溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性非特异性疾病，以结直肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为特征［1］，严重威胁人类健康。中医理论认为，UC多与“肝郁”“湿热”和“瘀血”有关，由情志不畅、运化失常等因素进而导致湿热蕴结肠腑、气血凝滞、损伤肠络。“化瘀行气”是中医临床治疗UC遵循的法则之一［2］。乳香为橄榄科植物乳香树Boswellia carterii及同属植物B. bhaw-dajiana树皮渗出的树脂，具有活血行气化瘀、消肿止痛的功效［3］。临床研究表明，乳香对于UC疗效确切［4-5］。传统炮制理论认为，醋入肝经，具有活血行气、散瘀解毒等功效，乳香醋炙后化瘀行气的功效增强。课题组前期研究表明，3-O-乙酰基-9，11-去氢-β-乳香酸（ADHBA）在醋炙后含量明显升高［6］，是乳香醋炙前后的主要差异性成分。乳香醋炙后抗炎作用增强，且对于UC的改善作用更优［7］，但增效机制有待深入。UC属于大肠疾病，传统中医理论认为，肝与大肠相通，大肠病宜平肝经为主［8］。胆汁酸是沟通肝脏和肠道的物质基础，胆汁酸的“肝肠循环”指胆汁酸由肝脏产生，进入肠，再返回肝脏的过程［9］。正常状态下，肠道胆汁酸法尼酯衍生物X受体（FXR）的激活维持良好的胆汁酸肠肝循环，使得肠道胆汁酸回流到门静脉，并控制肠道胆汁酸再摄取，限制肠上皮细胞内胆汁酸水平［10］。肠道FXR可以激活成纤维细胞生长因子（FGF）15/19（啮齿动物体内为FGF15，人体内为FGF19）的表达，并通过激活肝脏FGF受体4（FGFR4）来调节肝内胆汁酸的合成［11］。肠道炎症状态时，肠道屏障功能发生紊乱，FXR表达明显降低，进一步影响胆汁酸肠肝循环而导致FGF15/19-FGFR4信号分子受到抑制，而上调FXR-FGF15/19-FGFR4对于UC具有缓解作用［12］。“肠-肝”对话是维持机体稳态的重要环节，胆汁酸是影响“肠-肝”对话的重要信号分子。因此，本研究借助超高效液相色谱-三重四级杆-串联质谱法（UPLC-QQQ-MS）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot），首先确定乳香醋炙前后对UC大鼠结肠胆汁酸的调节作用，其次着眼于胆汁酸“肠-肝”对话，探讨乳香醋炙前后对关键对话通路FXR-FGF15-FGFR4的影响，最后基于结合型胆汁酸干预的HcoEpiC细胞模拟UC状态，对乳香醋炙前后及主要差异成分影响“肠-肝”对话的作用进行验证，为阐明醋炙增强乳香治疗UC的增效作用机制提供科学依据。1 材料1.1　动物SPF级雄性SD大鼠24只，体质量280~300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2016-0006。实验通过中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物伦理福利审查委员会批准，批准编号2018-0860。1.2　药品与试剂乳香（批号805270216）购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学刘春生教授鉴定，为橄榄科植物乳香树B. carterii树皮渗出的树脂，ADHBA（实验室自制，纯度98%），2，4，6-三硝基苯磺酸［TNBS，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，货号SP229701］，龙门米醋（北京六必居食品有限公司，批号20130623），羧甲基纤维素钠（CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，批号20161025），猪去氧胆酸（HDCA）、牛磺猪去氧胆酸（THDCA）、甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、胆酸（CA）、甘氨胆酸（GCA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、石胆酸（LCA）、牛磺石胆酸（TLCA）、脱氧胆酸（DCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）、脱氢胆酸（DHCA）对照品（上海源叶生物科技有限公司，货号分别为B21672、B27364、S25044、B21405、B20921、B32965、B20274、B27078、B20347、S27467、B28100、S26225、B21032、B32956、S50942），α-鼠胆酸（α-MCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺-β-鼠胆酸（Tβ-MCA）、牛磺-ω-鼠胆酸（Tω-MCA）、牛磺猪胆酸（THCA）、甘氨猪胆酸（GHCