骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源于从骨髓中分离出的干细胞，具有多向分化和自我更新的潜能，在一定的培养条件或微环境内，可分化为成骨细胞（OB）、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等［1-3］，对维护骨结构稳定和平衡骨代谢过程具有十分重要的作用。研究发现，机体骨量的变化和骨骼的重塑与骨细胞、OB和破骨细胞（OC）的数量及多种细胞间的协调活动联系密切［4］，证实BMSCs在骨发育和骨转换活动中发挥着重要的作用，BMSCs首先变化形成骨祖细胞，然后由骨祖细胞转换成为OB前体进而转换为成熟的OB，随后OB迁移至骨陷窝处分泌骨基质，最后由骨基质经过矿化形成新骨［5］。根据相关研究显示，机体在生理或病理条件下，如衰老、女性绝经、创伤等因素的干预下，会导致BMSCs自我更新速度缓慢，数量减少及成骨分化能力减弱，从而导致骨质疏松症（OP）、骨缺损等疾病［6-7］，因此如何通过药物干预或外力作用诱导BMSCs增殖及其成骨分化是目前干细胞研究领域的热点内容，中药以其多生物活性成分、多靶点、多通路协同及高效价廉和副作用少的治疗优势被广泛关注，已有多项研究证明，中药单体及复方能够诱导BMSCs增殖，增强与成骨相关基因的转录与表达，从而促进BMSCs向OB分化，达到防治OP、骨缺损等多种骨病的目的［8］，并且本项目团队通过前期实验研究证明中药麝香能够促进BMSCs迁移、增加骨缺损处与成骨相关蛋白基因的表达，促进大鼠颅骨骨缺损修复［9］。本文通过阅读国内外应用中药单体或复方调控信号通路促进BMSCs增殖及其成骨分化的相关文献，并对其进行分析、整理和总结，以期为临床上应用中药防治骨科疾病提供有益参考和理论依据，并为后续研究提供理论参考。1 分泌型糖蛋白（Wnt）信号通路1.1　Wnt信号通路与BMSCs的关系Wnt信号通路作为一条高度保守的信号通路，在组织胚胎的发育过程中发挥着重要的作用。Wnt信号通路因其下游激活物的不同，可以将其分为经典通路和非经典通路。由β-链蛋白（β-catenin）激活基因转录的经典Wnt信号通路，Wnt蛋白在分泌后能够与细胞表面的特异性受体结合，使得其下游的靶蛋白进行磷酸化和去磷酸化过程，从而抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的磷酸化，引起β-catenin蛋白累积［10］，β-catenin作为该条通路的核心蛋白，通过与钙依赖性细胞黏附分子E-钙黏蛋白（E-cadherin）在细胞连接处相互作用，参与形成黏合带，使游离的β-catenin进入胞核调节相关基因的转录和表达。Wnt信号通路在BMSCs向成骨分化过程中发挥重要作用，被认为是决定BMSCs命运的调节因子［11］，是研究治疗骨病干预BMSCs增殖和分化的重要通路之一［12］，在骨骼发育、BMSCs向OB分化及维持OB与OC的动态平衡关系中发挥着重要作用［13-14］。1.2　中药单体及复方调控Wnt信号通路干预BMSCs梁钰堉等［15］探究何首乌水溶液中活性成分二苯乙烯苷（TSG）对BMSCs增殖和分化的影响，研究发现TSG能够促进BMSCs的增殖和分化，细胞中的碱性磷酸酶（ALP）活性升高，骨钙素（BGP）、Ⅰ型胶原蛋白α1链（Col1A1） mRNA、Runt相关转录因子2（Runx2） mRNA等蛋白表达水平增加，且给予Wnt3a处理后β-catenin