痛风是体内饱和的尿酸沉积在关节腔形成单尿酸钠（MSU）晶体，引发炎症反应和局部组织破坏的临床综合征［1］。流行病学显示目前全球痛风总体发生率为0.1%~10%［2］，我国约为2%，且呈低龄化趋势，影响患者生活质量，给社会造成负担［3］。急性痛风性关节炎（AGA）是痛风最常见的首发症状，此时沉积在关节腔的MSU晶体激活免疫细胞，引起局部炎症反应和关节损伤，导致关节红、肿、热、痛，活动受限［4］。临床治疗AGA的药物包括秋水仙碱、非甾体类抗炎药、糖皮质激素等［5］，但因较多的不良反应存在着用药局限性［3，5］。从中医药中寻找治疗痛风的药物具有良好的前景［6］。黄连解毒汤源于葛洪《肘后方》卷二，由黄连、黄柏、黄芩、栀子4味中药组成，是清热解毒的经典代表方剂［7］。临床应用黄连解毒汤治疗AGA疗效确切，但其机制尚未完全阐明［8-10］。研究表明，关节腔内的MSU作为危险信号分子可被Toll样受体（TLRs）识别进而激活下游依赖性核转录因子-κB（NF-κB），从而启动与炎症免疫有关的细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6等的表达与分泌［11］；同时，MSU可直接或间接激活NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体，最终产生成熟体IL-1β，引发AGA［12］。因此，本研究通过给予小鼠踝关节注射MSU建立AGA模型，观察黄连解毒汤干预对其炎性损伤及NLRP3炎性小体、TLR4/NF-κB信号通路的影响，为临床黄连解毒汤治疗AGA提供实验依据。1 材料1.1　动物8周龄SPF级C57BL/6J小鼠80只，雄性，体质量（20±2） g，购自北京维通利华实验技术有限公司。动物合格证编号111251211100071768。实验用鼠饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物房，采用标准饲料分笼饲养，自由饮水，室内温度（22±2） ℃，室内湿度（45±5）%，光照时间为12 h/12 h明暗交替。实验动物使用许可证号SYXK（京）2021-0017。动物实验符合中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物福利伦理审查委员会标准，编号2020-023。1.2　药物及试剂黄连、黄芩、黄柏、栀子饮片购于北京同仁堂药店（批号分别为20210324、20061401、210505001、19091802），饮片由北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为正品。秋水仙碱片（昆药集团有限公司，国药准字H53021389）；尿酸钠（美国Sigma公司，货号U2875-100G）；苏木素（北京九州柏林生物科技有限公司，批号20191119）；伊红（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号18091203）；逆转录试剂盒（日本Takara公司，货号RR047A）；SYBR Green预混液（美国Invitrogen公司，货号A25742）；RIPA裂解液、SDS上样缓冲液（北京普利莱基因有限公司，货号分别为C1053、B1012）；BCA法蛋白定量试剂盒（北京兰博利德生物有限公司，货号B50000）；小鼠IL-1β酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，货号88-7013-77）；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（美国BD公司，货号分别为555268、555240）；NLRP3和NF-κB抗体（美国Abcam公司，货号分别为ab263899、ab32536）；TLR4、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、胱天蛋白酶-1（Caspase‑1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Proteintech公司，货号分别为66350-1-Ig、67494-1-Ig、22915-1-AP、10494-1-AP）。1.3　仪器PD-151型游标卡尺（上海宝工工具有限公司）；DM6000B型显微图像系统（德国Leica公司）；CFX96 TouchDeepWel型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；Epoch2型酶标仪（美国BioTek公司）；DYY-6D型电泳仪（北京市六一仪器厂）；Mini-Trans Blot小型蛋白电转印槽（美国Bio-Rad公司）；odyssey型双色红外激光成像系统（美国Gene公司）。2 方法2.1　药物制备黄连解毒汤水煎液：黄连9 g、黄柏6 g、黄芩6 g、栀子9 g，常规煎煮，浓缩成含黄连解毒汤生药0.5 g·mL-1。秋水仙碱溶液：配制成0.83 g·L-1的秋水仙碱溶液。2.2　MSU混悬液的制备根据Coderre记载的方法［13］，取MSU溶于NaOH中，加入无菌生理盐水，搅拌加热溶解，冷却后调pH 7.2，3 000 r·min-1离心15 min（离心半径10 cm，下同），转移于容量瓶中，4 ℃过夜。次日，3 000 r·min-1离心15 min，收集沉淀即MSU晶体，高压灭菌烘干后保存备用。使用时研磨MSU晶体，用无菌生理盐水过40 mm细胞筛配成MSU晶体混悬液（50 g·L-1）。2.3　动物实验分组与给药方法所有动物于动物房适应性饲养1周后进行实验。40只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组和黄连解毒汤组。模型组、秋水仙碱组和黄连解毒汤组采用0.3 mL注射器沿小鼠右侧胫骨和腓骨间垂直进针穿刺至关节间隙［14］，注射MSU混悬液30 μL至踝关节。正常组采用相同方法注射等体积无菌生理盐水。随后给药组分别给予相当于临床等效剂量的秋水仙碱（0.83 mg·kg-1）和黄连解毒汤水煎液（5 g·kg-1）干预，观察7 d，处死后截取小鼠右下肢放入4%多聚甲醛固定，用于病理检测。