肝纤维化是由各种原因引起慢性肝损伤导致细胞外基质（ECM）过度沉积和异常分布而形成的病理过程［1］。然而肝脏具有强烈再生能力，急性肝损伤后肝细胞快速增殖，以恢复肝实质的结构和功能［2］。巨噬细胞是功能高度异质性的经典固有免疫细胞［3］，能够清除机体残存细胞碎片、维持内环境稳态、免疫耐受、启动和维持炎症反应以及促进疾病消退作用［4］。肝巨噬细胞有2种经典表型：一种是典型的M1促炎表型，促进辅助性T细胞1型（Th1）激活；另一种是M2抗炎表型，参与Th2激活、组织修复和纤维化［5］。当肝纤维化发展时，巨噬细胞表型会根据炎症和纤维化的持续时间与程度而动态变化［6］。因此，通过靶向肝巨噬细胞极化调节免疫稳态是一种潜在治疗肝纤维化的策略［7］。有研究认为，氧化应激介导的炎症反应能促进M1巨噬细胞极化并诱导纤维化的发生［8］。此外，据报道中药复方能调节巨噬细胞极化在纤维化疾病的治疗中具有优势［9］，但其具体作用机制尚不明确。曹洪欣教授经大量临床实践总结出外感六淫、疫毒，情志失调，饮食不节，烦劳过度等引起肝失疏泄，气机不畅，肝胆郁热，肝病传脾，脾失运化，湿热内蕴，损伤血络，肝血瘀滞，日久延及下焦，可致肝肾亏损是肝纤维化的主要病机变化特点［10］。提出清肝健脾活血法治疗慢性肝病，临床应用大柴胡汤合鳖甲饮子化裁而成清肝健脾活血方，对缓解临床症状、改善肝纤维化病理，减轻肝损伤，延缓纤维化进程，防止肝病恶化效果良好［11-13］。前期实验研究表明，清肝健脾活血方具有肯定的抗肝纤维化作用，同时具有一定的抗氧化应激作用［14］。本研究基于四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠模型，通过研究清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠M1/M2型巨噬细胞极化的影响，探究其发挥抗肝纤维化的作用机制。1 材料1.1　动物清洁级SD雄性大鼠48只，体质量（180±20） g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SCXK2019-004。所有动物均自由饮水饮食，室温（20±2） ℃，相对湿度40%~60%。本次实验研究经黑龙江中医药大学动物实验伦理委员会审批，伦理审查批准编号202010102。1.2　药物与试剂清肝健脾活血方药物组成为鳖甲20 g，柴胡10 g，枳实10 g，黄芩10 g，法半夏9 g，白芍15 g，川芎10 g，黄芪30 g，炒白术12 g，黄精15 g，甘草10 g，生姜5 g，除生姜外其余由安徽晋仁中药饮片有限责任公司提供，购自黑龙江中医药大学附属第二医院，批号分别为（200706、200701、2012027Ch、200901、20020585、201201、2004007S、2001081S、2012032Ch、2001043、200802），经黑龙江中医药大学附属第二医院许贵军主任药师鉴定为合格药材，用量符合2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）规定。所有药物煎煮前浸泡1 h，先将鳖甲煎煮30 min后，再加入其他11味中药加10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液浓缩至生药质量浓度4.875 g·mL-1，置4 ℃冰箱备用。鳖甲煎丸购自黑龙江中医药大学附属第二医院（武汉中联药业，国药准字Z42020772，每袋10 g），研末以蒸馏水配制成混悬液，质量浓度0.187 5 g·mL-1。甲醛（中国医药集团有限公司，批号10014118），CCl4（万维科技有限公司，批号P20200520031），橄榄油（山东鲁花集团有限公司），苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、Masson染液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为G1120、G1346），丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（南京建成科技有限公司，批号分别为20210609、20210610），白细胞介素（IL）-12、IL-10、IL-1β、转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号分别为JM-08917R1、JM-01602R1、JM-01454R1、JM-01588R1、JM-01587R1），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗、HRP标记山羊抗鼠二抗［天德悦（北京）生物科技有限责任公司，批号分别为S004、S001］，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（Arg-1）、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）、核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、β-肌动蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、巨噬细胞标志物CD86、CD206一抗（美国Abclonal公司，批号分别为A0312、A4923、AC026、A19056、A1199、A8301、AP0526、A19653），增强型化学发光试剂（ECL）（美国Millipore公司，批号WBKLS0500）。1.3　仪器2235型石蜡组织切片机、TP1020-1型全自动组织脱水机（德国莱卡公司），DHG-9031A型电热恒温箱（上海一恒科学仪器有限公司），AL204型万分之一电子天平（美国梅特勒-托利多公司），SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新艺超声设备有限公司），BX41型显微摄影成像（日本Olympus公司），Fresco型低温冷冻离心机、MultiSkan3型酶标仪、Power BC型电泳仪（美国Thermo fisher scientific公司），MP-8000 Mini P-4型电泳槽、MP-3030型湿转电泳槽（Cavoy公司）Tanon 1600凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），ABI7500型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。