mRNA表达显著升高，提示TSG可能是通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的成骨分化；任莉［16］研究木香烃内酯对BMSCs成骨分化的影响，发现木香烃内酯能够提高ALP活性，增加钙化结节数量，提高Ⅰ型胶原（Collagen1）、成骨细胞特异性转录因子（Osx）、Runx2和骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的mRNA表达，木香烃内酯组中Wnt10b、β-catenin的mRNA表达水平的提高提示其促进BMSCs的成骨分化与Wnt/β-catenin信号通路有关；盘龙七片是临床上常用于治疗骨性关节炎、骨折的药物，具有消肿镇痛，活血化瘀和抗炎的作用，吴泽荣等［17］研究发现，盘龙七片能够促进BMSCs的增殖和分化，且BMSCs的增殖程度与药物质量浓度呈正比关系，其能够有效提高成骨基因Runx2、COL1A1、Osx mRNA表达，并且药物组中BGP水平和ALP活性显著提升，再次验证了盘龙七片对BMSCs细胞成骨分化的促进作用，通过与正常组比较，Wnt3和β-catenin的蛋白表达在盘龙七片组中显著提升，而p-GSK-3β蛋白表达下降，提示盘龙七片可能是通过激活Wnt/β-cateinin通路促进BMSCs的增殖及成骨分化；吴忠书等［18］发现活血通络胶囊能够促进体外BMSCs增殖和成骨分化，且以10 mg·L-1为最佳干预质量浓度，经过药物作用处理后，Wnt/β-catenin通路的相关靶点蛋白的表达增加，BMSCs中与成骨相关基因Runx2、骨桥蛋白（OPN），雌激素受体α（ERα）、远端缺失同源异型盒转录因子5（Dlx5）和骨γ-羧谷氨酸蛋白（BGLAP） mRNA表达增加，并且其促进作用可以被ERα抑制剂ICI 182780和Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1所抑制，结果表明活血通络胶囊通过ERα-Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs的增殖和成骨分化。2 神经源性位点缺口同源蛋白（Notch）信号通路2.1　Notch信号通路与BMSCs的关系Notch信号通路具有高度的保守性，主要由Notch受体、Delta和Jagged配体、DNA结合蛋白、CSL、效应物及调节分子组成［19］，通过细胞表面的配体蛋白与相邻细胞表面的受体相结合的方式进行信号传递过程，因此又被称之为复合信号结合蛋白-J依赖通路。Notch通路在细胞的增殖、凋亡和分化过程中发挥着重要的调控作用，尤其在BMSCs的成骨分化过程中，Notch信号通路的配体蛋白Jagged-1是BMD的决定因子，Jagged-1蛋白的大量表达能够促进骨折的早期愈合，并且抑制BMSCs高密度长期培养所导致的细胞老化，增强其成骨分化，并且Notch信号通路能够正向调节Noggin蛋白的释放，从而促进骨小梁形成和增加成骨前体细胞的数量［20-21］。现代临床研究报道，Notch通路能够调节OB和OC的功能，从而在骨代谢过程中发挥着重要作用，因此该条通路的信号异常会造成OP、骨软化、骨发育系统紊乱等疾病，并且其上下游的基因突变也会导致一系列疾病［22］。研究表明，在对BMSCs成骨分化的过程进行干扰后，细胞中的Notch1、Jagged-1蛋白表达明显降低，而在Notch1与Jagged-1配体转染实验中，结果显示转染后的BMSCs向成骨分化能力增强，证明该条通路参与调控BMSCs的成骨分化过程［23-24］。