差异基因，在R中利用Bioconductor包进行聚类分析，在Venny 2.1.0平台筛选共同基因绘制韦恩图，并通过KEGG对差异基因进行生物通路富集分析。2.7　Real-time PCR验证差异mRNA表达选择7个差异表达mRNA（ADCY3、Acox2、Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10、Ugt2b35）进行验证。使用SPARKeasy 组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取出mRNA，Nanodrop 2000微量分光光度计对RNA浓度及纯度进行测定。按照说明书使用反转录试剂盒在Arktik Thermal Cycler 96孔型PCR仪上将RNA逆转录合成第一链cDNA。在LightCycler 96仪器上进行PCR扩增，在95 ℃条件下预变性30 s；PCR条件为95℃变性5 s，随后60 ℃退火30 s，共45个循环；融解曲线为95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；降温为50 ℃ 30 s。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）来作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算mRNA表达的相对表达水平。具体信息见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列（5′-3′）长度/bpAcox2上游GGCTGCTAAGGCTTACTGCTACTTC下游AGAGGTCACAGAGGCGTTGGAG113ADCY3上游GTCGGTCTGGTGTTGGACATCATC下游TGAGCAGCCACAGCAGGTAGG150Phospho1上游TCTCATTTCGGATGCCAACACCTTC下游AGGATGCGGCGGAATAAACTGTG81Gpam上游CATCCAACACCATCCCTGACATCC下游GATAACGCCTCTTGCCACACTCC140PTGS2上游CACATTTGATTGACAGCCCACCAAC下游AGTCATCAGCCACAGGAGGAAGG114Akr1b10上游GCATCGTGGTCACAGCCTACAG下游TCTCCAGCAATACAGGGTCCTCAG81Ugt2b35上游ACCACCCACCTTAGGACCCAATAC下游TGGCTCCACCATGCGTTACAAAG104GAPDH上游ACAGCAACAGGGTGGTGGAC下游TTTGAGGGTGCAGCGAACTT1222.8　Western blot验证差异蛋白表达将各组大鼠的肾脏组织在RIPA裂解缓冲液中匀浆，离心（4 ℃，12 000 r·min-1，10 min，离心半径5.5 cm，下同）提取总蛋白，检测蛋白质浓度，电泳，转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。脱脂牛奶封闭30 min后，将膜与一抗β-actin、Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10、Ugt2b35、ADCY3（1∶1 000），Acox2（1∶500）在4 ℃下孵育。TBST洗膜后加入HRP标记的二抗（1∶5 000）共同孵育30 min，TBST洗膜后加入ECL试剂显影，使用Image J软件对蛋白条带灰度值进行统计分析。2.9　数据处理采用SPSS 26.0软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　体质量、血糖、血脂及肾功能指标与正常组比较，模型组大鼠体质量显著减轻（P0.01），血糖、UACR、BUN、Cys-C、TC、TG、IL-6、β2-MG显著升高（P0.01），T-SOD显著降低（P0.01）；与模型组比较，益肾化湿颗粒组大鼠体质量增加，上述指标均有显著改善（P0.01），3组SCr差异无统计学意义。见图1、表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.F001图1各组大鼠体质量、血糖及UACR变化Fig.1Changes of body mass，blood glucose and urinary protein/creatinine ratio of rats in each group注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.0110.13422/j.cnki.syfjx.20230565.T002表2益肾化湿颗粒对各组大鼠生化、炎症指标的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of Yishen Huashi granules on biochemical and inflammatory indexes of rats in each group （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1SCr/μmol·L-1BUN/mg·L-1CysC/mg·L-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1T-SOD/pg·L-1β2-MG/μg·L-1IL-6/pg·L-1正常组48.43±5.321.87±1.001.49±0.072.59±0.181.41±0.500.06±2.357.77±0.500.11±8.00模型组53.52±8.402.26±1.461）2.05±0.141）31.26±2.661）12.86±1.651）0.04±2.261）9.53±0.301）0.14±11.811）益肾化湿颗粒组5.5447.61±4.822.05±0.802）1.77±0.122）24.50±1.832）6.78±0.802）0.05±1.552）8.43±0.352）0.12±5.432）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01（表4、表5同）3.2　各组大鼠肾组织病理改变模型组大鼠肾脏HE及PAS染色显示，肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，肾小管空泡变性，Masson染色显示纤维组织增生，益肾化湿颗粒干预后，上述病理改变均有不同程度的减轻，见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.F002图2益肾化湿颗粒对各组大鼠肾脏组织病理的影响 （×400）Fig. 2Effect of Yishen Huashi granules on renal histopathology of rats in each group （×400）注：A.正常组；B.模型组；C.益肾化湿颗粒组（图3同）3.3　血清差异代谢物分析PCA结果显示，3组均可明显区分，OPLS-DA发现益肾化湿颗粒组与模型组的代谢模式亦明显分离，见增强出版附加材料。与模型组比较，正常组的差异代谢物有255个，其中共有115个上调，140个下调；与模型组比较，益肾化湿颗粒组有304个差异代谢物，其中共有186个上调，118个下调；对3组差异代谢物进行聚类分析发现139个差异代谢物在模型组紊乱并在益肾化湿颗粒干预后回调，具体见增强出版附加材料。对其进行代谢通路富集分析，共富集到鞘脂代谢、甘油磷脂代谢及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成等20条代谢通路，共涉及14个差异代谢物，具体信息见表3，通路富集分析气泡图见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.T003表3不同组间比较差异代谢物的信息Table 3Significantly different metabolites in comparison of each groups差异代谢物分子式离子模式m/z实测值tR/min变化趋势（X/Y）代谢通路植物鞘氨醇C18H39NO3［M+H］+318.300 79.37↓/↑鞘脂代谢鞘氨醇C18H37NO2［M+H］+300.289 310.41↓/↑鞘脂代谢二氢鞘氨醇C18H39NO2［M+H］+302.304 910.61↓/↑鞘脂代谢磷脂酰乙醇胺C7H12NO8PR2［M-H］-790.560 111.12↓/↑甘油磷脂代谢；糖基磷脂酰肌醇（GPI）-锚定生物合成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱C9H20NO7PR［M+H］+482.324 110.69↓/↑甘油磷脂代谢甘油磷酸胆碱C8H20NO6P［M+H］+258.110 50.78↑/↓甘油磷脂代谢；醚脂代谢12（13）-EpOMEC18H32O3［M+H］+297.242 011.59↑/↓亚油酸代谢L-酪氨酸C9H11NO3［M-H］-180.067 12.39↓/↑苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；泛醌和其他萜类-醌生物合成；苯丙氨酸代谢；酪氨酸代谢；氨酰-tRNA生物合成19（S）-HETEC20H32O3［M-H］-319.228 911.38↓/↑花生四烯酸代谢L-棕榈酰肉碱C23H45NO4［M+H］+400.341 810.93↓/↑脂肪酸降解7-羟基-4-胆甾烯-3-酮C27H44O2［M+H］+401.340 815.20↑/↓初级胆汁酸生物合成肌醇C6H12O6［M+Na］+203.052 80.80↑/↓抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢肌酸C4H9N3O2［M+H］+132.076 70.89↓/↑甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢尿酸C5H4N4O3［M-H］-167.021 81.30↑/↓嘌呤代谢注：X.模型组与正常组比较的变化趋势；Y.益肾化湿颗粒组与模型组比较的变化趋势；↑.表达水平上调；↓.