2 方法2.1　造模、分组与给药清洁级SD雄性大鼠48只，随机分为空白组，模型组，清肝健脾活血方组，鳖甲煎丸组，每组各12只。采用CCl4腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型，参考文献造模方法，除空白组外均予以40%CCl4-橄榄油混悬液（体积比2∶3），按剂量2.0 mL·kg-1腹腔注射，每周2次（相同时段），注射8周，共16次，建立CCl4肝纤维化大鼠模型［15］。空白组腹腔注射等量橄榄油，同时全部给予普通全价饲料喂养。造模8周后随机取3只大鼠肝组织进行Masson染色，以汇管区纤维性扩大，形成少数纤维间隔，作为造模成功的标志。空白组、模型组按照0.1 mL·kg-1给予生理盐水灌胃，1次/d，共4周。参考动物与人等效剂量原则［16］，清肝健脾活血方大鼠日常规给药量为6.17×156 g/60 kg=16.042 g·kg-1，根据前期治疗肝纤维化药效学实验结果，本实验选取高剂量组，即每日灌胃32.084 g·kg-1药液［14］；鳖甲煎丸组按临床等效剂量每日灌胃给予0.925 5 g·kg-1药液。2.2　取材各组大鼠灌胃第28天禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉取血5 mL，4 ℃静置4 h，于4 ℃、3 000 r·min-1离心20 min（离心半径13.5 cm，下同），分离血清。另切取肝脏组织于10%甲醛溶液中，常温保存。2.3　肝脏组织病理组织经10%多聚甲醛固定后，经脱水、透明化、浸蜡、包埋和切片（厚度6 μm），经HE、Masson染色，在显微摄影成像系统下观察。2.4　血清ALT、AST及肝组织炎症因子表达水平检测检测血清ALT、AST及肝组织炎症因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、TGF-β1和TNF-α水平，组织匀浆制备方法：准确称取组织质量，按照质量（g）∶体积（mL）为1∶9加入9倍体积生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，4 ℃、2 500 r·min-1，离心10 min，取上清，严格按照试剂盒说明书操作。2.5　CD86、CD206蛋白表达的检测肝组织经蜡块包埋，切片，脱蜡至水，抗原修复，阻断内源性过氧化物酶，CD86、CD206一抗（1∶100）孵育，二抗孵育，圈内滴加DAB显色液，复染细胞核，脱水透明，显微镜检，用Image-Pro Plus 6.0图片分析系统对结果进行定量分析。2.6　肝组织蛋白表达的检测肝组织裂解提取蛋白，4 ℃、13 000 r·min-1，离心10 min，取上清，BCA测定蛋白浓度，电泳、转膜，3%BSA-TBST室温封闭1 h，iNOS、p-p38 MAPK、NF-κB p65（1∶1 000）、Arg-1（1∶500）一抗室温孵育10 min后4 ℃孵育过夜，用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗（1∶20 000），室温孵育40 min，ECL显影，扫描并分析目标条带灰度值。2.7　肝组织mRNA含量的测定TRIzol法提取肝组织总RNA，依次经过去除基因组DNA，逆转录反应，PCR扩增。逆转录反应，将获得cDNA溶液保存于-20 ℃。取cDNA 2 μL与荧光反应液10 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL和无酶水7 μL进行混合，配制成PCR反应混合液，进行扩增，扩增程序为95 ℃预变性30 min，95 ℃变性5 s、60 ℃退火40 s、40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达水平。引物序列在实验室设计，由Invitrogen公司合成，引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列5'-3'长度/bpiNOS上游TGAAGCACTTTGGGTGACCA下游TATACACGGAAGGGCCAAGC141Arg-1上游GCATATCTGCCAAAGACATCG下游CCATCACCTTGCCAATCCC135β-actin上游CCTAAGGCCAACCGTGAAAA下游GACCAGAGGCATACAGGGACA106p38 MAPK上游GCCGCAGTGAATCGATCTGT下游GCTGCGAGGTATCCCAGAAG106NF-κB p65上游TTCAACATGGCAGACGACGA下游TTCAACATGGCAGACGACGA1262.8　数据处理应用GraphPad Prism 8.3.0及SPSS 26.0软件进行数据统计，计量资料以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，经方差齐性检验，方差齐则采用最小显著性差异法（LSD），方差不齐性时采用Games-Howell法，各组肝脏组织通过Metavir病理分期评分后采用Kruskal-Wallis H检验，P0.05认为差异具有统计学意义。3 结果3.1　清肝健脾活血方对肝脏组织病理的影响肝组织病理切片见图1、图2，空白组肝细胞板排列较规整，沿中央静脉呈放射状分布，胞质胞核界限较清晰，未见炎细胞浸润、充血或水肿。模型组肝细胞板排列不规整，胞质染色不均，可见胞质融合肿胀，胞核固缩，沿血管周边肝细胞呈现中度的脂肪样变性，局部可见有炎细胞聚集成堆，纤维增生，部分可见纤维间隔形成，肝细胞间可见少许蓝染胶原纤维。与模型组比较，各给药组炎细胞减少，蓝染胶原纤维变小、变细，纤维间隔缩小、变窄，表明肝纤维化程度减轻。