高尿酸血症（HUA）为嘌呤代谢紊乱所致，是痛风的病理学基础，并与高血压、抑郁症、高脂血症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、肥胖、胰岛素抵抗、肾病、炎症、感染性疾病的严重程度、肿瘤溶解综合征、更年期综合征、器官移植并发症和某些疑难病症（阻塞性睡眠呼吸暂停、原发性干燥综合征等）的发生密切相关［1-4］。控制高尿酸血症对治疗痛风等严重代谢性疾病及与之相关的疾病具有重要意义。目前，临床上用于抗高尿酸血症的药物主要包括减少尿酸生成和增加尿酸排泄方面的药物，获得一定的治疗效果，但也存在肝肾损伤等比较明显的不良反应。因此，研究高效低毒的抗高尿酸血症药物已经迫在眉睫。近年研究发现中药对高尿酸血症具有一定的治疗作用，且不良反应小的特点［5-7］，为抗高尿酸血症药物的研发提供新的思路。毛果鱼藤为豆科鱼藤属灌木，藤茎具有利尿除湿、止咳化痰之功效，用以治疗肾炎、膀胱炎、尿道炎、咳嗽等。药理学相关研究表明，毛果鱼藤具有抗糖尿病［8］、抗肿瘤［9］、抗菌［10］等作用。近年来的民间应用经验表明，毛果鱼藤还具有抗高尿酸、抗痛风作用，为深入探讨其药理作用及相关机制，本研究应用网络药理学分析毛果鱼藤作用于动物和细胞潜在的作用机制及靶点，通过动物实验及细胞实验，证实毛果鱼藤抗高尿酸血症作用及可能机制，为研究新型高效低毒的抗高尿酸血症药物提供实验依据。1 材料1.1　动物雄性SPF级昆明种小鼠，体质量18~22 g，雄性SPF级SD大鼠，体质量180~220 g，均购买于长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号SCXK（湘）2019-0014。实验动物饲养于广西壮族自治区中医药研究院SPF级动物房中，使用许可证号SYXK（桂）2016-0006。动物房环境温度为（22±3） ℃，相对湿度为60%±5%，12 h明暗交替。本实验经广西壮族自治区中医药研究院动物实验中心伦理委员会批准（批准号为2022090701）。1.2　药物及试剂毛果鱼藤藤茎采自广西靖西，经广西中医药大学田慧教授鉴定为豆科植物毛果鱼藤的干燥藤茎。毛果鱼藤醇提物的制备：称取毛果鱼藤1 000 g，分别加70%乙醇6 L回流提取3次，每次l h，过滤，滤液回收浓缩，即得。罗通定片（四川迪菲特药业有限公司，批号200202）；秋水仙碱片（云南植物药业有限公司，批号20211104）；脂多糖（LPS）［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号0000135217］；RNA裂解液、ChamQ SYBR实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR） Master Mix、HiScripⅢ RT SuperMix for Real-time PCR、细胞增殖与活性检测（CCK-8）试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号分别为017E2260FA、027E2220DA、7E542I1、L/N7E550B1）；NP-40裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为062722220819、030922220713、092721220323）；Toll样受体4（TLR4）抗体、核转录因子-κB（NF-κB）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为10005089、10005701）；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号分别为5019987、12w2944）；SDS-PAGE protein Ru）nning Buffer、蛋白免疫印迹法（Western blot）Transfer Buffer（苏州新赛美生物科技有限公司，批号分别为N20210817、N20210403）；小鼠TLR4、NF-κB、小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（上海泛柯实业有限公司，批号均为Sep 2022）。1.3　仪器Nanodrop One型超微量核酸蛋白测定仪（美国Thermo Fisher公司）；LightCycler 480 Ⅱ型Real-time PCR仪（瑞士Roche公司）；EVOS FL Auto型全自动细胞成像系统（美国Life公司）；Synergy H1型多功能酶标检测仪（美国Bio Tek公司）；Mini-PROTEAN Tetra型电泳仪、Mini Trans-Blot cell型转膜仪（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　毛果鱼藤抗痛风作用的网络药理学学分析2.1.1　活性成分及靶点的筛选经文献查询［11-13］收集药物活性成分。从数据库（http：//www.swisstargetprediction. ch/；http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/ Home/ Login/login.html）收集各成分靶点。