泽泻为泽泻科植物东方泽泻Alismatis orientale或泽泻A. plantago-aquatica的干燥块茎，收载于2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》），功效为利水渗湿，泄热，化浊降脂［1］，是历代医家常用利尿药。盐泽泻作为泽泻的炮制品种，一同收载于2020年版《中国药典》，具有降血脂、降血糖、利尿、抗炎等多种生物活性［2-5］，其主要活性成分为萜类物质，如23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C和24-乙酰泽泻醇A等［6-9］。研究表明，泽泻盐制前后的利尿作用存在差异，但具体原因尚不明确［10-11］。由于化学成分是药效的物质基础，是中药产生药理活性及不同炮制品种效用差异的根本原因，故泽泻盐制前后的药效作用变化与其化学成分发生转变密切相关。研究发现，泽泻盐制过程中对23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C及其衍生物的含量影响较大［12-14］，可能会促进23-乙酰泽泻醇B生成24-乙酰泽泻醇A等，且24-乙酰泽泻醇A会进一步转化生成泽泻醇A，促使三萜类化合物发生脱水、氧化、去乙酰化等反应［15-17］，而关于其体内移行成分的研究相对缺乏，因此亟需探索泽泻盐制前后物质基础的差异。中药血清药物化学是以鉴别口服中药后血清中移行成分为基础的一种研究方法，可用于寻找中药的药效物质基础［18-19］。本研究拟采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS），对大鼠灌胃泽泻、盐泽泻水提液的含药血清进行分析，在自建泽泻化学成分库的基础上借助UNIFI 1.9.2软件匹配识别有关成分，比较泽泻盐制前后血清移行成分的异同，为泽泻、盐泽泻的药效物质基础研究提供数据支撑。1 材料BT125D型十万分之一电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，ACQUITY UPLC H-Class型超高效液相色谱仪、Xevo G2-S-Q-TOF型串联四级杆飞行时间高分辨质谱仪（美国Waters公司），KQ-250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），V200型真空离心浓缩仪（北京吉艾姆科技有限公司），1011015型恒温水浴电热锅（巩义市予华仪器有限责任公司），5427R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。环氧泽泻烯、泽泻醇F对照品（四川成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为CHB160606、CHB160926，纯度均≥98%），24-乙酰泽泻醇A、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇G对照品（成都瑞芬斯生物科技有限公司，批号分别为Z-061-170417、Y-036-171216、Z-045-180810、Z-062-181015、Z-047-181008，纯度均98%），泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇C对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号分别为ST14480120、ST14490120、ST32970105，纯度均97%），16-氧代泽泻醇A对照品（成都德思特生物技术有限公司，批号DST210924-346，纯度≥98%），乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。泽泻与盐泽泻饮片来源于同一批药材，由四川新荷花中药饮片股份有限公司炮制得到泽泻生品和盐制品（批号分别为2105090、2105145），由中国中医科学院中药研究所何希荣主管药师鉴定，符合2020年版《中国药典》规定。SPF级雄性SD大鼠9只，体质量210~230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2021-0011。本文所涉及的动物实验经中国中医科学院中药研究所实验动物伦理委员会批准，伦理审查编号2022B012。2 方法2.1　泽泻、盐泽泻水提液及供试品溶液的制备称取泽泻饮片200 g，加入8倍量水回流提取2次，每次1 h，滤过，合并2次滤液，减压浓缩至100 mL，得含生药量2 g·mL-1的泽泻水提液，同法制得盐泽泻水提液，4 ℃密闭储存备用。分别取上述提取液1 mL稀释10倍后，12 000 r·min-1离心（离心半径8 cm，下同）10 min，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得泽泻、盐泽泻供试品溶液。