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.F001图1清肝健脾活血方对肝脏组织病理的影响 （HE，×200）Fig. 1Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on liver histopathology （HE，×200）注：A空白组；B模型组；C清肝健脾活血方组；D鳖甲煎丸组（图2-图5同）10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.F002图2清肝健脾活血方对肝脏组织Masson染色结果的影响（Masson，×200）Fig. 2Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on Masson staining of liver tissue （Masson，×200）Metavir病理分期评分结果显示，各组间差异有统计学意义（P0.01）。与空白组比较，模型组纤维化分期评分显著升高（P0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方组、鳖甲煎丸组病理分期评分均明显降低（P0.05）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组病理分期评分差异无统计学意义。3.2　清肝健脾活血方对血清ALT、AST水平的影响与空白组比较，模型组ALT、AST水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方组、鳖甲煎丸组ALT、AST水平显著降低（P0.01）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组ALT、AST水平差异无统计学意义。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T002表2清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠血清ALT、AST水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on serum ALT and AST levels in rats with hepatic fibrosis （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1ALTAST空白组48.83±5.4765.65±17.94模型组74.45±13.082）156.17±24.122）清肝健脾活血方组32.08452.87±8.704）107.97±15.854）鳖甲煎丸组0.925 557.06±9.004）114.81±14.304）注：与空白组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01；与鳖甲煎丸组比较，5）P0.05，6）P0.01（表3-表6同）U·L-13.3　清肝健脾活血方对肝组织炎症因子水平的影响各组大鼠肝组织炎症因子水平见表3。与空白组比较，模型组肝组织IL-1β、IL-6、IL-12、TGF-β1和TNF-α水平显著升高（P0.01），IL-10水平明显降低（P0.05）；与模型组比较，清肝健脾活血方组和鳖甲煎丸组肝组织中IL-1β、IL-6、IL-12、TGF-β1和TNF-α水平明显降低（P0.05，P0.01），IL-10水平明显升高（P0.05，P0.01）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组肝组织炎症因子水平差异无统计学意义。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T003表3清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织炎症因子水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 3Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on levels of inflammatory factors in liver tissue of rats with hepatic fibrosis （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1IL-1βIL-6IL-12TGF-β1TNF-αIL-10空白组19.20±4.8931.20±9.7033.53±12.5973.54±16.9991.68±2.4058.61±14.24模型组54.78±23.902）64.86±12.212）56.55±11.782）129.37±14.692）138.89±17.892）38.36±8.781）清肝健脾活血方组32.08420.94±4.644）35.11±5.194）39.04±11.503）92.09±21.184）87.89±5.884）62.50±14.114）鳖甲煎丸组0.925 523.99±8.484）34.82±6.224）36.45±15.643）94.98±32.713）88.34±8.624）57.95±13.663）ng·L-13.4　清肝健脾活血方对M1/M2巨噬细胞表面标志物的影响与空白组比较，模型组巨噬细胞标志物CD86、CD206表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方组CD86表达显著降低（P0.01），CD206表达明显升高（P0.05）；与模型组比较，鳖甲煎丸组CD86表达显著降低（P0.01）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组CD206表达显著升高（P0.01）。