其中，Swiss Target Prediction数据库的筛选条件为Probability0，TCMIP的筛选条件为相似性阈值≥0.6。2.1.2　疾病靶点的筛选从GeneCards（http：//www.genecards.org/）、HPO（https：//hpo.jax.org/app/）、DrugBank（https：//go.drugbank.com/）等数据库收集高尿酸肾病的靶点。2.1.3　药物成分及疾病的共有靶点筛选使用在线韦恩图工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）对药物成分靶点及疾病靶点进行交集，获得共有靶点。2.1.4　蛋白质互相作用（PPI）网络构建及hub节点筛选使用在线蛋白互作工（https：//cn.string-db.org/）构建PPI网络图，并下载TSV蛋白互作文件用于Cytoscape计算hub节点。2.1.5　基因本体（GO）富集和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析将关键药物-疾病靶点使用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）分析，得到GO条目和KEGG通路。2.1.6　“药物-靶点-疾病”网络的构建使用Cytoscape软件构建毛果鱼藤化学成分和高尿酸肾病的核心交集靶点及非核心交集靶点网络。2.1.7　分子对接取度中心（Degree）值≥中位数的成分作为对接成分，取与炎症相关的核心靶点TLR4、NF-κB和该通路上的关键靶点NLRP3作为对接靶点。通过PDB网站下载各靶点的PDB结构，通过pubchem网站下载各成分的3D结构，使用autodock软件对各成分的3D结构进行加氢、去水等，最后使用AGFR软件进行分子对接。2.2　毛果鱼藤醇提物对高尿酸血症小鼠尿酸的影响昆明种小鼠60只，雄性，体质量22~18 g，随机分为6组，每组10只，分别为正常组、模型组、别嘌醇片组（0.05 g·kg-1）、毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组（分别相当于药材20、10、5 g·kg-1）。灌胃给药，每天1次，正常组和模型组灌胃给予等容量蒸馏水，连续12 d。末次给药l h后腹腔注射次黄嘌呤500 mg·kg-1，2.5 h后眼球取血，3 000 r·min-1离心10 min（离心半径8 cm），取上清液，磷钨酸比色法测血清尿酸水平。2.3　抗炎作用2.3.1　毛果鱼藤醇提物对MSU致大鼠足跖肿胀的影响［14］MSU的制备，将尿酸10 g置500 mL沸水中，NaOH溶液将pH调至7.4，加热至96 ℃，室温条件冷却并搅拌，过滤，将结晶置于200 ℃烘干，用时用无菌生理盐水配成100 g·L-1。Wistar雄性大鼠60只，体质量180~220 g，随机分为6组，每组10只，即正常组、模型组、秋水仙碱组（0.001 g·kg-1）、毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组（分别相当于药材20、10、5 g·kg-1）。灌胃给药，每天1次，正常组和模型组给予等容量蒸馏水，连续7 d。末次给药1 h后，于大鼠右后足跖皮下注射0.15 mL MSU（100 g·L-1），测定注射后第1、3、5、6、7小时大鼠右后足跖肿胀情况，计算其肿率。肿胀率=100×（右脚周径-左脚周径）/左脚周径×100%。2.3.2　毛果鱼藤醇提物对二甲苯引起耳廓肿胀的影响昆明种小鼠50只，雄性，体质量22~18 g，随机分为5组，每组10只，即模型组、地塞米松组（0.001 g·kg-1）、毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组（分别相当于药材20、10、5 g·kg-1）。灌胃给药，每天1次，模型组灌胃给予等容量蒸馏水，连续7 d。第7天给药后1 h，于各组小鼠左耳两面均匀涂抹二甲苯0.05 mL，30 min后脱颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8 mm的打孔器在同一部位打下耳片，称重，测肿胀度和抑制率，肿胀度以每只鼠左右耳片重量之差（mg）来表示，肿胀率=100×（左耳质量-右耳质量）/右耳质量×100%。2.4　镇痛作用2.4.1　毛果鱼藤醇提物对醋酸引起小鼠扭体反应的影响取昆明种小鼠50只，雄性，体质量18~22 g，随机分为5组，每组10只。随机分成5组，即模型组、罗通定组（0.06 g·kg-1）、毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组。灌胃给药，模型组给予等容量蒸馏水。给药后1 h，每只鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL，5 min后计数20 min内各小鼠出现的扭体反应次数。2.4.2　毛果鱼藤醇提物对小鼠热板痛阈的影响将50只预先经筛选的雌性昆明种小鼠（除去反应过敏5 s及迟钝30 s的小鼠），随机分成5组，即模型组、罗通定组（0.06 g·kg-1）、毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组。灌胃给药，模型组给予等容量蒸馏水，于给药后60 min测痛阈值。