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）对照品（美国Cayman公司，货号分别为20291、20293、20289、28842、22669、22670、16215、15935），β-鼠胆酸（β-MCA）、ω-鼠胆酸（ω-MCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、甘氨石胆酸（GLCA）、牛磺-α-鼠胆酸（Tα-MCA）、牛磺脱氢胆酸（TDHCA）、甘氨脱氢胆酸（GDHCA）、氘代甘氨胆酸（GCA-D4）、氘代胆酸（CA-D4）、氘代脱氧胆酸（DCA-D4）、氘代石胆酸（LCA-D4）对照品（上海甄准生物科技有限公司，货号分别为ZS-20003、ZIS-18015、ZC-53889、ZS-20046、ZS-20002、ZS-20160、ZS-20162、ZIS-13443、ZTR-C432603、ZIS-13100、ZIS-13099），细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（日本Dojindo公司，批号CK04），FXR兔多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）小鼠单克隆抗体（英国Abcam公司，货号分别为ab228949、ab8245），FGF15小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记小鼠抗兔偶联二抗（圣克鲁斯生物技术有限公司，货号分别为sc-398338、sc-2357），FGFR4兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，货号11098-1-AP），HRP标记羊抗小鼠偶联二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-5305），Western及IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF、增强型二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、β-肌动蛋白（β-actin）小鼠单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为P0013、ST506、P0010S、P0012A、AF5001），超敏发光液（北京普利创新生物科技有限公司，货号P1010），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司，货号IPVH00010），无水乙醇（北京化工厂，货号20260504）、聚山梨酯-80（福晨化学试剂有限公司，货号20180907）、胎牛血清、DMEM培养基（美国Gibco公司，货号分别为10099141、11965092），TRIzol试剂、Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR试剂盒、Trans Script Top Green qPCR Super Mix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，货号分别为ET101-01、AT341-01、AT131-01），甲醇、乙腈和甲酸均为质谱纯，购自美国Fisher公司，水为屈臣氏纯净水，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3　细胞HcoEpiC人正常结肠上皮细胞（编号CRL-1831）购自美国ATCC公司，用含13%胎牛血清的DMEM完全培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养3~4代后用于实验。1.4　仪器Waters Xevo TQ-s micro型质谱仪（美国Waters公司），Nano Drop 2000C型超微量分光光度计（美国Thermo公司），CFX-96型Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司），FC2型Fluor Chem Cell Biosciences成像系统（美国Cell Biosciences公司），CP225D型十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司），K2-Ⅱ型高速组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司），VORTEX2型涡旋振荡器（德国艾卡公司），TGL-16B型恒温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。