见表4、图3、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T004表4清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织CD86、CD206表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on expression of integrated optical density of CD86 and CD206 in liver tissue of rats with hepatic fibrosis （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1CD86CD206空白组2 559.28±420.943 447.80±516.94模型组3 616.24±518.732）4 341.84±390.192）清肝健脾活血方组32.0842 876.53±356.884）4 942.39±624.183，6）鳖甲煎丸组0.925 52 719.93±346.454）3 909.72±403.0910.13422/j.cnki.syfjx.20231069.F003图3清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织CD86表达的影响 （免疫组化，×400）Fig. 3Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on CD86 expression in liver tissue of rats with hepatic fibrosis （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.F004图4清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织CD206表达的影响（免疫组化，×400）Fig. 4Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on CD206 expression in liver tissue of Rats with hepatic fibrosis （IHC，×400）3.5　清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织蛋白表达的影响模型组与空白组比较，肝组织iNOS、NF-κB p65、p-p38 MAPK蛋白表达明显升高（P0.01，P0.05），Arg-1蛋白表达显著降低（P0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方组肝组织iNOS、p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表达显著降低（P0.01），Arg-1蛋白表达明显升高（P0.05）；与模型组比较，鳖甲煎丸组iNOS、p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表达明显降低（P0.05，P0.01）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组Arg-1蛋白表达明显升高（P0.05）。见表5，图5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T005表5清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝脏iNOS、Arg-1、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on iNOS，Arg-1，p-p38 MAPK and NF-κB p65 protein expression in liver of rats with hepatic fibrosis （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1iNOS/β-actionArg-1/GAPDHp-p38 MAPK/β-actionNF-κB p65/β-action空白组0.27±0.080.96±0.030.49±0.090.61±0.01模型组0.80±0.192）0.59±0.142）0.94±0.102）0.69±0.021）清肝健脾活血方组32.0840.46±0.154）0.79±0.063，5）0.57±0.164）0.54±0.034）鳖甲煎丸组0.925 50.49±0.143）0.57±0.130.67±0.114）0.59±0.073）10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.F005图5各组大鼠肝脏iNOS、Arg-1、p-p38 MAPK和NF-κB p65蛋白表达电泳Fig. 5Electrophoretic of iNOS，Arg-1，p-p38 MAPK and NF-κB p65 protein expression in liver of rats from all groups3.6　清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝组织mRNA表达的影响与空白组比较，模型组大鼠肝组织iNOS、p-p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA相对表达显著升高（P0.01），Arg-1 mRNA相对表达显著降低（P0.01）；与模型组比较，清肝健脾活血方组大鼠肝组织iNOS、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA相对表达显著降低（P0.01），Arg-1 mRNA相对表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，鳖甲煎丸组大鼠肝组织iNOS、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA相对表达显著降低，Arg-1 mRNA相对表达显著升高（P0.01）；与鳖甲煎丸组比较，清肝健脾活血方组大鼠肝组织iNOS、p38 MAPK mRNA相对表达明显降低（P0.05，P0.01），Arg-1 mRNA相对表达显著升高（P0.01）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20231069.T006表6清肝健脾活血方对肝纤维化大鼠肝脏iNOS、Arg-1、p38 MAPK和NF-κB p65 