2.5　毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4-NF-κB/TNF-α/NLRP3信号通路的影响［15］2.5.1　CCK-8法检测RAW264.7细胞存活率细胞培养RAW264.7细胞均使用10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期RAW264.7细胞，以１×105 mL-1密度接种于96孔板中，每孔100 μL，置于培养箱中培养24 h。设置正常组及毛果鱼藤醇提物（相当于500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.95、1.95 g·L-1）组，弃去培养基，给药组分别加入不同质量浓度药液溶液100 μL，每组6个复孔，正常组加入等体积蒸馏水，继续培养24 h后弃去培养基，每孔加入含CCK-8的工作液100 μL，置于37 ℃恒温培养箱孵育1 h，测450 nm波长处吸光度A，计算细胞存活率，通过gradpad 8.0统计软件求得药物的半数抑制浓度（IC50）。2.5.2　ELISA检测RAW264.7细胞培养上清液TNF-α、NF-κB、IL-6、TLR-4含量取对数生长期RAW264.7细胞，接种于6孔板中，培养过夜，细胞融合率达到70%时，设置正常组及毛果鱼藤醇提物（相当于2、1、0.5 g·L-1）组，LPS激发炎症（1 mg·L-1），继续培养24 h后收集细胞培养上清液，ELISA法检测RAW264.7细胞培养上清液TNF-α、NF-κB、IL-6、TLR-4含量。2.5.3　Western blot检测相关蛋白表达取对数生长期RAW264.7细胞，接种于6孔板中，培养过夜，细胞融合率达到70%时，设置正常组及毛果鱼藤醇提物（相当于2、1、0.5 g·L-1）组，LPS激发炎症（1 mg·L-1），继续培养24 h后，收集细胞，加裂解液后于冰上裂解30 min，4 ℃、1 200 r·min-1离心15 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量，95 ℃变性5 min。各组取等量蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳分离，蛋白转移至PVDF膜上，加入一抗NLRP3（1∶300）、TLR4（1∶500）、NF-κB（1∶1 000）4 ℃过夜，次日以TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST摇床洗膜3次，每次10 min，采用化学发光法显影，通过Image J软件测量灰度值，计算目的蛋白的相对表达。2.5.4　Real-time PCR检测TLR4 mRNA水平取对数生长期RAW264.7细胞，接种于6孔板中，培养过夜，细胞融合率达到70%时，设置正常组及毛果鱼藤醇提物（相当于2、1、0.5 g·L-1）组，LPS激发炎症（1 mg·L-1），继续培养24 h后，收集细胞，采用TRIzol试剂提取总RNA，采用PrimeScript RT Reagent Kit将RNA逆转录成为cDNA，采用ChamQ SYBR Real-time PCR Master Mix进行Real-time PCR扩增。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。TLR4的引物序列为：上游5′-GCCATCATTATGAGTGCCAATT-3′，长度22 bp；下游5′-AGGGATAAGAACGCTGAGAATT-3′，长度22 bp。GAPDH引物系列为：上游 5′-GGTTGTC TCCTGCGACTTCA-3′，长度20 bp；下游5′-TGG TCCAGGGTTTCTTACTCC3′，长度21 bp。反应总体系20 µL，反应条件为95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，共45个循环，使用2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平。2.6　统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，数据采用x¯±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　毛果鱼藤抗高尿酸血症的网络药理学学分析3.1.1　毛果鱼藤的化学成分及预测靶标经文献查询，共筛选出活性成分15个，见表1。各成分靶点主要从以下2个数据库收集（http：//www.swisstargetprediction.ch/；http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html），删除重复项后得到药物成分靶点1 031个。