肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性恶性肿瘤之一。流行病学调查结果显示，HCC全球新发病例数位居恶性肿瘤第6位，死亡率则高居第3位，其发病与肝炎病毒、黄曲霉素、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等危险因素相关［1］。对于早期HCC患者，临床治疗手段包括手术切除、肝移植和局部消融等。然而超过80%的HCC患者被发现时已处于中晚期，只能考虑采用化疗药物进行治疗，但传统的化疗药物可造成很严重的不良反应［2］。因此，寻找新的安全有效的治疗手段具有重要的临床意义。HCC最显著的特征是细胞过度活化，增殖速度异常。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路是机体内调控细胞增殖、凋亡及分化等作用的经典信号通路之一［3］。同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）是一种双特异性脂质和蛋白质磷酸酶，也是PI3K/Akt信号通路上游的关键分子。PTEN激活可抑制PI3K/Akt信号通路活化，通过减少Akt磷酸化而调节HCC细胞的增殖与凋亡，从而调节HCC细胞增殖与凋亡。因此PTEN/PI3K/Akt信号通路被认为是延缓HCC进展的关键靶标之一［4-5］。楮实子首载于《名医别录》，是桑科植物构树的干燥成熟果实，被列为上品。楮实子味甘性寒，具有清肝泄热、通利水湿之功效［6］，现代药理学研究表明，楮实子中主要包括总皂苷、黄酮、生物碱、脂肪油、红色素、多糖以及微量元素和氨基酸等多种化学成分［7-8］。有研究表明以楮实子为君药的方剂在治疗肝炎和肝硬化方面具有较好的疗效［9］。此外，研究发现楮实子可通过抑制内质网应激保护小鼠肝损伤［10］，说明楮实子对肝脏具有一定的保护作用。但是其对HCC是否具有一定的防治作用，尚未见报道。因此，基于楮实子的肝保护作用，本研究试图探究其是否在抗HCC方面具有一定积极作用，并从PTEN/PI3K/Akt信号通路角度初步探索其可能的作用机制。1 材料1.1　动物85只2周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SYXK（辽）2021-0001。实验动物伦理审查报告经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准，批准号21000042022042。小鼠饲养于辽宁中医药大学大连校区SPF级动物房的IVC系统里，在适当的控制条件下（12 h光/暗循环）、温度（20~25 ℃）和湿度（40%~60%）饲养，饲料和饮用水自由取用，适应性饲养1周后用于实验。1.2　药物与试剂楮实子中药饮片购自康美药业股份有限公司（批号190804291），经辽宁中医药大学王添敏教授鉴定为桑科植物构树Broussonetia papyrifera的成熟果实；二乙基亚硝胺［阿拉丁科技（中国）有限公司，货号N109571］；索拉非尼（上海麦克林生化科技股份有限公司，货号S828599）；甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（上海科兴生物科技有限公司，批号分别为F2632-A、F2630-A）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、原位末端标记法（TUNEL）试剂盒（大连美仑生物科技有限公司，批号分别为MB9898-Jun-11G、MA0223-Feb-09C）；马松（Masson）染色试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号20210829）；Ki67、PTEN、PI3K、磷酸化（p）-Akt及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Abcam公司，货号分别为ab15580、ab267787、ab154598、ab38449、ab8245）；辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为BA1061、BA1075）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013C）；碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）（南京建成生物工程研究所，批号分别为A059-2-2、C010-2-1、C009-2-1、C017-2-1）。1.3　仪器BK-200VET型全自动生化分析仪（济南欧莱博科学仪器有限公司），RM2125RTS型石蜡切片机（德国Leica公司），Multiskan FC型酶标仪、iBright™ CL750型凝胶成像系统（美国Thermo公司），Mini-PROTEAN Tera System型垂直电泳仪及转移槽、Trans-Blot Turbo型半干转转膜仪（美国Bio-Rad公司），IX53型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。2 方法2.1　楮实子水提物的制备按照实验室前期方案制备楮实子水提物［11］。