2 方法2.1　乳香的炮制及药物制备按2020年版《中华人民共和国药典》四部炮制通则（0213）炙法［3］项下和前期研究结果［6］对乳香进行醋炙。取乳香200 g，待锅温130 ℃时投入，翻炒9 min后，喷入10 g米醋，翻炒约2 min后，出锅，晾凉，得醋乳香。将乳香、醋乳香粉碎，过40目筛，分别加入0.5% CMC-Na，配制成质量浓度为45 g·L-1的乳香或醋乳香混悬液。2.2　分组、造模及给药［7］SD大鼠适应性喂养7 d，禁食不禁水8 h，随机取6只大鼠作为正常组，剩余18只大鼠麻醉，按100 mg·kg-1剂量将TNBS乙醇溶液（体积比50%）通过橡胶输液管缓慢推入距大鼠肛门约8 cm深的肠腔内，捏紧并倒置5 min，建立UC模型，正常大鼠给予等量0.9% NaCl溶液。将造模大鼠随机分为模型组、乳香组和醋乳香组，每组6只。乳香组和醋乳香组以0.45 g·kg-1剂量灌胃给药，正常组和模型组灌胃给予10 mL·kg-1的0.5% CMC-Na混悬液，每天给药1次，连续14 d。2.3　大鼠结肠和肝脏组织样品的制备末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，麻醉，剖开腹腔，取病变部位约2 cm结肠和肝脏，迅速用铝箔包裹，液氮速冻后于-80 ℃保存备用。2.4　胆汁酸含量的测定2.4.1　对照品溶液的制备分别取TDHCA、Tω-MCA、Tα-MCA、Tβ-MCA、GDHCA、THCA、THDCA、TUDCA、TCA、GHCA、DHCA、GUDCA、GCA、GHDCA、α-MCA、TCDCA、ω-MCA、β-MCA、TDCA、HCA、CA、UDCA、GCDCA、HDCA、GDCA、TLCA、CDCA、DCA、GLCA、LCA对照品适量，精密称定，加甲醇制备成以上胆汁酸质量浓度分别为1 112、934、1 101、965、940、908、971、1 023、1 220、707.5、1 110、990、970、1 070、950、1 027、1 040、940、1 078、1 060、1 110、1 040、1 130、1 070、1 025、965、960、1 160、890、1 060 mg·L-1的混合对照品溶液。将混合对照品溶液按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128进行倍比稀释，得系列混合对照品溶液。2.4.2　混合内标溶液的制备取内标GCA-D4、CA-D4、DCA-D4及LCA-D4对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.04、0.04、0.04、0.08 g·L-1的混合内标溶液。2.4.3　供试品溶液的制备取各大鼠结肠组织约50 mg，精密称定，精密加入2.4.2项下混合内标溶液100 μL及甲醇900 μL，匀浆1 min（60 Hz，下同），4 ℃、14 000 r·min-1离心20 min（离心半径6 cm，下同），精密吸取上清500 μL，氮气吹干后，精密加入甲醇50 μL溶解，即得。2.4.4　色谱条件采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0~6 min，25%~40%B；6~20 min，40%~70% B；20~20.1 min，70%~100% B；20.1~23 min，100%B；23~23.1 min，100%~25% B；23.1~25 min，25%B），流速0.2 mL·min-1，柱温45 ℃，自动进样器温度10 ℃。对照品进样量为1 μL，供试品进样量为10 μL。2.4.5　质谱条件采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，毛细管电压3.5 kV，离子源温度150 ℃，去溶剂温度550 ℃，去溶剂气体流速1 000 L·h-1，碰撞气体流速0.25 mL·h-1，采用多反应监测模式进行扫描。各成分的主要质谱参数见增强出版附加材料。2.4.6　方法学考察精密称取各待测结肠样品，等量混合，匀浆，得质控样品。取质控样品约50 mg，精密称定，精密加入甲醇800 μL，匀浆1 min，4 ℃、14 000 r·min-1离心20 min，上清液经活性炭吸附后，得空白基质溶液。向空白基质溶液中精密加入2.4.2项下混合内标溶液和2.4.1项下系列混合对照品溶液各100 μL，混匀，取混匀液500 μL，氮吹干燥后，精密加入甲醇50 μL溶解，按2.4.4和2.4.5项下方法检测。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，得到线性回归曲线。以色谱峰信噪比（S/N）=10为定量下限，S/N=3为检测下限。取质控样品约50 mg，精密称定，按照2.4.3项下方法制备供试品溶液，按2.4.4和2.4.5项下方法检测，同一样品连续进样6次，计算各成分峰面积与内标峰面积比值的相对标准偏差（RSD）。