另外40只C57BL/6J小鼠按上述方法处理，造模18 h后，处死小鼠取右踝关节，放入-80 ℃保存，用于提取组织RNA和蛋白。2.4　游标卡尺测量AGA小鼠踝关节肿胀程度变化采用游标卡尺每天测量小鼠右侧踝关节直径，计算肿胀度［15］。计算公式如下：踝关节肿胀度（mm）=测定点踝关节直径-造模前踝关节直径。2.5　苏木素-伊红（HE）染色观察AGA小鼠踝关节组织病理变化造模7 d处死小鼠，取小鼠右下肢4%多聚甲醛溶液中固定72 h，脱钙后，常规方法石蜡包埋、切片和HE染色，显微镜观察踝关节组织病理变化。2.6　Real-time PCR检测AGA小鼠踝关节中IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达水平造模18 h后，处死小鼠，每组5只取右侧踝关节提取RNA，另外5只，取相同部位提取蛋白。测定RNA浓度后根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA。使用SYBR Green预混液进行PCR，分别在95 ℃、15 s和60 ℃、1 min的条件下使用Real-time PCR仪以cDNA为模版进行PCR扩增，利用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达水平。用于该反应的引物信息见表1，所有引物均由北京普慧智远科技有限公司合成。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.T001表 1引物序列Table 1Primer sequence引物序列长度/bpIL-1β上游5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'116下游5'-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3'TNF-α上游5'-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3'122下游5'-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3'IL-6上游5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3'131下游5'-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3'NLRP3上游5'-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3'83下游5'-CATGAGTGTGGCTAGATCCAAG-3'ASC上游5'-TGGAGTCGTATGGCTTGGAG-3'247下游5'-TGTCCTTCAGTCAGCACACT-3'Caspase-1上游5'-ACTCGTACACGTCTTGCCCTC-3'190下游5'-CTGGGCAGGCAGCAAATTC-3'GAPDH上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'95下游5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'2.7　ELISA检测踝关节组织中IL-1β、TNF-α和IL-6含量参考李利生等［16］的方法提取踝关节蛋白，经BCA定量后，用于ELISA和蛋白免疫印迹法（Western bolt）检测。踝关节组织中IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白表达，根据ELISA试剂盒说明书依次进行包被、封闭、加样、加入检测抗体和链霉亲和素，最终加入TMB显色液和终止液，于酶标仪450 nm波长处读取吸光度A，后根据标准曲线换算为含量。2.8　Western bolt检测踝关节组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、TLR4、NF-κB的蛋白表达取踝关节蛋白加SDS上样缓冲液后煮沸变性，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，4 ℃孵育相应一抗（1∶1 000）过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，在成像系统中检测信号。使用Image J软件分析条带灰度值并进行统计分析。2.9　统计学分析实验重复3次，应用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，数据采用x¯±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　对AGA小鼠踝关节肿胀度的影响正常组小鼠在注射生理盐水后，右踝关节发生一过性的肿胀，随后肿胀消退，于第3天恢复到正常状态。与正常组比较，在第1—6天模型组小鼠注射MSU右踝关节肿胀度显著显著升高（P0.01），在第2天前后肿胀达到峰值，随后肿胀消退。与模型组比较，在第1~5天秋水仙碱组明显降低AGA小鼠踝关节肿胀度（P0.05，P0.01），在第1~4天黄连解毒汤同样明显降低踝关节肿胀度（P0.05，P0.01），第7天右踝关节恢复到接近造模前状态。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.F001图 1黄连解毒汤对AGA小鼠踝关节肿胀度的影响 （x¯±s，n=10）Fig.1Effect of Huanglian Jiedutang on ankle swelling of acute gouty arthritis mice （x¯±s，n=10）注：A.正常组；B.模型组；C.秋水仙碱组；D.黄连解毒汤组（图2-图4同）与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.013.2　对AGA小鼠踝关节组织形态的影响造模7 d后HE染色观察到正常组小鼠组织结构正常，未见滑膜组织增生及炎症细胞浸润，也未见骨破坏。