2.2　中药单体及复方调控Notch信号通路干预BMSCs任锟等［25］通过观察水蛭素对BMSCs的影响，发现水蛭素能够激活血管内皮生长因子（VEGF） /Notch1信号通路，增强BMSCs中VEGF、Notch1、Jagged1的表达，使BMSCs中Runx2、Osx和COL1A1表达水平上升，提升ALP活性，并且在加入水蛭素处理的细胞中观察到明显的矿化结节，结果表明水蛭素通过激活VEGF/Notch1通路促进BMSCs的成骨分化；邓宇等［26］探究淫羊藿苷（ICA）促进BMSCs成骨分化的作用机制，发现淫羊藿苷可以提高大鼠BMSCs中Notch1、Jagged-1蛋白表达，BMSCs中ALP活性上升，Hesl、Runx2 mRNA水平上升，提示淫羊藿苷可能是通过激活Notch通路促进大鼠BMSCs的成骨分化；刘湘琳［27］研究发现，壮骨止痛胶囊能够调控去卵巢大鼠BMSCs中的Notch通路，对Notch1、Jagged1、Hes等蛋白表达起正向调节作用，从而促进骨形成，有效改善骨微结构；周灵通［28］探究固本增骨方含药血清调控Notch通路干预BMSCs成骨分化的机制，发现固本增骨方能够上调Notch通路的Notch1 mRNA表达、下调CBF1 mRNA表达，使成骨因子-Ⅰ（Col-Ⅰ）、BGP、Runx2等蛋白表达显著上升，发挥促进BMSCs的增殖及成骨分化、抑制其成脂分化的作用。3 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路3.1　MAPK信号通路与BMSCs的关系MAPK信号通路，是一组能够被细胞外刺激物激活的MAPK，是将细胞表面所受刺激传导至核内的重要载体蛋白，包括p38 MAPK、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等3种激酶，作为细胞内信号通路传导的重要组成部分，参与调节细胞增殖、凋亡、分化和生存及细胞之间功能同步等一系列生命活动，尤其在细胞的增殖和发育，OB的分化及骨骼发育等过程中发挥着至关重要的作用，是细胞外因素激发细胞内信号的聚合点。在MAPK信号通路中，p38通路主要在细胞的生长、存活及分化过程中发挥重要作用，调控p38可促进BMSCs的成骨分化［29］，ERK通路作为最经典的一条通路，主要调节细胞的起始增殖和分化，在OB中发挥重要作用［30］，而JNK通路则对OB的活性产生影响［31］。3.2　中药单体及复方调控MAPK信号通路干预BMSCs凡军等［32］研究发现，异鼠李素（ISO）可以促进BMSCs的增殖和矿化，上调OPN、OCN、ALP等基因的表达，增加Runx2、BMP-2、ALP蛋白的表达量，并且可以增强p-p38蛋白的表达，在加入siRNA干扰后p-p38蛋白表达则减弱，证明ISO是通过激活p38 MAPK通路促进BMSCs的成骨分化；时舒曼等［33］研究银杏叶提取物（GBE）促进大鼠BMSCs成骨分化的机制，发现在MAPK信号通路抑制剂SB203580处理的抑制组中，大鼠BMSCs细胞外基质矿化减少，ALP活性明显下降，ALP、BMP-2、OCN和Runx2基因的蛋白表达量明显降低，而在GBE处理的组中，BMP-2、OCN、Runx2、ALP等基因的表达明显上调，提示GBE通过激活p38通路促进大鼠BMSCs成骨分化。梁军等［34］研究发现复方接骨中药可以促进BMSCs增殖，并且对p38的磷酸化具有促进作用，能够上调ALP、BGP、BMP-2 mRNA表达，而当加入通路抑制剂后，其对BMSCs成骨分化的促进作用显著降低，证实复方接骨中药可以作用于p38 MAPK通路，增强p38蛋白的磷酸化，通过该通路促进BMSCs的增殖及成骨分化；曲宁宁等［35］通过左、右归丸含药血清干预BMSCs成骨诱导的研究，发现左、右归丸含药血清可以激活p38 MAPK通路，促进p38蛋白的磷酸化，上调ALP活性，增强CBFα1、ColⅠ mRNA的表达水平，促进矿化结节形成，而在p38特异性阻滞剂SB203580作用后，以上作用均减弱，提示左、右归丸含药血清可能通过调控p38 MAPK信号通路对BMSCs成骨分化产生作用。