取质控样品约50 mg，平行6份，精密称定，按照2.4.3项下方法制备供试品，按2.4.4和2.4.5项下方法检测，分别计算各成分平均质量分数及其RSD。取同一样品的供试品溶液，分别于短期室温放置12、24 h，-80 ℃保存2个月及连续“冷冻-融化”3个循环后，按2.4.4和2.4.5项下方法检测，计算各成分峰面积与内标峰面积比值的RSD。取质控样品约50 mg，3份，精密称定，分别精密加入2.4.2项下混合内标溶液100 μL，2.4.1项下混合对照品溶液100 μL，甲醇800 μL后，匀浆1 min，4 ℃、14 000 r·min-1离心20 min，精密吸取上清500 μL，氮吹干燥，精密加入甲醇50 μL复溶，制备提取前加入混合对照品的质控样品；再取质控样品约50 mg，3份，精密称定，精密加入2.4.2项下混合内标溶液100 μL及甲醇800 μL，匀浆后精密加入2.4.1项下混合对照品溶液100 μL，离心，精密吸取上清500 μL，氮吹干燥，精密加入甲醇50 μL复溶，制备提取后加入混合对照品的质控样品。按2.4.4和2.4.5项下方法检测提取前、后加入混合对照品的质控样品，计算平均回收率，回收率=（提取前加入混合对照品的质控样品峰面积/提取后加入混合对照品的质控样品峰面积）×100%［11］。精密吸取最高浓度供试品溶液分析后立即测定空白溶剂。计算残留率，残留率=（目标成分的残留浓度/定量下限浓度）×100%。2.5　HcoEpiC细胞给药取乳香、醋乳香粉末各5 g，分别加入95%乙醇75 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，滤液减压浓缩至干，残渣精密加入无水乙醇10 mL溶解，得提取物溶液。取ADHBA 20 mg，加入无水乙醇5 mL溶解，得ADHBA溶液。吸取上述乳香、醋乳香提取物及ADHBA溶液10 μL，分散于0.5 mL含10%聚山梨酯-80的磷酸盐缓冲液（PBS）中，再各加入DMEM完全培养基9.4 mL混匀后，过滤除菌，即得乳香、醋乳香和ADHBA药液。以1×104个/孔密度将细胞接种到96孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱培养48 h后，弃去培养基，PBS冲洗2次后，加入不同质量浓度（0、5、10、25、50、100、200 mg·L-1）的醋乳香提取物。孵育48 h后，向每孔加入CCK-8 10 μL，于37 ℃、5% CO2培养箱培养3 h后，采用酶标仪在450 nm测定吸光度A，确定药物给药浓度。取处于对数生长期的细胞，接种至6孔板中，随机分为空白组、结合型胆汁酸组、乳香组、醋乳香组和ADHBA组，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。除对照组外，各组细胞用含TCA、THCA和TUDCA均为50 μmol·L-1的DMEM完全培养基处理24 h后［9］，乳香组、醋乳香组和ADHBA组再分别给予含乳香（10 mg·L-1）、醋乳香（10 mg·L-1）、ADHBA（0.05 mg·L-1）药物溶液的DMEM完全培养基培养24 h，收集细胞。2.6　Real-time PCR检测大鼠结肠、肝脏和HcoEpiC细胞中目的mRNA表达提取UC大鼠结肠、肝脏及HcoEpiC细胞中总RNA，测定总RNA浓度。依照试剂盒说明书方法对RNA进行反转录并扩增。目的基因引物序列见表1。PCR反应条件为94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s；55 ℃复性15 s；72 ℃延伸10 s，共进行40个循环。肝脏组织以GAPDH为内参，结肠组织及细胞以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.T001表1引物序列Table 1Primer sequences种属引物序列（5′-3′）长度/bp大鼠FXR上游CTCCTCGTCTTACTATTCCAA下游CATACATTCAGCCAACATCC149FGF15上游TCCCAGTCTGTGTCGGATGAAGG下游CGGATACGCAGGAAGCAGTTGG116β-actin上游CAGTGATGGTGTGCTGCTGTAG下游CGTAGGTCTTAGGCTCATTCTC165FGFR4上游GTGGCTGCTGTTGGCTTTGTTG下游GCTCTTGCTGCTCCGAGATTGG116GAPDH上游GGAGATTAGCTTCCCTGGCTCCTA下游GACTCATCGTTCTCCTGCTTGCTG92人FXR上游GGACCATGAAGACCAGATTGC下游CAGAATGCCCAGACGGAAG80FGF19上游ACAATGTGTACCGATCCGAGAAGC下游CAGCATGGGCAGGAAATGAGAGAG116GAPDH上游TATGACAACAGCCCTCAAGAT下游AGTCCTTCCACGATACCA1382.7　Western blot检测大鼠结肠和肝脏目的蛋白表达取大鼠组织50 mg，加入含PMSF的蛋白裂解液500 µL，充分研磨，置于冰上裂解30 min后，4 ℃、14 000 r·min-1离心5 min，取上清，得到蛋白溶液。