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T001表 1毛果鱼藤活性成分Table 1Active ingredients of Derris eriocarpa序号成分名英文名CAS号MGYT01β-香树脂醇beta-Amyrin559-70-6MGYT02顺式-10-十九碳烯酸C19∶1 （CIS-10） ACID73033-09-7MGYT03豆甾-4-烯-3-酮B-SITOSTENONE1058-61-3MGYT04白桦脂酸Betulonicacid4481-62-3MGYT05β-谷甾醇beta-Sitosterol83-46-5MGYT06丁香酸Syringic acid530-57-4MGYT07flemichapparin Bflemichapparin B3187-53-9MGYT08derrubonederrubone22044-58-2MGYT09甘草宁GGancaonin G126716-34-5MGYT10derrusninderrusnin14736-62-0MGYT11美迪紫檀素MEDICARPIN（P）33983-39-0MGYT12大黄素Emodin518-82-1MGYT13香叶木素DIOSMETIN520-34-3MGYT147，3'-dihydroxy-8，4'-dimethoxyisoflavone7，3'-dihydroxy-8，4'-dimethoxyisoflavone53947-99-2MGYT15alpinumisoflavonealpinumisoflavone34086-50-53.1.2　疾病靶点痛风疾病的靶点主要从GeneCard、HPO、DrugBank等数据库收集而得，删除重复项后，共获得499个靶点。使用在线韦恩图工具对药物成分靶点及疾病靶点做交集，得到共有靶点87个。见增强出版附加材料。3.1.3　毛果鱼藤调控痛风的潜在靶点使用在线蛋白互作工具构建PPI网络图，并下载TSV蛋白互作文件，通过Cytoscape软件对PPI网络文件进行可视化，根据网络拓扑结构分析筛选得到Hub节点共12个，这12个基因即毛果鱼藤调控痛风的潜在关键靶点。见增强出版附加材料，绿色为其余靶点，红色为关键靶点。3.1.4　KEGG通路及GO生物过程富集分析将12个关键药物-疾病靶点使用DAVID数据库分析，得到GO条目结果227条，其中，生物过程（BP）条目188条，细胞组成（CC）11条，分子功能（MF）28条，分别选择每个条目的前10条，见增强出版附加材料。这些靶点的生物过程主要为一氧化氮生物合成过程的正调控，基因表达的正向调控，细胞对缺氧的反应，转录、DNA模板的正调控、发热的正调控，细胞对之多糖的反应，RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控，凋亡过程的正调控，IL-8生成的正调控等过程；细胞组成主要为核染色质、细胞质、核浆、内质网等；分子功能主要为蛋白结合、酶结合、转录因子结合、无序区域特异性结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等。富集得到KEGG通路70条，前20条（见增强出版附加材料），主要的通路为IL-17信号通路、C型凝集素受体信号通路、酒精性肝病、非酒精性肝病信号通路等。使用Cytoscape软件构建毛果鱼藤化学成分和痛风的核心交集靶点及非核心交集靶点网络，见增强出版附加材料，其中，蓝色代表非核心交集靶点，红色代表核心交集靶点，绿色代表毛果鱼藤的化学成分。核心交集靶点为TLR4、TNF、IL1B、INS、SIRT1、PPARG、PPARA、TP53、PTGS2、SRC、IL6、ALB。3.1.5　分子对接根据Degree值选取≥中位数的活性成分，得到7个关键成分，分别为Alpinumisoflavone、Beta-Amyrin、Betulonicacid、Derrusnin、Diosmetin、Emodin、Syringic acid，将这7个成分分别与TLR4、NF-κB、NLRP3进行分子对接，得到21组数据，对接结果见表2、见增强出版附加材料。从表2可知，除Syringic acid与TLR4、NLPR3的结合能-5 kcal·mol-1以外，其余各组数据的结合能均在-5 kcal·mol-1以下，表明这些成分均能与TLR4通路上的关键靶点结合。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T002表 2分子对接结果Table 2Molecular docking resultsIngredienttargetBinding energy/kcal·mol-1Beta-amyrinTLR4-8.8BetulonicacidTLR4-7.4DerrusninTLR4-6.7DiosmetinTLR4-6.7EmodinTLR4-7.8Syringic acidTLR4-4.5AlpinumisoflavoneTLR4-7.1Beta-amyrinNLRP3-5.2BetulonicacidNLRP3-5.8DerrusninNLRP3-6.1DiosmetinNLRP3-6.6EmodinNLRP3-6.2Syringic acidNLRP3-4.5AlpinumisoflavoneNLRP3-5.7Beta-amyrinNF-κB-7.8BetulonicacidNF-κB-7.5DerrusninNF-κB-6.3DiosmetinNF-κB-6.9EmodinNF-κB-6.5Syringic acidNF-κB-5.2AlpinumisoflavoneNF-κB-7.13.2　