表达水平下调3.4　肾脏差异mRNA分析与正常组比较，模型组共有379个差异mRNA，其中236个上调，143个下调；与模型组比较，益肾化湿颗粒组共有279个差异mRNA，其中100个上调，179个下调。对3组差异mRNA聚类分析发现，共有96个差异mRNA在模型组紊乱又被益肾化湿颗粒回调，见增强出版附加材料。进一步对96个差异mRNA进行KEGG富集分析，在前20条通路中，与糖脂代谢密切相关的通路被广泛富集，如甘油磷脂代谢、半乳糖代谢等，共有21个mRNA参与其中。见增强出版附加材料。3.5　差异代谢物与差异mRNA相关性结果显示，甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、初级胆汁酸生物合成、抗坏血酸和醛酸代谢及半乳糖代谢6条通路被差异代谢物及差异mRNA同时富集到，其中共涉及磷脂酰乙醇胺（PE）等7个差异代谢物及ADCY3等7个差异mRNA。详见增强出版附加材料。益肾化湿颗粒组中的差异代谢物PE、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱及19（S）-HETE含量上升，甘油磷酸胆碱（GPC）、7-羟基-4-胆甾烯-3-酮、肌醇（MYO）、尿酸（UA）含量降低；益肾化湿颗粒组中ADCY3、Acox2的mRNA相对表达量升高，Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10及Ugt2b35的mRNA相对表达量降低。见表3及增强出版附加材料。3.6　差异代谢物的预测价值与模型组比较，益肾化湿颗粒组中的7个差异代谢物，PE、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、19（S）-HETE、GPC、7-羟基-4-胆甾烯-3-酮、MYO及UA均表现出较高的预测准确性，见增强出版附加材料。3.7　肾脏差异mRNA及蛋白表达验证与正常组比较，模型组ADCY3和Acox2的mRNA相对表达量减少，Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10和Ugt2b35的mRNA相对表达量增加（P0.01）；与模型组比较，益肾化湿颗粒组中ADCY3和Acox2的mRNA相对表达量增加，Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10和Ugt2b35的mRNA相对表达量降低（P0.01），见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.T004表4益肾化湿颗粒对各组大鼠肾组织mRNA表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 4Effect of Yishen Huashi granules on mRNA expression in renal tissue of rats in each group （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1Phospho1GpamPTGS2ADCY3Acox2Akr1b10Ugt2b35模型组4.79±0.601）2.13±0.201）9.70±1.471）0.15±0.031）0.31±0.051）16.78±1.701）4.98±0.501）益肾化湿颗粒组5.542.55±0.572）1.45±0.272）4.47±0.252）0.29±0.012）0.61±0.052）8.18±0.622）2.70±0.162）注：正常组相关mRNA表达设为1与正常组比较，模型组中ADCY3和Acox2蛋白表达降低，Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10和Ugt2b35的蛋白表达升高（P0.01）；与模型组比较，益肾化湿颗粒组ADCY3和Acox2蛋白表达显著升高，Phospho1、Gpam、PTGS2、Akr1b10和Ugt2b35的蛋白表达均显著降低（P0.01）。见表5、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.T005表5益肾化湿颗粒对各组大鼠肾组织蛋白表达的影响 （x¯±s，n=8）Table 5Effect of Yishen Huashi granules on protein expression in renal tissue of rats in each group （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1Phospho1/β-actinGpam/β-actinPTGS2/β-actinADCY3/β-actinAcox2/β-actinAkr1b10/β-actinUgt2b35/β-actin正常组0.17±0.020.37±0.030.14±0.020.38±0.020.39±0.040.23±0.010.24±0.02模型组0.61±0.041）0.60±0.031）0.35±0.021）0.13±0.021）0.11±0.021）0.76±0.061）0.75±0.041）益肾化湿颗粒组5.540.30±0.052）0.39±0.032）0.24±0.012）0.27±0.022）0.26±0.022）0.41±0.012）0.45±0.032）10.13422/j.cnki.syfjx.20230565.F003图3不同组别大鼠肾脏组织蛋白表达电泳Fig. 