采用BCA试剂盒对上清中蛋白进行定量，根定量结果向蛋白溶液中加入适量5×上样缓冲液，涡旋混匀，100 ℃变性5 min后，冷却至室温，得到蛋白样品。SDS-PAGE凝胶分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入一抗FXR（1∶500）、FGF15（1∶100）、FGFR4（1∶200）、GAPDH（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入对应二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，洗涤3次后，化学发光法显色，胶片曝光，使用Image J V1.8.0.112软件进行分析。2.8　统计学分析采用SPSS 22.0处理实验数据，计量资料以x¯±s表示，进行正态性检验和方差齐性检验。若两项检验均符合，则采用单因素方差分析进行统计学处理。组间比较采用最小显著性差异法（LSD）-t检验，P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　乳香醋炙前后对UC大鼠结肠FXR、FGF15和肝脏FGFR4 mRNA与蛋白表达的影响在明确乳香醋炙后对结合型胆汁酸调节作用更优的基础上，进一步对乳香醋炙前后干预UC大鼠“肠-肝”对话通路FXR/FGF15/FGFR4的影响进行了研究。见表2、表3及图1，与正常组比较，模型组结肠中FXR、FGF15及肝脏中FGFR4的mRNA和蛋白表达明显降低（P0.05，P0.01）；与模型组比较，乳香组、醋乳香组FXR、FGF15及肝脏中FGFR4的mRNA和蛋白表达明显升高（P0.05，P0.01）；与乳香组比较，醋乳香组FXR、FGF15、FGFR4的mRNA与蛋白表达均明显升高（P0.05，P0.01）。10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.T002表2乳香、醋乳香对UC大鼠结肠FXR、FGF15和肝脏FGFR4 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 2Effect of Olibanum and vinegar-processed Olibanum on mRNA expressions of FXR，FGF15 in colon and FGFR4 in liver of UC rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1FXRFGF15FGFR4正常组1.00±0.041.04±0.041.06±0.06模型组0.43±0.032）0.65±0.032）0.62±0.052）乳香组0.450.89±0.024）0.85±0.043）0.86±0.053）醋乳香组0.451.07±0.054，5）1.09±0.034，6）1.08±0.034，5）10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.T003表3乳香、醋乳香对UC大鼠结肠FXR、FGF15和肝脏FGFR4蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Olibanum and vinegar-processed Olibanum on protein expressions of FXR，FGF15 in colon and FGFR4 in liver of UC rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1FXR/β-actinFGF15/β-actinFGFR4/GAPDH正常组1.00±0.021.00±0.051.00±0.02模型组0.59±0.032）0.80±0.031）0.81±0.031）乳香组0.451.13±0.064）0.89±0.023）1.01±0.033）醋乳香组0.451.17±0.104，5）0.99±0.033，5）1.21±0.034，5）10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.F001图1各组大鼠结肠FXR、FGF15和肝脏FGFR4的蛋白表达电泳Fig. 1Electrophoresis on FXR，FGF15 proteins incolon and FGFR4 in liver of each group注：A.正常组；B.模型组；C.乳香组；D.醋乳香组3.2　方法学考察专属性考察结果显示，各目标成分专属性良好，无杂质干扰［13］。