2.2　混合对照品溶液的制备分别精密称取泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇B、泽泻醇G、23-乙酰泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A、环氧泽泻烯、16-氧代泽泻醇A对照品适量，置于同一10 mL量瓶中，加入乙腈超声（40 kHz，250 W）溶解并定容，即得质量浓度为0.2 g·L-1的混合对照品溶液。2.3　色谱条件采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~10 min，10%~50% A；10~27 min，50%~95% A；27~27.1 min，95%~10% A；27.1~30 min，10% A），流速0.3 mL·min-1，柱温35 ℃，进样体积2 μL，全波长扫描（190~400 nm）。2.4　质谱条件采用电喷雾电离源（ESI），正离子模式扫描，锥孔反吹气流量50 L·h-1，脱溶剂气流量600 L·h-1，脱溶剂气温度400 ℃，离子源温度120 ℃，锥孔电压40 V，毛细管电压3.0 kV，碰撞电压15~40 eV，扫描范围m/z 100~1 200。2.5　血清样品的制备SD雄性大鼠适应性饲养3 d以后，随机分为空白组、泽泻组和盐泽泻组，每组3只，实验前12 h禁食不禁水，给药组灌胃相应药物的水提液，给药剂量为10 g·kg-1（大鼠生物等效剂量10倍），早晚各灌胃1次，连续3 d，空白组给予等体积饮用水，末次给药60 min后眼眶取血，室温静置30 min，4 ℃、3 500 r·min-1离心15 min，收集上清，将同一组别的血清样品混合均匀，-80 ℃冻存。空白组血清收集方式相同。2.6　血清样品的处理取血清样品200 μL，加入乙腈600 μL，涡旋，4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min后取上清液至干净离心管中离心浓缩（1 400 r·min -1，35 ℃），加乙腈100 μL复溶，4 ℃、13 000 r·min-1离心10 min后取上清液进行检测。2.7　数据分析与处理建立泽泻的化学成分库，将所得色谱图导入UNIFI 1.9.2软件，选择化合物筛查模式，进行精确分子量匹配。以空白组大鼠血清作为对照，扣除血清中内源性成分，筛选给药血清中的差异性成分，结合泽泻、盐泽泻水提液供试品中离子峰相对保留时间（tR）、质荷比及二级质谱图对比，得泽泻及盐泽泻的入血原型成分，并利用Mass Lynxv 4.1对数据进一步核对。利用UNIFI代谢物筛查模式，选择常见的代谢途径进行代谢物的匹配筛选，结合软件分析结果和文献报道，推测可能的代谢产物。计算泽泻、盐泽泻给药血清中共有原型成分和代谢成分的响应强度比（盐泽泻组/泽泻组）。3 结果3.1　泽泻与盐泽泻水提液入血成分的鉴定通过对空白组、泽泻组和盐泽泻组大鼠血清样品进行检测分析，得到各组与空白组血清样品的差异化学成分，各组样品正离子模式下的TIC图见增强出版附加材料。通过对照品比对、文献核对，结合化合物质谱可能的裂解规律，在给予泽泻组大鼠血清中共分析推测得到20个成分，其中包括5个原型成分和15个代谢成分；在盐泽泻组大鼠血清中分析推测得到14个成分，包括5个原型成分和9个代谢成分。见表1和表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.T001表1泽泻盐炙前后在大鼠血清中原型成分的UPLC-Q-TOF-MS信息Table 1UPLC-Q-TOF-MS information of prototypical components in rat serum before and after salt-processing of Alismatis Rhizoma化合物tR/min名称分子式离子模式m/z实测值δ/ppm二级碎片响应强度比Z18.5816-氧代泽泻醇A［20-23］C30H48O6［M+H］+505.351 0-2.7487.341 8、469.331 2，451.320 7、415.284 3、397.310 14.13Z210.06泽泻醇C［20-23］C30H46O5［M+H］+487.346 68.8469.337 5、451.326 7、433.310 2、397.276 1、353.245 21.20Z313.37泽泻醇A［20-23］C30H50O5［M+H］+491.372 2-2.8473.376 4、455.344 2、437.217 0、383.315 6、365.285 5、339.269 60.68Z414.9424-乙酰泽泻醇A［20-23］C32H52O6［M+Na］+555.366 51.6497.366 0、437.341 1、419.344 8、383.295 5、339.273 40.85Z516.70泽泻醇B［20-23］C30H48O4［M+H］+473.362 1-0.9437.341 4、339.268 21.60注：来源均为a~c（a.