模型组小鼠结构正常，未见滑膜组织增生，但注射部位有明显的异物肉芽肿形成，有大量炎症细胞浸润，以巨噬细胞为主。与模型组比较，秋水仙碱组和黄连解毒汤组病理损伤程度明显减轻。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.F002图 2黄连解毒汤对AGA小鼠踝关节组织形态的影响 （HE，×50）Fig.2Effect of Huanglian Jiedutang on histopathology in ankle joint tissue of acute gouty arthritis mice （HE，×50）3.3　对AGA小鼠踝关节组织中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA和含量的影响Real-time PCR结果显示，与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和黄连解毒汤组明显降低了IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）。ELISA结果显示，与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织炎症因子IL-1β表达显著升高（P0.01），TNF-α、IL-6虽有升高的趋势但差异无统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组和黄连解毒汤组明显降低了IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.T002表 2黄连解毒汤对AGA小鼠踝关节组织中炎症因子含量和mRNA表达的影响 （x¯±s，n=5）Table 2Effect of Huanglian Jiedutang on content and mRNA expression of inflammatory cytokines in ankle tissue of AGA mice （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1IL-1β mRNATNF-α mRNAIL-6 mRNAIL-1β含量/ng·g-1TNF-α含量/ng·g-1IL-6含量/ng·g-1正常组1.01±0.171.00±0.041.01±0.1323.24±0.44210.07±9.58130.92±4.02模型组194.24±12.252）102.77±20.542）42.85±9.182）182.63±3.782）261.87±10.26159.54±9.36秋水仙碱组8.3×10-417.51±4.354）30.76±3.584）6.54±0.614）56.53±1.184）165.50±8.124）124.97±9.854）黄连解毒汤组5107.63±12.153）15.13±1.104）23.96±4.493）48.59±4.834）185.64±4.034）123.27±2.984）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表3和表4同）3.4　对AGA小鼠踝关节组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表达的影响Real-time PCR结果显示，与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织NLRP3、Caspase-1的表达水平明显升高（P0.05，P0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和黄连解毒汤组显著降低NLRP3、Caspase-1 mRNA表达水平（P0.01），ASC表达水平改变差异无统计学意义。见表3。Western bolt结果显示，与正常组比较，模型组小鼠踝关节组织NLRP3、Caspase-1的表达水平明显升高，差异有明显统计学意义（P0.05，P0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和黄连解毒汤组显著降低NLRP3、Caspase-1的蛋白表达水平，差异有显著统计学意义（P0.01）；ASC表达水平改变差异无统计学意义。见表3、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.T003表 3黄连解毒汤对AGA小鼠踝关节组织NLRP3炎性小体mRNA和蛋白表达的影响 （x¯±s，n=5）Table 3Effect of Huanglian Jiedutang on mRNA and protein expression of NLRP3 inflammasome in ankle tissue of AGA mice （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1NLRP3 mRNAASC mRNACaspase-1 mRNANLRP3/GAPDHASC/GAPDHCaspase-1/GAPDH正常组1.02±0.221.01±0.201.01±0.131.00±0.091.00±0.061.00±0.06模型组71.70±17.412）0.86±0.051.27±0.231）1.47±0.182）1.02±0.023.37±0.271）秋水仙碱组8.3×10-410.96±3.154）1.11±0.290.37±0.134）1.19±0.154）0.90±0.022.05±0.074）黄连解毒汤组50.76±0.084）0.83±0.010.59±0.034）0.41±0.104）1.15±0.111.17±0.104）10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.F003图 3各组小鼠关节组织NLRP3炎性小体蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of NLRP3 inflammasome protein expression in ankle tissue of each group mice3.5　对AGA小鼠踝关节组织中TLR4、NF-κB蛋白表达的影响Western bolt结果显示，与正常组比较，模型组踝关节组织中TLR4、NF-κB的表达水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组显著降低TLR4的蛋白表达水平（P0.01），对NF-κB的蛋白表达水平无影响；与模型组比较，黄连解毒汤组明显降低TLR4、NF-κB的蛋白表达水平（P0.05，P0.01）。