称取楮实子饮片500 g，加入10倍量饮用水浸泡1 h，加热煎煮2次，2 h/次，过100目筛，合并滤液，浓缩至药液体积为500 mL（生药量为 1 g·mL-1），将药液分装，于4 ℃保存备用。2.2　HCC小鼠模型的建立、分组及治疗根据文献报道及前期课题组方法建立DEN诱导肝癌小鼠模型［12］。将85只小鼠随机分为空白组（n=10）和模型组（n=75），空白组每周腹腔注射等体积生理盐水；模型组小鼠腹腔注射50 mg·kg-1 DEN水溶液，每周1次，连续8周。于第14周时，模型组小鼠随机挑选3只小鼠，处死，取出肝组织，观察肝脏变化，并进行HE染色。当肝脏表面出现白色瘤状结节，并且HE染色观察发现存在癌变细胞时，认为模型制备成功。将体质量相近的模型小鼠随机分为5组，分别为模型组、索拉非尼组、楮实子水提物低剂量组、楮实子水提物中剂量组及楮实子水提物高剂量组，每组10只。楮实子水提物给药剂量按照2020年版《中华人民共和国药典》一部记载楮实子成人（70 kg）临床最大用量为12 g·d-1，并根据《中药药理研究方法学》中人与小鼠体表面积系数法换算，得到小鼠每日剂量为1.8 g·kg-1，将此剂量定为中剂量，低、高剂量分别为中剂量的0.5、2倍，即为 0.9、3.6 g·kg-1。小鼠被灌胃给予不同浓度的楮实子水提物，每日1次，连续6周。2.3　组织取材于末次给药1 h后，小鼠采用0.3%戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉取血，于4 ℃、3 500 r·min-1，离心半径178 mm（下同），离心15 min，吸取上清，4 ℃保存，用于肝功能指标检测和ELISA实验。于冰上快速取出小鼠肝脏，切取肝组织300 mg置于4%多聚甲醛固定液中固定，用于HE、免疫组织化学及TUNEL染色实验；将剩余肝组织置于干净的离心管中，液氮中保存，用于蛋白免疫印迹法（Western blot）实验。2.4　肝功能指标分析全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中ALP、AST、ALT及γ-GT活性，操作步骤按照仪器说明书进行。2.5　肿瘤标志物检测利用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中AFP、CEA含量，实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。利用酶标仪于450 nm测定各孔吸光度A，以不同浓度的标准品A为纵坐标，标准品浓度作为横坐标绘制标准曲线，利用标准曲线计算各组小鼠血清中AFP、CEA含量。2.6　HE染色将固定好的肝组织经脱水、透明、石蜡包埋随后进行切片，厚度在5 μm左右，隔十取一，置于60 ℃恒温烤箱中烤片30 min后使用。切片经脱蜡、水化后，苏木素染色液染色10 min，自来水浸泡20 min返蓝，伊红浸染2 min，乙醇脱水、二甲苯透明，干燥后中性树胶封片，显微镜观察肝组织病理学变化。2.7　Masson染色将肝组织切片常规经脱蜡、水化后，置于Weigert铁苏木素染色液中染色8 min；酸性乙醇分化液分化10 s，水洗；Masson蓝化液返蓝5 min，水洗；丽春红品红染色液染色10 min；用弱酸工作液洗1 min。磷钼酸溶液洗2 min；弱酸工作液洗继续1 min；置入苯胺蓝染色液中染色2 min。弱酸工作液洗1 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥后中性树胶封片，显微镜观察肝组织病理学变化。2.8　Ki67免疫组织化学染色将肝组织石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化，利用枸橼酸缓冲液微波炉加热15 min进行抗原修复；将切片置于3% H2O2溶液10 min，消除内源性过氧化物酶；随后向组织上滴加Ki67抗体稀释液（1∶300），4 ℃孵育过夜；次日清洗后，加入HRP二抗稀释液（1∶300），孵育1 h，苏木素复染10 min；梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察Ki67阳性表达拍照并计数。2.9　TUNEL染色将肝组织石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化，向组织上滴加50 μL反应液，37 ℃避光反应1 h；随后滴加Streptavidin-TRITC标记液50 μL，继续反应30 min；DAPI染色液染色10 min，PBS缓冲液清洗切片，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察肝癌细胞凋亡情况。2.10　Western blot称取小鼠肝组织200 mg，加入适量RIPA裂解液，电动匀浆器匀浆，于4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白定量并调整浓度至一致；加入上样缓冲液，加热变性蛋白；随后进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭；将膜与PTEN、PI3K、p-Akt及GAPDH一抗稀释液（1∶1 000）4 ℃过夜；次日加入HRP二抗稀释液（1∶1 000），室温振荡孵育1 h，TBST洗膜。