泽泻、盐泽泻水提液中鉴定出的成分；b.泽泻给药血清中鉴定出的成分；c.盐泽泻给药血清中鉴定出的成分）（表2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.T002表2泽泻盐炙前后在大鼠血清中代谢成分的UPLC-Q-TOF-MS信息Table 2UPLC-Q-TOF-MS information of metabolic components in rat serum before and after salt-processing of Alismatis Rhizoma化合物tR/min名称分子式m/z实测值δ/ppm二级碎片来源响应强度比18.5816-氧代泽泻醇A［20-22］C30H48O6505.351 0-2.7451.320 7、415.284 3、397.310 2b、c0.2928.59泽泻醇C同分异构体［20］C30H46O5487.341 80469.331 5、451.321 7、415.284 2、397.272 0b38.5923-乙酰泽泻醇C的脱氢氧化产物C32H46O6527.336 4-0.4469.331 5、451.321 7b412.14泽泻醇F同分异构体［20］C30H48O5489.357 3-0.2339.268 4b、c0.55513.39泽泻醇A［20-22］C30H50O5491.375 53.9383.294 8b、c0.68615.4023-乙酰泽泻醇B的脱氢氧化产物C32H48O5513.355 6-3.5453.298 1、337.206 3b716.75泽泻醇B的葡萄糖醛酸化产物C36H56O10649.398 05.2339.263 9b821.8316-氧代泽泻醇A的脱氢氧化产物C30H46O6503.691 21.2413.265 6b、c1.01924.4116-氧代泽泻醇A的加氧氧化产物C30H48O7521.349 84.9467.307 2b、c0.091024.48泽泻醇A的加氧氧化产物C30H50O6507.367 2-1.6339.289 6b、c0.711124.6323-乙酰泽泻醇L［20］C32H46O5511.340 4-2.7493.316 7、451.309 3、415.281 1、397.280 2b1224.73泽泻醇A的葡萄糖醛酸化产物C36H58O11667.411 08.6437.343 1、383.329 9、339.289 4b1324.7824-乙酰泽泻醇A的加氧氧化产物C32H52O7549.376 5-3.7383.330 5、339.289 7b、c0.051424.8124-乙酰泽泻醇A的加氧氧化产物C32H52O7549.377 1-2.6383.330 5、339.289 7b、c1.831525.99泽泻醇A的葡萄糖醛酸化产物C36H58O11667.409 15.9383.332 0b1628.0424-乙酰泽泻醇A的加氢还原产物C32H54O6535.403 16.9385.293 7、341.267 2c注：离子模式均为［M+H］+3.2　原型成分的鉴定分析通过与对照品的保留时间和二级质谱碎片信息进行比对发现，在泽泻组和盐泽泻组大鼠血清中均存在5个共有的原型成分，经鉴定化合物Z1为16-氧代泽泻醇A，Z2为泽泻醇C，Z3为泽泻醇A，Z4为24-乙酰泽泻醇A，Z5为泽泻醇B，上述化合物经C23-C24裂解重排，丢失H2O（18 Da）或醋酸（HAc，60 Da）产生［M+H-H2O］+、［M+H-HAc］+、［M+H-2H2O-HAc］+等关键骨架离子。比较各化合物响应强度比发现，盐泽泻组16-氧代泽泻醇A、泽泻醇C和泽泻醇B在血清中的响应强度高于泽泻组，而泽泻醇A和24-乙酰泽泻醇A的响应强度则低于泽泻组，见表1。各化合物鉴定过程如下。化合物Z1产生m/z 505.351 0 ［M+H］+的准分子离子峰，根据元素组成，推测其分子式为C30H48O6。二级碎片离子有m/z 487.341 8 ［M+H-H2O］+、469.331 2 ［M+H-2H2O］+、451.320 7 ［M+H-3H2O］+、415.284 3 ［M+H-C4H10O2］+、397.310 1 ［M+H-H2O-C4H10O2］+，与对照品二级碎片和保留时间均相同，故确定该化合物为16-氧代泽泻醇A，可能的裂解途径见图1。化合物Z2产生m/z 487.346 6 ［M+H］+的准分子离子峰，推测其分子式为C30H46O5。二级碎片离子有m/z 469.337 5 ［M+H-H2O］+、451.326 7 ［M+H-2H2O］+、433.310 2 ［M+H-3H2O］+、397.276 1 ［M+H-2H2O-C4H6］+、353.245 2 ［M+H-2H2O-C6H10O］+，与泽泻醇C对照品产生的二级碎片和保留时间一致，确定该化合物为泽泻醇C，可能的裂解途径见图2。