3Electrophoresis of protein expressions in renal tissue of rats in each group4 讨论本实验通过分析益肾化湿颗粒干预后DKD大鼠血清代谢物及肾脏mRNA表达的变化，探寻其共性表达机制。组织病理观察及生化指标检测表明益肾化湿颗粒能一定程度改善糖脂代谢、减轻炎症反应，保护肾功能，进一步从代谢组学与转录组学联合分析发现，甘油磷脂代谢，花生四烯酸代谢、嘌呤代谢、初级胆汁酸生物合成、抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢等6条通路被同时富集，其中共有PE等7个差异代谢物及ADCY3等7个差异mRNA，均有较高的预测准确性，Real-time PCR及Western blot验证结果与测序结果高度一致，表明血清代谢物与肾脏mRNA表达的调控在益肾化湿颗粒改善DKD的途径中发挥重要作用。益肾化湿颗粒干预后，甘油磷脂通路中的PE与1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱上升，GPC降低，Phospho1及Gpam的mRNA相对表达量下调。磷脂酰胆碱（PC）与PE是生物膜的主要脂质成分［13］，PC/PE值降低可改善内质网应激及炎症反应，减轻高糖导致的肥胖［14］。GPC由PC合成，并通过胆碱磷酸二酯酶（GPC-PDE）催化为3-磷酸甘油和胆碱，且胆固醇酰基转移酶（LCAT）可将PC代谢为1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱［15］，进一步降低PC/PE值。研究表明，Phospho1-/-小鼠血清胆碱水平降低，伴有脂质减少，胰岛素敏感性与葡萄糖耐量提高［16］。Gpam的低表达或缺失可降低血浆TG水平，减轻体质量［17］。因此益肾化湿颗粒可能通过调控甘油磷脂代谢，调节GPC-PDE、LCAT等酶的活性，升高PE与1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，降低GPC，下调PC/PE，降低Phospho1及Gpam的mRNA表达，进而改善DKD的糖脂代谢紊乱。益肾化湿颗粒同样能够使花生四烯酸代谢途径中的19（S）-HETE上升，PTGS2的mRNA相对表达量降低。19（S）-HETE作为花生四烯酸（AA）的代谢产物，可刺激增加肾脏近端小管的Na+-K+-ATP酶活性［18］，激活前列环素受体［19］，改善肾小管代谢，维持肾脏血流动力学稳定。在DKD动物模型中，抑制PTGS2的表达可调控肾素-血管紧张素系统（RAS）平衡，减少肾小球滤过屏障损伤，降低蛋白尿，改善肾功能损伤［20］。此外，嘌呤代谢中的UA在益肾化湿颗粒干预后降低，ADCY3的mRNA相对表达量上调。UA作为嘌呤分解代谢的最终化合物，可激活RAS系统，加剧炎症反应及氧化应激，损伤肾脏血管内皮［21］。ADCY3基因缺失或变异的小鼠出现胰岛素敏感性受损，血脂升高，而ADCY3基因的高表达可显著降低肥胖和2型糖尿病的风险［22］。益肾化湿颗粒可能通过降低UA，升高19（S）-HETE含量，抑制PTGS2并促进ADCY3的表达，调控嘌呤代谢通路与花生四烯酸代谢，改善小球与小管代谢紊乱，调控肾脏血流动力学及糖脂代谢，减轻肾功能损伤。益肾化湿颗粒还可降低初级胆汁酸代谢中的7-羟基-4-胆甾烯-3-酮，上调Acox2的mRNA相对表达量。7-羟基-4-胆甾烯-3-酮表征胆汁酸的合成水平，高水平的胆汁酸导致线粒体功能障碍和内质网应激，引起细胞死亡和炎症产生［23-24］，Acox2表征肾脏脂肪酸氧化能力，其减少抑制肾脏线粒体脂肪酸氧化供能，促进肾脏固有细胞凋亡及细胞外基质（ECM）沉积，损害DKD患者肾功能［25］。同时，抗坏血酸和醛酸代谢及半乳糖代谢中MYO降低，半乳糖代谢中Akr1b10及抗坏血酸和醛酸代谢中Ugt2b35的mRNA相对表达量均下调。MYO经过肌醇加氧酶（MIOX）分解代谢后，促进活性氧（ROS）过度生成，加重内质网应激，导致肾小管上皮细胞凋亡［26］。研究发现，Akr1b10在糖尿病肾病患者外周血单核细胞中的表达显著升高，其高表达可能导致了炎症反应与氧化应激损伤，推动DKD进一步发展［27］。Ugt2b35作为UDP葡萄糖醛酸转移酶2家族的一员，与急性肾损伤密切相关［28］。提示益肾化湿颗粒可能通过降低7-羟基-4-胆甾烯-3-酮及MYO水平，抑制Akr1b10及Ugt2b35表达，调控初级胆汁酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢及半乳糖代谢，减轻炎症与氧化应激，抑制肾脏固有细胞凋亡，改善DKD。综上所述，本研究证明益肾化湿颗粒可有效治疗DKD，其可调节磷脂酰乙醇胺等血清代谢物的水平及肾脏中Phospho1等mRNA表达，改善DKD的糖脂代谢紊乱，减轻肾损伤，保护肾功能，并且甘油磷脂代谢等6条代谢-基因共表达通路可能是重要的反应机制，这为临床上应用益肾化湿颗粒治疗DKD提供了理论依据。