利用ECL发光液显示蛋白条带，凝胶成像分析系统扫描并拍照。利用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析，将目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度值的比值进行统计学分析。2.11　统计学分析采用SPSS 26.0软件进行实验数据的统计学分析。数据表示为x¯±s，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法（LSD）-t法。如果数据不符合正态性或方差齐进行非参数检验，以P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　楮实子水提物对HCC小鼠肝功能的影响与空白组比较，模型组小鼠血清中肝功能相关指标ALP、AST、ALT及γ-GT活性显著升高（P0.01）；与模型组比较，楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组小鼠血清中肝功能相关指标ALP、AST、ALT及γ-GT活性明显降低（P0.05，P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.T001表1楮实子水提物改善HCC小鼠肝脏功能 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on improve liver function in HCC mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1·d-1ALP/Gin units·100 mL-1AST/U·L-1ALT/U·L-1γ-GT/U·L-1空白组7.46±0.903.93±2.24114.50±78.152.17±0.98模型组19.49±3.351）37.61±8.841）545.33±100.481）9.07±2.901）楮实子低剂量组0.917.16±2.8830.68±5.57461.17±97.1311.73±2.54楮实子中剂量组1.814.76±1.562）21.47±2.882）325.33±126.082）6.91±2.832）楮实子高剂量组3.614.07±0.573）21.21±6.212）267.00±47.333）4.12±2.283）索拉非尼组0.0115.46±1.692）15.86±8.063）277.83±148.713）7.09±5.782）注：与空白组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01（表2-表4同）3.2　楮实子水提物对HCC小鼠血清中AFP和CEA表达水平的影响与空白组比较，模型组小鼠血清中AFP、CEA表达水平显著升高，差异有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组小鼠血清中AFP、CEA表达水平明显降低，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.T002表2楮实子提取物对HCC小鼠血清中AFP和CEA表达的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on decrease expression level of AFP and CEA in HCC mice （x¯±s， n=10）组别剂量/g·kg-1·d-1AFPCEA空白组93.73±6.251.22±0.19模型组264.64±52.721）3.13±0.461）楮实子低剂量组0.9280.85±7.793.11±0.30楮实子中剂量组1.8219.18±30.252）2.10±0.483）楮实子高剂量组3.6199.48±11.053）2.56±0.232）索拉非尼组0.01166.76±31.573）2.23±0.273）ng·L-13.3　楮实子水提物改善HCC小鼠肝组织病理损伤空白组小鼠肝脏组织内肝叶结构正常、完整，肝细胞排列整齐，细胞着色正常，无肿瘤样或炎症细胞浸润现象；模型组小鼠肝脏组织可见大量假小叶无序结构，小叶内可见局灶性细胞坏死，存在大量炎细胞浸润，并且大量细胞具有不规则形状的细胞核，类似于肝癌细胞灶；楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组小鼠肝组织病理损伤呈现不同程度的减轻，表现为肝细胞部分结构恢复正常，坏死性细胞数量减少、炎性细胞浸润现象减轻，癌变细胞数量减少；楮实子水提物低剂量组肝脏病理损伤情况与模型组基本相近。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.F001图1楮实子水提物对HCC小鼠肝脏组织损伤的影响 （HE，×200）Fig. 1Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on improve pathological damage to liver tissue in HCC mice （HE，×200）注：A.