化合物Z3产生m/z 491.372 2 ［M+H］+的准分子离子峰，根据元素组成，推测其分子式为C30H50O5。二级碎片离子有m/z 473.376 4 ［M+H-H2O］+、455.344 2 ［M+H-2H2O］+、437.217 0 ［M+H-3H2O］+、383.315 6 ［M+H-H2O-C4H10O2］+、365.285 5 ［M+H-2H2O-C4H10O2］+、339.269 6 ［M+H-H2O-C6H14O3］+，与泽泻醇A对照品产生的二级碎片和保留时间一致，最后确定该化合物为泽泻醇A。化合物Z4产生m/z 555.366 5 ［M+Na］+的准分子离子峰，根据元素组成，推测其分子式为C32H52O6。二级碎片离子有m/z 497.366 0 ［M+H-2H2O］+、437.341 1 ［M+H-2H2O-HAc］+、419.344 8 ［M+H-3H2O-HAc］+、383.295 5 ［M+H-H2O-C6H12O3］+、339.273 4 ［M+H-H2O-C8H16O4］+，与24-乙酰泽泻醇A对照品产生的二级碎片和保留时间均相同，最后确定该化合物为24-乙酰泽泻醇A。化合物Z5产生m/z 473.362 1 ［M+H］+的准分子离子峰，根据元素组成，推测其分子式为C30H48O4。二级碎片离子有m/z 437.341 4 ［M+H-2H2O］+、339.268 2 ［M+H-H2O-C6H8O2］+，与泽泻醇B对照品产生的二级碎片和保留时间一致，最后确定该化合物为泽泻醇B。10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.F001图116-氧代泽泻醇A的裂解途径分析Fig. 1Fragmentation pathways of 16-oxoalisol A10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.F002图2泽泻醇C的裂解途径分析Fig.2Fragmentation pathways of alisol C3.3　代谢产物的鉴定分析泽泻组和盐泽泻组大鼠血清中分别鉴定得到15个和9个移行成分代谢物，代谢途径主要涉及氧化反应、还原反应及葡萄糖醛酸化反应，同时还有23-乙酰泽泻醇B等成分在体内代谢转化生成的三萜类成分，如泽泻醇A、泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A等；盐泽泻组血清得到的9个代谢成分除24-乙酰泽泻醇A加氢氧化物外均存在于泽泻组血清中。比较泽泻组、盐泽泻组共有代谢成分响应强度后发现，泽泻组给药血清的代谢成分较丰富，且含量相对更高，盐泽泻组给药血清的代谢成分响应强度呈降低趋势。选择泽泻给药大鼠血清中的代谢成分为例，阐述其解析过程。化合物11在正离子模式下产生m/z 511.340 4 ［M+H］+的准分子离子峰，推测其分子式为C32H46O5，在二级质谱中产生碎片离子m/z 493.316 7 ［M+H-H2O］+、451.309 3 ［M+H-C2H4O2］+、415.281 1 ［M+H-2H2O-C2H4O2］+、397.280 2 ［M+H-3H2O-C2H4O2］+，结合文献报道，推测该化合物为23-乙酰泽泻醇L。同理推测得到化合物1、2、4、5分别为16-氧代泽泻醇A、泽泻醇C同分异构体、泽泻醇F同分异构体、泽泻醇A。化合物3产生的准分子离子峰为m/z 527.336 4 ［M+H］+，根据元素分析推测分子式可能为C32H46O6，比23-乙酰泽泻醇C的准分子离子峰（m/z 529）少2 Da，同时表现出相同的碎片离子m/z 469.331 5 ［M+H-HAc］+、451.321 7 ［M+H-H2O-HAc］+，推测其为23-乙酰泽泻醇C脱氢的氧化产物。化合物6的准分子离子峰m/z 513.355 6 ［M+H］+，推测其分子式为C32H48O5，比23-乙酰泽泻醇B的准分子离子（m/z 515）少2 Da，且其相应产生m/z 453.298 1 ［M+H-HAc］+、337.206 3 ［M+H-C8H16O4］+的二级碎片离子，与23-乙酰泽泻醇B的二级碎片离子m/z 455、339比较少2 Da，猜测可能是母核上发生氧化反应失去了2个氢原子，故推测其可能是23-乙酰泽泻醇B的脱氢氧化产物。同理推测化合物8为16-氧代泽泻醇A的脱氢氧化产物，化合物9为16-氧代泽泻醇A的加氧氧化产物。化合物7的准分子离子峰m/z 649.398 0 ［M+H］+，推测分子式可能为C36H56O10，与泽泻醇B的准分子离子（m/z 473）相差176（C6H8O6），且二级质谱碎片m/z 339.263 9为泽泻醇B母核产生的特征离子，故推测为泽泻醇B的葡萄糖醛酸化产物。同理推测化合物10为泽泻醇A的加氧氧化产物，化合物12、15为泽泻醇A的葡萄糖醛酸化产物，化合物13、14为24-乙酰泽泻醇A的加氧氧化产物。