见图4、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.F004图 4各组小鼠踝关节组织TLR4、NF-κB蛋白表达电泳Fig.4Electrophoresis of TLR4，NF-κB protein expression in ankle tissue of each group mice10.13422/j.cnki.syfjx.20230802.T004表 4黄连解毒汤对AGA小鼠踝关节组织TLR4、NF-κB蛋白表达的影响 （x¯±s，n=5）Table 4Effect of Huanglian Jiedutang on protein expression of TLR4，NF-κB in ankle tissue of AGA mice （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1TLR4/GAPDHNF-κB/GAPDH正常组1.00±0.081.00±0.11模型组4.16±0.362）2.12±0.242）秋水仙碱组8.3×10-43.22±0.414）2.46±0.22黄连解毒汤组51.56±0.234）1.69±0.213）4 讨论痛风是由嘌呤代谢异常引起的，是一种以高尿酸血症和MSU沉积为特征并伴有炎症反应的代谢性免疫疾病［17］。当MSU晶体沉积在关节内时，MSU晶体与局部微环境相互作用会激活固有免疫系统和适应性免疫系统，其中以固有免疫系统占主导地位［18］。MSU可以激活单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞等，吞噬MSU晶体，分泌炎症因子，释放溶酶体和细胞质酶，导致炎性损伤，引发AGA。中医认为，痛风内为脾、肝、肾等脏腑亏虚，气血运行失调；外为感受湿、热、浊、毒、痰等邪气，加之机体劳累、嗜食肥甘厚味及情志损伤等因素，内外合邪造成气机阻滞、脉络瘀阻，日久化热而发为痹病［19］。AGA属痛风的急性发作期，表现为关节红、肿、热、痛，病机为热毒，治法以清热解毒为主［20］。黄连解毒汤是清热解毒方的代表方，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，主治三焦火毒所致大热烦躁，口燥咽干，热甚发斑，身热下利等。黄芩、黄连、黄柏配伍清泻三焦火毒，栀子引邪从小便而出［21］。本研究中，笔者发现黄连解毒汤可以缓解AGA小鼠的踝关节肿胀，并可以减少AGA小鼠踝关节炎症细胞浸润，减轻炎性损伤。在炎症的早中期阶段，痛风患者关节液中IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症因子水平和白细胞水平明显升高［22］，临床研究发现靶向阻断IL‑1β的治疗可以预防痛风急性发作［23］，在已发作的痛风性关节炎中则可以显著控制炎症［24］。IL-1β由单核/巨噬细胞、树突状细胞产生，一方面能够激活内皮细胞上的IL-1β受体1型（IL-1R），释放炎症因子IL-8、CXCL1等招募中性粒细胞到关节腔中；另一方面作为内源性热源造成组织损伤，促进其他炎症因子如TNF-α、IL-6的表达［25］。TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生，能够诱导及增强IL-1和IL-6介导的炎症反应，诱发溶酶体及前列腺素（PG）释放，导致或加重炎症反应［26］。IL-6主要由Th2细胞产生，能够参与免疫应答，是炎症反应的促发剂［27］。有研究人员将IL-6作为判断痛风性关节炎等疾病活动性和严重程度的指标［28］。在本研究中，AGA模型小鼠踝关节组织中IL-1β、TNF-α和IL-6表达增加，黄连解毒汤可以降低AGA小鼠踝关节组织中IL-1β、TNF-α、IL-6的表达，抑制AGA炎症反应，缓解AGA。IL-1β在AGA的病理机制中发挥着重要作用，IL-1β的产生和成熟受TLR4/NF-κB和NLRP3炎性小体信号通路调控［29-30］，①启动信号：Toll2/4样受体识别MSU并被激活后，可与髓样分化因子88（MyD88）结合促使IL-1受体相关激酶磷酸化，最终激活核NF-κB，进而刺激NLRP3蛋白的上调及IL-1β前体（pro-IL-1β）、pro-IL-18的表达。②激活信号：MSU晶体促进NLRP3炎性小体的组装以及Caspase-1的活化，进而对下游炎症因子pro-IL-1β、pro-IL-18进行加工修饰，最终导致IL-1β、IL-18炎症因子的成熟及分泌。且采用NLRP3-/-和TLR4-/-小鼠制备的AGA模型，其炎症因子IL-1β表达及炎症反应显著降低［31-32］。在本研究中，模型小鼠关节NLRP3炎性小体与TLR4/NF-κB信号通路同时启动，黄连解毒汤可以调控这2条信号通路，抑制IL-1β、TNF-α、IL-6的表达，从而降低炎症反应，抑制AGA损伤。MSU晶体激活多条信号通路包括三磷酸腺苷（ATP）/嘌呤受体P2X7（P2X7R）信号通路、NLRP6炎性体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等［33］，本研究只检测和探讨了NLRP3炎性小体与TLR4/NF-κB两条信号通路，后续的研究将进一步加以验证。此外，由于小鼠踝关节免疫细胞难以获得，后续将在体外验证免疫细胞的功能，全面阐明黄连解毒汤抗AGA的药理机制，为黄连解毒汤临床治疗提供实验依据。综上所述，本研究从调控NLRP3炎性小体和TLR4/NF-κB信号通路的角度揭示了黄连解毒汤抗AGA的药理机制，为中医临床使用黄连解毒汤治疗痛风提供了新的科学证据。