毛果鱼藤醇提物对高尿酸血症小鼠尿酸的影响与正常组比较，模型组小鼠血清尿酸水平显著增高（P0.01）；与模型组比较，毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组小鼠血清尿酸水平显著降低（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T003表 3毛果鱼藤醇提物对高尿酸血症小鼠尿酸的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of alcohol extract of Derris eriocarpa on uric acid in hyperuricemic mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1尿酸/µmol·L-1正常组198.69±75.95模型组276.64±63.812）别嘌醇片组0.05174.02±105.314）毛果鱼藤醇提物高剂量组20182.43±121.854）毛果鱼藤醇提物中剂量组10168.41±129.854）毛果鱼藤醇提物低剂量组5189.16±125.284）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表4-表7同）3.3　抗炎作用3.3.1　毛果鱼藤醇提物对MSU致大鼠足跖肿胀的影响与正常组比较，模型组大鼠足跖肿胀度显著升高（P0.01）；与模型组比较，毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组在造模后5、6 h，均能明显抑制大鼠足跖肿胀（P0.05，P0.01）。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T004表 4毛果鱼藤醇提物对MSU致大鼠足跖肿胀的影响 （x¯±s，n=10）Table 4Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on paw swelling induced by MSU in rats （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1给药前足跖周径/mm给药后足跖肿胀率/%1 h3 h5 h6 h7 h正常组26.3±1.33.92±3.233.54±3.463.52±3.353.14±3.103.15±3.49模型组26.2±0.87.67±4.471）15.34±4.592）21.89±8.642）17.62±3.482）14.19±3.372）秋水仙碱组0.00126.0±0.74.63±2.4315.47±4.3313.53±4.483）12.74±3.854）13.51±3.03毛果鱼藤醇提物高剂量组2025.8±0.64.65±1.6114.37±3.7212.03±3.894）10.15±4.784）11.28±4.02毛果鱼藤醇提物中剂量组1026.1±1.24.98±1.8313.56±4.9712.06±6.014）10.89±6.014）10.13±4.65毛果鱼藤醇提物低剂量组526.1±0.95.02±2.7414.48±4.4613.61±7.203）11.25±5.914）11.64±5.783.3.2　毛果鱼藤醇提物对二甲苯引起耳廓肿胀的影响与模型组比较，毛果鱼藤醇提物高、中剂量组的肿胀度明显降低（P0.05）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T005表 5毛果鱼藤醇提物对二甲苯引起耳廓肿胀的影响 （x¯±s，n=10）Table 5Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on auricular swelling induced by xylene （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1肿胀度/mg肿胀率/%模型组20.58±4.03-地塞米松片组0.00117.87±8.4413.17毛果鱼藤醇提物高剂量组2014.42±6.793）29.93毛果鱼藤醇提物中剂量组1016.16±3.983）21.48毛果鱼藤醇提物低剂量组516.08±6.7721.863.4　镇痛作用3.4.1　毛果鱼藤醇提物对醋酸引起小鼠扭体反应的影响与模型组比较，毛果鱼藤醇提物高、中、低剂量组小鼠扭体次数明显减少（P0.05，P0.01）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T006表 6毛果鱼藤醇提物对醋酸引起小鼠扭体反应的影响 （x¯±s，n=10）Table 6Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on acetic acid-induced writhe response in mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1扭体次数/次模型组30.20±19.47罗通定片组0.063.00±4.374）毛果鱼藤醇提物高剂量组208.60±8.274）毛果鱼藤醇提物中剂量组1012.10±17.523）毛果鱼藤醇提物低剂量组59.50±11.224）3.4.2　毛果鱼藤醇提物对小鼠热板痛阈的影响与模型组比较，毛果鱼藤醇提物高剂量组可明显提高小鼠热板痛阈，差异有统计学意义（P0.05）。