各目标成分的线性关系、检测下限和定量下限结果见增强出版附加材料，表明各成分的线性关系良好，可满足样品中目标成分的灵敏度检测要求。精密度试验结果显示，各成分峰面积与内标峰面积比值的RSD为1.0%~7.0%，重复性试验结果显示，各成分平均质量分数RSD 1.2%~5.0%，各成分具体平均质量分数见增强出版附加材料，稳定性考察结果显示，目标成分在不同储存条件下含量变化均15%，平均回收率85.13%~114.76%且RSD均15%，残留率20%，均符合要求。3.3　乳香醋炙前后对UC大鼠结肠中胆汁酸含量的影响胆汁酸含量测定结果显示，与正常组比较，模型组大鼠结肠中总游离型胆汁酸含量明显降低（P0.05），总结合型胆汁酸含量显著升高（P0.01）。给予乳香和醋乳香干预后，虽对于总游离型胆汁酸没有表现出明显的调节趋势，但对于总结合型胆汁酸表现出回调作用（P0.01），且醋乳香的调节作用更优（P0.01）。对乳香醋炙前后干预总牛磺结合型胆汁酸、总甘氨结合型胆汁酸的结果进行分析发现，与正常组比较，模型组大鼠结肠中总牛磺结合型胆汁酸、总甘氨结合型胆汁酸含量均显著升高（P0.01）；与模型组比较，乳香和醋乳香干预大鼠总牛磺结合型胆汁酸、总甘氨结合型胆汁酸含量均显著降低（P0.01），且醋乳香对于总牛磺结合型胆汁酸表现出更优的回调作用。进一步对各结合型胆汁酸进行分析发现，与正常组比较，模型组大鼠结肠中结合型胆汁酸Tα-MCA、Tβ-MCA、Tω-MCA、THCA、GHCA、THDCA、TUDCA、TCA、GCA、TCDCA、GCDCA、TDCA、GDCA含量明显升高（P0.05，P0.01）；TLCA、TDHCA、GDHCA含量明显降低（P0.05，P0.01）。在给予乳香和醋乳香干预后，明显回调了其中9个牛磺结合型胆汁酸（Tα-MCA、Tβ-MCA、Tω-MCA、THCA、THDCA、TUDCA、TCA、TCDCA、TDCA）及4个甘氨结合型胆汁酸（GHCA、GCA、GDCA和GDHCA）水平。此外，乳香醋炙后，对Tβ-MCA、Tω-MCA、THCA、TUDCA、TCA和GHCA表现出更明显的调节作用（P0.05，P0.01），使其水平更接近正常大鼠。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.T004表4乳香、醋乳香对UC大鼠结肠中胆汁酸含量的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of Olibanum and vinegar-processed Olibanum on bile acid contents in colon of UC rats （x¯±s，n=6）组别剂量/g·kg-1TDHCATω-MCATα-MCATβ-MCAGDHCA正常组6.19±0.71286.30±23.1477.26±8.53358.98±40.5210.67±1.11模型组3.08±0.322）1 247.21±102.712）7 628.64±624.112）12 171.89±983.652）4.45±0.382）乳香组0.454.94±0.683）403.37±38.644）718.88±61.094）1 246.30±105.774）7.93±0.874）醋乳香组0.453.83±0.57283.89±30.234，5）638.54±51.834）910.12±98.224，5）8.90±0.934）组别剂量/g·kg-1THCATHDCATUDCATCAGHCA正常组4.19±0.29779.97±80.4354.54±6.72472.70±56.8812.21±1.72模型组276.23±29.992）3 256.62±498.682）250.43±28.992）11 355.78±1 024.312）32.86±4.382）乳香组0.4581.67±7.864）871.91±86.484）110.59±13.974）7 309.51±741.774）18.74±2.914）醋乳香组0.455.54±0.614，6）732.17±81.044）68.79±7.714，5）1 928.70±208.634，6）12.01±1.334，5）组别剂量/g·kg-1DHCAGUDCAGCAGHDCAα-MCA正常组37.56±3.61399.14±42.76100.91±9.99107.98±16.089 807.62±990.45模型组25.11±2.342）386.39±40.55702.45±68.112）122.84±11.9511 211.53±1 298.87乳香组0.4534.13±2.994）357.40±38.14282.24±31.844）57.43±4.994）11 673.83±963.72醋乳香组0.4528.92±3.01430.42±41.03458.68±48.184，5）96.65±11.003，5）9 840.87±890.23组别剂量/g·kg-1TCDCAω-MCAβ-MCATDCAHCA正常组269.37±23.1710 