4 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路4.1　PI3K/Akt信号通路与BMSCs的关系PI3K/Akt信号通路是一条细胞内信号通路，是细胞内外沟通的桥梁，是调控BMSCs成骨分化的关键信号通路［36］。PI3K是一类位于胞质中的脂质激酶，由调节亚基p85和催化亚基p110的异源二聚体所构成，根据其结构的不同，可分为PI3KⅠ、Ⅱ、Ⅲ，三者当中，对PI3KⅠ的研究最为广泛，因PI3KⅠ能被细胞表面的受体激活分为ⅠA和ⅠB 2个亚型，具有蛋白激酶和类脂激酶两者的双重活性，在细胞膜的信号转导、膜转运和代谢等过程中发挥着十分关键的调节作用［37-38］。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K下游非常重要的活性信号靶点，由Pleckstrin同源结构域、催化域及调节域三部分构成。PI3K作为脂质激酶，与被磷酸化的酪氨酸残基缔合，激活自身的催化亚基p110，将磷脂酰肌醇二磷酸磷酸化生成磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）［39］，诱导Akt的三级结构的构象发生改变，PIP3作为第二信使将Akt转运到质膜上，将Akt的磷酸化残基磷酸化，从而完全激活Akt，使其成为有活性的激酶进一步调节下游信号分子，实现对BMSCs成骨分化的调控［40］。4.2　中药单体及复方调控PI3K/Akt信号通路干预BMSCs张春玲等［41］在评估人参皂苷Rh2促进大鼠BMSCs增殖作用机制的实验中，发现人参皂苷Rh2可以激活PI3K/Akt信号通路，使细胞中PI3K、p-Akt蛋白表达水平显著提高，并且在Akt抑制剂LY294002处理后，PI3K、p-Akt表达显著降低，细胞活力明显下降，抑制了BMSCs的增殖；李琼静等［42］探究小檗碱对大鼠BMSCs体外迁移的影响及其作用机制，发现小檗碱能够增加Akt蛋白的磷酸化，促进BMSCs成骨，提高其抗氧化作用，并且能够促进BMSCs迁移，其作用机制可能激活PI3K/Akt通路有关；朱余俊等［43］观察复方补肾活血颗粒对人BMSCs增殖的影响，研究发现复方补肾颗粒能够促进人BMSCs增殖，上调PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达水平，促进PI3K、Akt、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、β-catenin蛋白的mRNA表达，激活Wnt/PI3K/Akt信号通路，发挥治疗OP的作用。刘燕等［44］观察不同浓度归肾丸水提物干预SD大鼠BMSCs增殖的影响，研究发现80 mg·L-1质量浓度的药物能够显著促进细胞增殖，并且归肾丸水提物各组细胞中PI3K、Akt蛋白表达明显优于空白组，以80 mg·L-1归肾丸水提物组PI3K、Akt蛋白表达量最高，提示归肾丸水提物通过激活PI3K/Akt信号通路，上调PI3K、Akt蛋白的表达水平，从而促进大鼠BMSCs的增殖。5 BMP/Smad信号通路5.1　BMP/Smad与BMSCs的关系BMP是存在于骨基质中的酸性糖蛋白，有20余种成员，他们能引起多种细胞的增殖、分化和凋亡［45］。BMP通路包括典型的Smad蛋白依赖性途径（Smads途径）和非典型Smad独立信号通路（MAPK途径），其中，Smads途径主要与BMSCs的成骨分化有关。