见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T007表 7毛果鱼藤醇提物对小鼠热板痛阈的影响 （x¯±s，n=10）Table 7Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on hot plate pain threshold in mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1给药30 min后热板痛阈给药60 min后热板痛阈给药90 min后热板痛阈给药120 min后热板痛阈模型组12.6±6.223.3±19.720.1±21.322.0±15.7罗通定片组0.0651.0±14.660.0±0.060.0±0.059.2±2.8毛果鱼藤醇提物高剂量组2018.3±17.434.9±19.943.6±20.83）55.6±13.33）毛果鱼藤醇提物中剂量组1015.7±15.231.1±25.432.1±24.437.5±24.2毛果鱼藤醇提物低剂量组515.4±7.826.5±14.439.4±24.027.2±23.3s3.5　毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的影响CCK-8结果表明，随着毛果鱼藤醇提物给药浓度增加，RAW264.7巨噬细胞存活率逐渐降低，IC50为68.159 g·L-1。ELISA检测结果表明，与正常组比较，LPS组中TLR4、NF-κB的水平显著升高（P0.01）；与LPS组比较，毛果鱼藤醇提物高质量浓度组中TLR4、TNF-α、IL-6、NF-κB水平明显降低（P0.05，P0.01），毛果鱼藤醇提物中质量浓度组中TLR4、TNF-α、IL-6、NF-κB水平显著降低（P0.01），毛果鱼藤醇提物低质量浓度组中TLR4、TNF-α、NF-κB水平显著降低，差异有统计学意义（P0.01）。见表8。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T008表 8毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4、NF-κB、TNF-α水平的影响 （x¯±s，n=6）Table 8Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on TLR4， NF-κB and TNF-α levels induced by LPS in RAW264.7 macrophages （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1TLR-4/μg·L-1TNF-α/ng·L-1IL-6/ng·L-1NF-κB/ng·L-1正常组14.88±0.83404.64±9.2285.29±2.79696.25±31.13LPS组0.00115.70±0.882）444.82±19.7487.77±3.82759.06±35.502）毛果鱼藤醇提物高质量浓度组214.40±0.514）424.29±8.504）83.42±3.183）690.00±23.454）毛果鱼藤醇提物中质量浓度组113.95±0.294）397.86±14.144）78.52±4.314）663.44±24.534）毛果鱼藤醇提物低质量浓度组0.513.96±0.464）412.86±12.124）83.97±1.52682.81±30.614）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与LPS组比较3）P0.05，4）P0.01（表9和表10同）3.6　毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4 mRNA水平的影响与正常组比较，LPS组TLR4 mRNA水平明显增高（P0.05）；与LPS组比较，毛果鱼藤醇提物组显著降低（P0.05，P0.01）。见表9。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T009表 9毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4 mRNA水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 9Effect of alcohol extract of D. eriocarpa on TLR4 mRNA levels induced by LPS in RAW264.7 macrophages （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1TLR4正常组1.00±0.07LPS组0.0011.26±0.081）毛果鱼藤醇提物高质量浓度组20.51±0.283）毛果鱼藤醇提物中质量浓度组10.61±0.114）毛果鱼藤醇提物低质量浓度组0.50.67±0.213）3.7　毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4、NF-κB、NLRP3表达的影响与正常组比较，模型组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白的表达显著增高（P0.01）；与模型组比较，毛果鱼藤醇提物各组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白的表达明显降低（P0.05，P0.01）。