代谢途径分析见图3和图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.F003图323-乙酰泽泻醇B及其衍生物的代谢途径分析Fig. 3Fragmentation pathways of alisol B 23-acetate and its derivatives10.13422/j.cnki.syfjx.20230866.F004图423-乙酰泽泻醇C及其衍生物的代谢途径分析Fig.4Fragmentation pathways of alisol C 23-acetyl and its derivatives4 讨论血清药物化学技术已广泛应用于中药药效物质基础研究，可较好适应中药多成分的复杂性特点［24-25］，本研究借助UPLC-Q-TOF-MS技术对灌胃泽泻、盐泽泻水提液的大鼠含药血清进行鉴定分析，比较泽泻、盐泽泻入血成分的异同。结果显示泽泻、盐泽泻给药后在大鼠血清中分析得到的共有移行成分有13个，包括5个原型成分和8个代谢产物。其中5个原型成分为16-氧代泽泻醇A、泽泻醇A、泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A和泽泻醇B，为泽泻代表性三萜类化合物。药理研究表明，16-氧代泽泻醇A、泽泻醇C、24-乙酰泽泻醇A等配伍组分可减轻高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗［26］。并在非酒精性脂肪肝炎（NASH）小鼠模型中，给予泽泻醇B治疗可显著抑制血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，明显改善肝脏的脂质累积和炎症浸润程度［27］，提示泽泻醇B具有良好的降脂和抗炎作用。此外，TAO等［28］发现泽泻醇A和泽泻醇B的含量与泽泻的利尿作用具有显著的正相关性，推测泽泻醇A、泽泻醇B可能是泽泻发挥利尿作用的有效成分。向茜等［29］对不同炮制方法的泽泻饮片的化学成分进行了含量测定，发现盐制后泽泻醇A、泽泻醇B的含量显著升高，24-乙酰泽泻醇A的含量显著降低，推测药效差异可能与其饮片中的含量高低有较大关系，但本研究经计算发现，泽泻、盐泽泻水提液中5个原型成分16-氧代泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇、泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇C的响应强度比分别为0.75、1.00、0.90、0.99、0.96，表明盐泽泻水提液中除16-氧代泽泻醇A含量下降外其余成分含量均相近，可能因提取方法差别所致，后续需进行深入研究。代谢产物的代谢途径主要涉及Ⅰ相代谢（氧化反应）和Ⅱ相代谢（葡萄糖醛酸化），23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C作为泽泻、盐泽泻在2020年版《中国药典》规定的指标性成分，在给药血清的原型成分中并未检测到，而在代谢产物中发现可能由23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C转化生成的泽泻醇B、泽泻醇C同分异构体及其衍生物，例如23-乙酰泽泻醇B C24-C25的氧环可能开裂后重排生成24-乙酰泽泻醇A，并进一步去乙酰化生成泽泻醇A，或直接去乙酰化生成泽泻醇B，该途径与泽泻在炮制过程中发生的物质转换相似［16，30］。同时，上述成分也进行Ⅰ相代谢生成氧化产物，表明23-乙酰泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇C在进入体内后主要以其衍生物和代谢物的形式存在。比较泽泻、盐泽泻体内的代谢成分发现，泽泻的代谢产物数目和种类均多于盐泽泻，且盐制后原型成分16-氧代泽泻醇A、泽泻醇B和泽泻醇C的响应强度升高，而代谢成分则普遍降低，推测泽泻盐制后可能会减缓萜类成分的代谢速率，使入血成分更多以原型的形式参与体内代谢，泽泻生品的入血成分则较快转化为多种代谢产物，这可能是泽泻和盐泽泻在某些功效上有差异的潜在原因，但具体过程途径还需控制其他成分的影响，采用单体给药进行比较分析。本实验应用UPLC-Q-TOF-MS技术，结合血清药物化学的研究方法，从中药成分吸收入血的角度分析比较泽泻盐制前后的差异，在灌胃泽泻、盐泽泻水提液大鼠血清中分别推测得到20、14个成分，其中两者共有成分13个，包括5个原型成分和8个代谢成分，初步推断16-氧代泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇A、泽泻醇B、泽泻醇C、23-乙酰泽泻醇B和23-乙酰泽泻醇C可能是泽泻及其盐制品的药效物质基础。两者入血的原型成分种类区别较小，而泽泻比盐泽泻的代谢产物更丰富，且两者共有成分的响应强度存在差异，后续研究还需关注盐制前后成分含量的变化过程，从量-效角度探讨泽泻炮制的科学内涵。