相关研究证明，在BMSCs分化为OB及胞外基质的过程中，BMP/Smad信号通路发挥了十分重要的作用，当Smads信号被激活后，可以增强OB的成熟，促使BMSCs向成骨或软骨转化［46］。5.2　中药单体及复方调控BMP/Smad信号通路干预BMSCs林燕平［47］探讨三七皂苷Fa减轻氧化损伤并调控骨髓间充质干细胞成骨分化的机制，研究发现，实验组中大鼠BMSCs中BMP2、BMP4、Smad1、Smad4和Runx2蛋白的表达较模型组显著上升，提示三七皂苷Fa可以通过激活BMP/Smad通路，从而调控BMSCs的成骨分化，改善骨代谢水平。WANG等［48］探讨蛇床子内酯刺激BMSCs成骨分化的影响机制，研究发现，蛇床子内酯可增强BMP-2、Smad1、Smad4、Runx2、Osx和骨桥蛋白的表达水平，及增强Smad1的磷酸化，提示蛇皮子内酯通过BMP/Smad信号通路促进BMSCs的成骨分化。REN等［49］探究鹿茸多肽对BMSCs的影响及对去势大鼠骨保护的作用机制，研究发现鹿茸多肽能够增强ALP活性和细胞外基质矿化，上调Runx2、OCN、BMP-2、ColⅠ的表达，促进BMSCs增殖和向OB分化，并且对大鼠的骨微结构也能够产生保护作用，其作用机制与鹿茸多肽激活BMP-2/Smad1，5/Runx2通路有关；宋敏等［50］探讨固本增骨方含药血清对大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影响，发现其能够上调BMP-2，4、Smad1、Runx2 mRNA的表达，增加与成骨相关BGP、OPN、ALP、ColⅠ蛋白水平的表达，提示固本增骨方含药血清可能是通过激活BMP/Smad/RUNX2通路促进BMSCs的增殖及其成骨分化。张玉卓［51］实验发现，在左归丸的作用下，小鼠BMSCs中叉头蛋白J1（FoxJ1）蛋白表达降低，而p-Smad1，5/Smad1蛋白的表达水平明显上升，BMP-2蛋白表达增加，提示左归丸能够抑制FoxJ1的表达，激活BMP/Smad通路从而促进小鼠BMSCs的成骨分化。6 其他信号通路在现有的文献中，另有少数应用中药单体及复方调控JAK/信号转导及转录激活蛋白（STAT）、骨保护素（OPG）/核转录因子-κB受体激活因子（RANK）/RANK配体（RANKL）等信号通路干预BMSCs增殖及其成骨分化的研究。6.1　中药单体及复方调控JAK/STAT信号通路干预BMSCsJAK/STAT信号通路是一条在所有细胞因子信号传递过程中都发挥重要调控作用的信号传导通路，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡和免疫调节过程［52］。相关研究报道显示，STAT3蛋白普遍存在于生物细胞内，主要负责调节与细胞增殖和分化有关的基因，其受体蛋白在被刺激因子磷酸化后，形成多聚体进入核内调控靶基因达到影响BMSCs成骨分化的作用，而抑制JAK/STAT3的磷酸化则会阻碍BMP-2诱导的ALP形成，从而抑制BMSCs的成骨分化［53］。朱海燕［54］通过ICA促进BMSCs成骨分化作用机制的实验研究，发现ICA能够促进大鼠RME扩弓区的成骨作用，并上调趋化因子受体4（CXCR4）的表达，低浓度ICA可以促进BMSCs的成骨分化，实验组中ColⅠ、Runx2、OCN mRNA及蛋白的表达增加，而其促进作用主要通过CXCR4的表达量进行调节，在干扰STAT3蛋白的表达后，ICA组中p-STAT3、STAT3蛋白表达显著降低，相应的CXCR4蛋白表达也显著的下调，阻碍了成骨基因Runx2、ColⅠ、OCN蛋白的表达上调，降低ALP的活性，减少了矿化结节的数量，提示STAT3参与对CXCR4蛋白的表达调控，ICA通过STAT3/CXCR4促进BMSCs的成骨分化。