见图1、表10。10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.F001图 1各组NLRP3、TLR4、NF-κB蛋白表达电泳Fig. 1Protein expression electrophoresis of NLRP3， TLR4， and NF-κB in each group注：A.正常组；B.LPS组；C.毛果鱼藤醇提物高质量浓度组；D.毛果鱼藤醇提物中质量浓度组；E.毛果鱼藤醇提物低质量浓度组10.13422/j.cnki.syfjx.20230509.T010表 10毛果鱼藤醇提物对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4、NF-κB、NLRP3表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 10Effect of alcohol extract of D.eriocarpa on LPS-induced expression of TLR4， NF-κB and NLRP3 in RAW264.7 （x¯±s，n=3）组别质量浓度/g·L-1TLR4/β-actinNLRP3/β-actinNF-κB/β-actin正常组1.16±0.030.42±0.010.89±0.03LPS组0.0011.41±0.012）1.04±0.052）1.37±0.052）毛果鱼藤醇提物高质量浓度组20.98±0.044）0.59±0.004）0.74±0.014）毛果鱼藤醇提物中质量浓度组11.25±0.024）0.75±0.024）0.60±0.024）毛果鱼藤醇提物低质量浓度组0.50.15±0.014）0.80±0.044）0.81±0.014）4 讨论基于毛果鱼藤在民间用于治疗痛风取得的良好疗效，通过网络药理学分析及分子对接，筛选出毛果鱼藤抗痛风的TLR4、NF-κB、NLRP3等可能靶点。通过体内外研究验证，结果表明毛果鱼藤醇提物具有良好的抗痛风作用，同时基于毛果鱼藤醇提物的抗MSU致大鼠足跖肿胀、抗二甲苯引起耳廓肿胀的药理活性，提示其抗痛风作用跟其抗炎活性有关。进一步研究结果表明，毛果鱼藤醇提物可显著抑制LPS诱导RAW 264.7细胞的TLR4 mRNA水平，降低TLR4、NF-κB、NLRP3的表达及TNF-α、NF-κB、IL-6、TLR-4的分泌，抗痛风的分子机制与TLR4/NF-κB/NLRP3通路密切相关。体内、体外的实验研究结果验证了网络药理对毛果鱼藤抗痛风作用及可能分子机制的预测。高尿酸血症是痛风的病理学基础。MSU作用于细胞表面TLRs，活化NF-κB，激活靶基因NLRP3和IL-1β的转录，形成非活性前体IL-1β（pro-IL-1β），细胞内激活的NLRP3炎症体，Casepase-1蛋白酶剪切pro-IL-1β，形成成熟的IL-1β释放至胞外，诱导炎症反应发生［16-18］。TLR4是一种Ⅰ型跨膜蛋白，其活化依赖MyD88和TRIF，通过募集这两种接头蛋白激活转录因子NF-κB、AP-1和干扰素调节因子3，并诱导促炎因子（IL-β、TNF-α、IL-6、CXCL10）的生成、上调COX-2等蛋白的表达，最终激活炎症反应［19-21］。毛果鱼藤醇提物可抑制LPS诱导RAW 264.7细胞的TLR4 mRNA水平、表达，抑制了痛风性炎症的关键靶标。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1组成，NLRP3是一种模式识别受体，可识别内源性及外源性的危险信号，是NLRs家族中重要成员，广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞，参与IL-1β和IL-1β的加工、分泌诱导细胞炎症或凋亡［22-24］。毛果鱼藤醇提物可抑制LPS诱导RAW 264.7细胞NLRP3的表达，阻断炎症反应的另一个重要靶标。相应的，相关的炎症因子（TNF-α、NF-κB、IL-6）分泌减少，显示毛果鱼藤醇提物可多靶点的干预炎症过程。毛果鱼藤的主要成分为大黄素、香叶木素、美迪紫檀素等活性成分，部分具有抗炎镇痛等药理活性。大黄素可显著提高弗氏完全佐剂诱导的炎性疼痛小鼠的机械疼痛和热痛阈值，具有一定的镇痛作用［25］；可调节Nrf-2/HO-1和MAPK信号通路，抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞炎症和氧化应激具有一定的抗炎抗氧化应激作用［26］。香叶木素可改善肝脏缺血/再灌注小鼠血清水平具有一定的抗炎作用［27］；美迪紫檀素可降低TNF-α、IL-6、IL-17A水平，同时上调了IL-10水平对胶原蛋白诱导关节炎小鼠具有一定的治疗作用［28］。毛果鱼藤醇提物诸多活性成分协同作用，缓解痛风的高尿酸血症、抗炎、镇痛等病理过程，多靶点、多病理过程的干预痛风的病理过程，其更详实的分子机制，有待进一步研究。