空白组；B.模型组；C~E.楮实子水提物低、中、稿剂量组；F.索拉非尼组（图2-图5同）空白组小鼠肝脏组织内未见明显蓝色胶原沉积，模型组小鼠肝脏实质中可见大量蓝色胶原沉积，楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组小鼠肝实质中胶原沉积明显减轻，楮实子水提物低剂量组小鼠肝实质中胶原沉积与模型组基本相近。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.F002图2楮实子水提物对HCC小鼠肝脏组织损伤的影响 （Masson，×100）Fig. 2Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on improve pathological damage to liver tissue in HCC mice （Masson，×100）3.4　楮实子水提物对肝癌细胞增殖、凋亡的影响与空白组比较，模型组小鼠肝脏组织中Ki67阳性细胞数量显著增加（P0.01）；与模型组比较，楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组小鼠肝脏组织中Ki67阳性细胞数量明显减少（P0.05，P0.01）；楮实子水提物低剂量组小鼠肝脏组织中Ki67阳性细胞数量与模型组比较，稍有增长，但差异均无统计学意义。见图3、表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.F003图3楮实子提取物对HCC小鼠肝癌细胞增殖和凋亡的影响 （Ki67，×100）Fig. 3Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on inhibit proliferation of liver cancer cells and promotes apoptosis （Ki67，×100）10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.T003表3楮实子水提物对肝癌细胞凋亡的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on apoptosis of liver cancer cells （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1·d-1Ki67TUNEL空白组12.00±3.582.17±1.72模型组39.83±6.371）2.83±1.47楮实子低剂量组0.942.83±7.783.67±1.51楮实子中剂量组1.831.33±2.732）5.33±1.63楮实子高剂量组3.623.67±3.443）15.83±3.713）索拉非尼组0.0120.17±5.643）16.67±4.973）空白组和模型组小鼠肝脏组织中TUNEL阳性细胞少见；与模型组比较，楮实子水提物高剂量组和索拉非尼组小鼠肝脏组织中TUNEL阳性细胞数量显著增加（P0.01）；楮实子水提物低、中剂量组小鼠肝脏组织中TUNEL阳性细胞数量与模型组比较，差异均不具有统计学意义。见表3、图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.F004图4楮实子提取物对HCC小鼠肝癌细胞增殖和凋亡的影响 （TUNEL，×100）Fig. 4Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on inhibit proliferation of liver cancer cells and promotes apoptosis （TUNEL，×100）3.5　楮实子水提物对HCC小鼠肝脏PTEN/PI3K/Akt通路关键蛋白表达的影响与空白组比较，模型组小鼠肝脏内PTEN蛋白表达显著降低，PI3K和p-Akt蛋白表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组PTEN蛋白表达明显升高，p-Akt蛋白表达明显降低（P0.05，P0.01）；楮实子水提物高剂量组和索拉非尼组小鼠肝脏组织中PI3K蛋白表达水平显著降低（P0.01）。楮实子水提物中、高剂量组和索拉非尼组p-Akt/Akt明显降低（P0.01）。见表4和图5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.T004表4楮实子提取物对PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 （x¯±s，n=10）Table 4Effect of water extract of Broussonetiae Fructus on regulate expression of key proteins in PTEN/PI3K/Akt pathway in liver of HCC mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1·d-1PTEN/GAPDHPI3K/GAPDHAkt/GAPDHp-Akt/GAPDHp-Akt/Akt空白组0.93±0.080.28±0.030.98±0.020.14±0.030.14±0.03模型组0.27±0.051）1.11±0.061）0.97±0.010.59±0.051）0.61±0.061）楮实子低剂量组0.90.22±0.021.00±0.050.97±0.010.52±0.060.53±0.06楮实子中剂量组1.80.44±0.032）0.97±0.130.98±0.020.33±0.022）0.33±0.013）楮实子高剂量组3.60.64±0.063）0.49±0.053）0.94±0.012）0.26±0.043）0.28±0.043）索拉非尼组0.010.57±0.063）0.49±0.093）0.93±0.052）0.28±0.033）0.30±0.023）10.13422/j.cnki.syfjx.20231826.F005图5各组PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达电泳Fig. 5Expression of proteins in PTEN/PI3K/Akt pathway in liver of HCC mice4 讨论中医认为HCC属“积聚”“鼓胀”“肋痛”“肝郁”等疾病范畴。HCC中医病因病机主要为饮食劳倦、七情内伤，邪毒内侵，致湿热、气滞、血瘀、痰毒等互结于肝所致［13-15］。尤松鑫教授认为HCC中医病机为正气不足，湿热之邪扰动肝络，日久煎灼耗伤津液，致肝体受损，肝阴亏虚，加之湿、热、痰、瘀等病理因素损伤肝络，肝络不畅则气血不行，络脉虚滞失养［16］。肝脾相生相克且肝肾同源，肝脏癌毒必然会致肝脾肾失调，因此肝癌与肝、脾、肾三脏密切相关［17-18］。治之应益肾补肝，健脾和胃，同时辅之清热化湿、消痰散结、逐瘀通络［13］。中药褚实子，性味甘寒，归肝、脾、肾三经，具有滋肾、清肝、泄热、通利水湿之功效，治水气浮肿，虚劳，契合HCC的中医病机，并且临床上应用以楮实子为君药的方剂在防治HCC方面取得了不错的效果，包括兰豆枫楮汤、豆楮方等［19-20］。PTEN属于一种抑癌基因，在肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种实体恶性肿瘤中均处于低表达状态，并且其表达水平与肝癌患者的总生存期、肿瘤分期及转移发生密切相关，因此PTEN被认为是评价肝癌患者治疗和预后评价的关键标志物［21-24］。PI3K促使PIP2磷酸化转变为PIP3，PIP3进入细胞后协助Akt苏氨酸308位点及丝氨酸473位点磷酸化，使Akt部分或完全激活［25］。有研究表明，PTEN为PI3K/Akt信号通路的上游，PTEN低表达会诱导PI3K底物PI3P的磷酸化，激活PI3K/Akt信号通路，进而发挥促进肿瘤细胞增殖和抗凋亡作用［26-27］。相反，当PTEN表达水平升高时，PI3P脱磷酸化，进而抑制PI3K/Akt信号通路，发挥抑制肿瘤细胞增殖和促凋亡作用［28］。本研究采用DEN诱导HCC小鼠模型，探讨楮实子水提物对其治疗作用及其分子机制。DEN诱导HCC模型与人体HCC发病过程相似，主要分为3个病理阶段，分别为肝炎阶段（第2~7周）、肝纤维化阶段（第8~13周）及肝细胞癌阶段（第14~20周）［29］。因此，本研究于腹腔注射第14周时，观察小鼠肝组织变化，发现肝脏组织表面具有明显的癌性病变，变现为密布白色瘤状结节；进一步利用HE、Masson染色观察发现，细胞排列紊乱，有大量炎细胞浸润，并且充满不规则形状细胞核的异型细胞，类似肝癌细胞灶且伴有大量胶原沉积。综合上述结果证明DEN诱导的HCC小鼠模型制备成功。给予楮实子水提物灌胃治疗6周后，发现小鼠肝功能指标ALP、AST、ALT及γ-GT活性显著降低；肿瘤血清标志物AFP和CEA表达水平显著降低；并且坏死性细胞数量减少、炎性细胞浸润现象减轻，癌变细胞数量减少，胶原沉积减少，提示楮实子水提物可抑制炎症细胞浸润，减轻肝组织纤维化，能够抑制肝癌的发生发展。本研究接着对肝脏癌变细胞增殖和凋亡情况进行了检测。结果显示，中剂量、高剂量楮实子水提物及索拉非尼治疗后Ki67阳性细胞数量显著减少；并且高剂量楮实子水提物和索拉非尼组小鼠肝脏组织TUNEL阳性细胞数量显著增加，说明楮实子水提物能够抑制DEN诱导HCC小鼠肝癌细胞增殖并且促进其凋亡。进一步的Western blot实验证实，高剂量楮实子水提物与索拉非尼可以显著降低小鼠肝脏组织中PI3K蛋白表达水平；高剂量楮实子水提物组及索拉非尼组可显著提高PTEN蛋白表达水平；同时中、高剂量楮实子水提物组及索拉非尼组显著降低Akt磷酸化为p-Akt，起到一定抑制作用。综上所述，本研究结果表明楮实子水提物具有抑制DEN诱导的HCC进展的作用，其作用机制可能与楮实子水提物调控PTEN/PI3K/Akt信号通路活性，进而抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡有关，因此本研究认为楮实子有望发展成为潜在的抗HCC药物，改善临床治疗HCC的困境。HCC发病机制复杂，本研究仅是从肿瘤细胞增殖和凋亡的角度探讨楮实子的作用机制，在今后的研究中还将从HCC预防、侵袭及转移等方面深度挖掘楮实子的潜能和机制。同时单用传统中医药发挥治疗HCC可能存在疗效较慢、患者不认可等问题。在今后的研究中还将继续探讨化疗药物、靶向治疗药物联合楮实子防治HCC的应用前景。