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of Qinggan Jianpi Huoxue prescription on mRNA expression of iNOS，Arg-1，p38 MAPK and NF-κB p65 in liver of rats with hepatic fibrosis （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1iNOSArg-1p38 MAPKNF-κB p65空白组1.01±0.021.00±0.011.00±0.031.02±0.05模型组4.54±0.162）0.51±0.032）7.84±0.582）8.33±1.022）清肝健脾活血方组32.0841.39±0.134，6）0.97±0.024，6）1.45±0.364，5）2.04±0.464）鳖甲煎丸组0.925 51.86±0.234）0.56±0.122.47±0.454）2.10±0.584）4 讨论巨噬细胞在慢性肝损伤发病机制中处于核心地位，是抗纤维化潜在治疗靶点［17］。巨噬细胞异质性表现为释放的细胞因子、细胞表面标志物和转录的高度多样性，为了适应广泛巨噬细胞功能和表型，这些细胞被归类为“促炎性”M1型或“免疫调节性”M2型巨噬细胞［18-19］。巨噬细胞对组织损伤做出快速反应，最初表现促炎表型，当损伤因素解除后，获得抗炎表型，以促进炎症消除及组织修复，在表型转换中线粒体功能、活性氧（ROS）产生和相关代谢途径均发生了变化［20］。M1型巨噬细胞关键效应功能是分泌促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-12和iNOS等，而M2型巨噬细胞参与组织重塑并分泌免疫调节介质，如IL-10、IL-4、IL-13等［21］。巨噬细胞在各种因素刺激下分化成不同表型，表现出不同特征和作用，从而在机体生理和病理活动中发挥不同调节功能，也称为巨噬细胞极化效应［22］。以CD86表达为特征的M1型巨噬细胞受微生物配体和细胞因子，如脂多糖（LPS）、γ干扰素（INF-γ）或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等刺激，参与促炎细胞因子如IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的产生，而NF-κB激活促进M1型巨噬细胞极化，导致细胞毒性和炎症功能［23］。激活M2型巨噬细胞特征在于产生抗炎细胞因子和表达细胞表面标志物，例如CD206和Arg-1等［24］，其对IL-4和IL-13反应性降低，导致低水平促炎介质诱导Arg-1、CD163和CD206表达上调［25］。Arg-1是一种在肝脏中表达的胞浆酶，通过催化精氨酸水解为尿素和鸟氨酸来消除氮，巨噬细胞特异性表达Arg-1被认为可改善炎症、纤维化并促进伤口愈合，有利于延缓纤维化进展［26-27］。研究认为，在肝纤维化过程中，巨噬细胞通过产生TGF-β、TNF-α和IL-1β等细胞因子调节肝星状细胞（HSCs）活化，其中TGF-β还可激活MAPK信号通路，包括上调细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和c-Jun氨基末端激酶（JNK）水平，以促进HSCs活化［28］，从而推动肝纤维化的发展。清肝健脾活血方以《伤寒论》大柴胡汤与《重订严氏济生方》鳖甲饮子化裁。全方配伍寒温并用，辛开苦降，疏利三焦，宣通上下，和畅气血。基于肝纤维化肝失疏泄，肝胆郁热，肝病传脾，肝血瘀滞，日久肝病及肾，肝脾肾三脏功能失调病机变化特点［10］，用大柴胡汤佐以活血之品清泻肝热，去大黄防其苦寒伤脾胃，合鳖甲饮子健脾活血，软坚散结。具有清肝泻热，益气健脾，行气活血之功。本研究表明，与空白组比较，模型组Metavir评分在F2以上；血清ALT、AST水平显著升高，说明模型组肝纤维化程度、肝细胞损伤明显。清肝健脾活血方组、鳖甲煎丸组与模型组比较，大鼠肝组织病理Metavir评分显著降低，组织病理结果明显改善，血清ALT、AST水平降低，表明清肝健脾活血方具有抗肝纤维化作用及肝细胞保护作用。与空白组比较，模型组大鼠肝组织IL-1β、IL-6、IL-12、TGF-β1和TNF-α水平显著升高，IL-10水平显著降低，说明模型组主要以促炎M1型巨噬细胞激活为主。与模型组比较，清肝健脾活血方组肝组织IL-1β、IL-6、IL-12、TGF-β1和TNF-α水平含量显著降低，IL-10水平显著升高，说明清肝健脾活血方能减少M1型巨噬细胞激活，诱导抗炎M2型巨噬细胞激活，抑制炎症进一步进展，促进组织修复。与空白组比较，模型组大鼠肝组织CD86、CD206蛋白相对表达量、iNOS蛋白和mRNA相对表达量显著升高，Arg-1蛋白和mRNA表达显著降低，说明模型组M1型和M2型巨噬细胞均增加，其中抗炎M2型巨噬细胞减少。清肝健脾活血方干预后，大鼠肝脏组织M1型巨噬细胞标志物CD86、iNOS表达显著降低，M2型巨噬细胞标志物Arg-1、CD206相对表达量显著升高，说明清肝健脾活血方对抗炎M2型巨噬细胞极化具有调节作用。研究认为，NF-κB/MAPK信号通路通过调节炎症和免疫反应、促进M1巨噬细胞极化，进而促进肝脏炎症和纤维化相关基因过表达，从而使肝纤维化进一步发展［29-32］。研究结果表明，CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型表现出肝脏炎症浸润，NF-κB、TNF-α和p38 MAPK表达升高，M1表型巨噬细胞极化增强，清肝健脾活血方干预后可抑制NF-κB、TNF-α及p38 MAPK的表达，减少促炎M1型巨噬细胞激活，诱导M2型巨噬细胞分泌抗炎细胞因子IL-10。推测清肝健脾活血方可能通过抑制NF-κB/p38 MAPK通路调节巨噬细胞极化，减少促纤维化细胞因子，促进肝巨噬细胞M1向有利于组织修复的M2型极化从而发挥抗肝纤维化作用。肝纤维化是一个复杂的病理过程，巨噬细胞极化具有双重作用，中医学的整体观念和调节脏象平衡的思想与肝纤维化过程中巨噬细胞极化状态的调节具有重要相似，本研究从巨噬细胞极化调节的角度阐释了清肝健脾活血方抗肝纤维化的作用机制，为该方的临床研究与应用提供思路和实验基础，后续课题组将结合通路抑制对清肝健脾活血方调控巨噬细胞极化作用机制进行深入研究。