6.2　中药单体及复方调控OPG/RANK/RANKL信号通路干预BMSCsOPG/RANK/RANKL信号通路在调节骨代谢方面发挥着重要的调控作用，该通路可诱导OC的分化、成熟，从而促进骨吸收［55-56］，在机体内，OPG和RANKL保持着动态平衡的比率，如果二者比率失去平衡，就可能导致骨代谢紊乱，从而引发各种骨病［57］。相关研究证实，OPG/RANK/RANKL通路能够对骨吸收与骨形成过程发挥调控作用，通过激活OPG/RANK/RANKL通路可抑制OC的分化和成熟，降低骨代谢，促进BMSCs成骨分化，改善骨微结构，增强BMD水平［58］。刘勇等［59］研究表明，益肾健骨颗粒能够上调大鼠BMSCs中ALP、Runx2、OCN mRNA表达水平，提示其有促进BMSCs成骨分化的作用，当抑制OPG的表达时，细胞中RANK与RANKL表达水平显著上升，并且ALP活性及矿化结节的数量显著降低，从而提示益肾健骨颗粒可以通过调节信号通路的活性，促进OP大鼠BMSCs的成骨分化。7 小结综上所述，BMSCs的增殖及成骨分化过程受多种作用因素的影响，同时又因中药单体及复方具有多种药物成分，使其具备复杂的药理作用，因此中药促进BMSCs的增殖及成骨分化的作用机制涉及多条信号通路，Wnt、Notch、MAPK、PI3K/Akt、BMP/Smad、JAK/STAT、OPG/RANK/RANKL等通路均能够影响BMSCs的增殖及成骨分化过程。中药单体及复方通过影响相关信号通路的活化过程，调控其通路蛋白活性，从而对靶基因的转录和表达发挥作用。通过药物干预或其他因素促进BMSCs增殖及其成骨分化对临床防治OP、骨缺损和骨折愈合等多种疾病有着至关重要的意义，因此，基于信号传导通路途径研究干预BMSCs增殖分化的药物有着广阔的发展前景。中药单体及复方调控信号通路促进BMSCs增殖及成骨分化的作用机制及研究靶点总结见增强出版附加材料。近年来，随着中药调控信号通路干预BMSCs增殖及成骨分化相关研究的不断深入，应用中药防治OP、骨缺损等疾病的独特优势日渐突出。然而，中药促进BMSCs增殖及成骨分化相关研究及临床使用中仍存在以下问题：①现有的研究仍主要停留在中药单体及复方作用于BMSCs的基础实验研究，且多为药物作用于体外BMSCs的研究，缺乏大样本的临床研究及循证数据，并且未在实际的临床应用中考量其治疗效果，没有考量BMSCs存在于体内时对药物干预的应答程度，由于单纯的某个因素促进体外BMSCs增殖分化已经不能满足当前的研究和治疗的需要，因此在今后的研究及应用中，应该逐步增加药物对实际临床病例的研究。虽然现有的研究对药物作用于大多数信号传导通路的途径及调控靶点有了初步的认识，但对其具体的作用机制研究仍不明了，并且对于单味药物是否能够调控多条信号传导通路共同参与对BMSCs作用的研究也相对缺乏，因此在后续的研究中，应该重点梳理清晰中药影响BMSCs增殖及其成骨分化的关系网，探究多信号传导通路相互作用的关系，并且运用网络药理学及分子生物学等技术手段进行药物作用靶点预测，研制疗效突出，作用靶点明确，价格低廉的药物。无论是中药单体或者是中药复方，其疗效关系都与药物剂量密切相关，虽然在基础实验研究阶段，通过高、中、低不同剂量分组干预已经得到药物干预的最佳剂量，但当将其应用于个体化诊疗过程中时仍然存在大量不可控的因素，因此，将现有的与中药相关的研究成果应用于实际临床治疗仍然存在较多的阻力，不过随着中医药事业的快速发展和现代医学信息的不断进步，在今后的某个时期一定会攻克这个难题。