008.20±1 311.3510 939.61±1 341.257.98±0.62412.99±45.70模型组648.84±73.682）5 916.50±458.762）13 908.12±1 654.825 227.37±658.182）1 969.55±231.892）乳香组0.45331.85±38.254）9 182.45±898.653）18 055.81±2 089.771 094.15±107.854）3 123.65±354.88醋乳香组0.45273.22±30.314）6 389.52±732.8110 742.44±992.141 182.59±107.964）496.05±50.214）组别剂量/g·kg-1CAUDCAGCDCAHDCAGDCA正常组2 166.32±285.3126 226.22±2 754.21100.03±9.8456 564.63±6 921.85149.19±15.87模型组26 196.83±2 089.332）2 531.25±328.782）166.72±17.221）18 705.17±2 031.682）587.69±60.272）乳香组0.459 575.37±1 088.054）3 552.22±389.553）158.86±16.3726 857.00±2 853.643）270.36±24.304）醋乳香组0.457 098.23±935.644）1 177.20±190.33142.59±15.7517 472.83±1 864.95284.99±34.884）组别剂量/g·kg-1TLCACDCADCAGLCALCA正常组176.30±16.4360.21±7.3134 708.08±3 543.2167.04±7.7577 520.80±7 632.21模型组118.60±12.091）139.16±14.392）16 417.17±1 568.442）68.12±5.1870 111.86±6 827.94乳香组0.45110.94±9.98246.34±25.1817 897.15±1 972.5370.69±8.8969 137.19±5 429.78醋乳香组0.4577.04±6.514，5）102.88±9.943，6）11 478.50±1 033.8958.89±6.6770 557.65±6 782.65组别剂量/g·kg-1总游离型胆汁酸总结合型胆汁酸总牛磺结合型胆汁酸总甘氨结合型胆汁酸正常组228 452.24±24 836.463 440.95±362.562 493.78±257.44947.17±105.12模型组167 132.25±16 507.241）44 256.19±4 244.752）42 184.69±4 036.712）2 071.52±208.042）乳香组0.45169 335.14±16 068.7413 507.74±1 340.654）12 284.11±1 212.344）1 223.65±128.314）醋乳香组0.45135 385.08±13 485.807 597.56±783.394，6）6 104.43±623.594，6）1 493.13±159.774）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01；与乳香组比较5）P0.05，6）P0.01（表6和表7同）ng·g-13.4　乳香、醋乳香及ADHBA对HcoEpiC细胞活力的影响HcoEpiC细胞活力结果显示，醋乳香质量浓度为5、10、25、50、100、200 mg·L-1时，细胞活力分别为（100±3.42）%、（83.29±2.91）%、（86.98±3.64）%、（82.45±1.78）%、（72.30±3.52）%、（67.14±2.69）%、（63.28±3.13）%。HcoEpiC细胞活力随醋乳香质量浓度的升高而降低，当醋乳香质量浓度≤25 mg·L-1时，细胞活力80%，且质量浓度为10 mg·L-1时细胞活力最高，故确定醋乳香给药质量浓度为10 mg·L-1。为保证乳香、ADHBA和醋乳香用于对比研究给药浓度的平行，对10 mg·L-1乳香和0.05 mg·L-1ADHBA给药溶液（10 mg·L-1醋乳香当量）［6］进行了细胞活力检测，结果表明HcoEpiC细胞活力均80%，两者对细胞活力无明显影响。用含TCA、THCA和TUDCA的DMEM完全培养基处理细胞后，再分别给予各药物溶液的细胞活力检测结果表明，HcoEpiC细胞活力均80%，细胞状态良好，故确定乳香、醋乳香和ADHBA给药质量浓度分别为10、10、0.05 mg·L-1。3.5　乳香醋炙前后及ADHBA对结合型胆汁酸干预的HcoEpiC细胞FXR和FGF19 mRNA表达的影响为验证乳香醋炙前后及ADHBA对HcoEpiC细胞“肠-肝”对话分子FXR和FGF19的影响，采用UC和正常大鼠结肠含量差异明显且乳香醋炙后回调良好的胆汁酸TCA、THCA和TUDCA，作用于HcoEpiC人正常结肠上皮细胞，模拟肠道UC状态，对乳香、醋乳香及ADHBA干预HcoEpiC细胞FXR和FGF19 mRNA表达进行了研究，见表5。结果发现与空白组比较，结合型胆汁酸组FXR、FGF19 mRNA表达显著降低（P0.01）；与结合型胆汁酸组比较，乳香、醋乳香及ADHBA组FXR、FGF19 mRNA表达明显升高（P0.05，P0.01）；与乳香组比较，醋乳香组FXR、FGF19 mRNA表达明显升高（P0.05，P0.01）。10.13422/j.cnki.syfjx.20230562.T005表5乳香、醋乳香及ADHBA对HcoEpiC细胞FXR、FGF19 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Olibanum，vinegar-processed Olibanum and ADHBA on FXR and FGF19 mRNA expression in HcoEpiC cells组别质量浓度/mg·L-1FXRFGF19空白组1.02±0.040.98±0.06结合型胆汁酸组0.73±0.031）0.65±0.031）乳香组100.82±0.042）0.72±0.032）醋乳香组100.93±0.053，4）0.86±0.043，5）ADHBA组0.050.85±0.062）0.74±0.042）注：与空白组比较1）P0.01；与结合型胆汁酸组比较2）P0.05，3）P0.01；与乳香组比较4）P0.05，5）P0.01x¯±s，n=34 讨论UC属于炎症性肠病范畴，其发病机制复杂，病程缠绵难愈，临床主要表现为腹泻、腹痛及黏液脓血便［14］。乳香抗炎作用确切，其提取物Aflapin已在欧洲成为上市药物，用于炎症疾病的治疗［15］。传统中药炮制理论认为，乳香醋炙后活血止痛的功效增强。课题组前期研究表明，乳香醋炙后对UC模型大鼠结肠病变和炎性细胞因子水平的改善作用增强，并从醋中活性成分作用［16］、醋炙前后化学成分变化［17-19］、醋炙前后活性成分吸收［20］以及初级胆汁酸合成［21］角度，对增效机制进行了研究。结合型胆汁酸与UC密切相关。临床研究发现，大肠湿热证和脾虚湿阻证UC患者胆汁酸代谢均呈现异常，与健康者比较，2种证型UC患者的粪便结合型胆汁酸总量均明显升高，提示结合型胆汁酸在UC发病中具有重要作用［22］。此外，也有关于结合型胆汁酸参与UC疾病发展进程的报道［23-24］。本研究表明，UC大鼠结肠中结合型胆汁酸含量较正常大鼠明显升高，与临床报道趋势一致。在乳香及醋乳香干预后，明显回调了13个结合型胆汁酸的水平，且对TCA、THCA、TUDCA具有明显的回调效果。国外学者的临床队列研究发现，部分炎症性肠病患者的结合型胆汁酸TCA、THCA、TUDCA水平明显高于对照组［25］。而结合型胆汁酸TCA可以促进结肠黏膜的破坏和出血，加重UC的炎症程度［23］，提示对结合型胆汁酸特别是TCA、THCA、TUDCA水平的回调作用，可能是醋乳香发挥增效作用的关键环节。肝脏和肠道是结合型胆汁酸合成和解离的主要部位，“肠-肝”对话是调节机体胆汁酸代谢的重要过程。胆汁酸的调节功能主要是细胞内配体激活核受体的结果，FXR被认为是胆汁酸代谢的主要调节因子［26］。正常状态下，肠FXR可以激活FGF15/19，并通过肝脏FGFR4来调节肝内胆汁酸的合成［27］。肠道炎症状态时，肠道屏障功能发生紊乱，FXR表达明显降低，进一步影响胆汁酸肠肝循环而导致“肠-肝”对话FGF15/19-FGFR4信号分子受到抑制［12］。UC患者结肠FXR表达明显降低已在临床研究中被证实［28］。基于动物研究也发现，抑制野生型小鼠FXR的表达后，出现了肠道炎症反应［29］。在给予FXR激动剂治疗后，可明显抑制肠道上皮中性粒细胞浸润和菌群过度生长，保护肠道黏膜的完整性［30］。普遍观点认为，游离型胆汁酸是FXR的激动剂，而结合型胆汁酸对FXR具有抑制作用［31-33］。本研究表明，给予UC大鼠乳香、醋乳香后，结肠结合型胆汁酸含量降低，FXR、FGF15和FGFR4表达上调，提示乳香和醋乳香通过下调结合型胆汁酸水平、缓解FXR-FGF15-FGFR4对话因子的抑制程度，发挥改善UC的作用，且乳香醋炙后作用更优。通过结合型胆汁酸TCA、THCA、TUDCA干预HcoEpiC细胞的验证实验进一步证明，结合型胆汁酸TCA、THCA、TUDCA抑制了FXR和FGF19表达，而乳香、醋乳香及醋炙前后主要差异成分ADHBA均能明显改善两者的表达水平，醋乳香作用优于乳香。本研究证实，乳香醋炙对于FXR-FGF19的上调作用可能是其发挥增效作用的机制，而醋炙前后主要差异成分ADHBA可能是发挥调节作用的关键成分之一。本研究从胆汁酸调控“肠-肝”对话角度，为阐明醋炙增强乳香治疗UC增效作用机制提供了参考，丰富了中药炮制理论的科学内涵。乳香醋炙后是否可以通过化学成分直接调节胆汁酸相关受体而发挥增效作用，仍需要进一步的深入研究。