补骨脂为豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，在我国有上千年的应用历史，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效［1］。然而近年来出现的大量关于补骨脂引起肝损伤的报道，严重影响了其在临床的应用。据统计，补骨脂不良反应中肝损伤占比高达55.95%，有患者甚至出现肝功能衰竭和死亡［2-3］。古籍中对补骨脂毒性的描述最早见于《雷公炮炙论》云：“性本大燥，毒”［4］，而其他本草古籍对补骨脂毒性记载甚少［5］。因此，挖掘影响补骨脂肝损伤的潜在因素及相关机制对于其临床应用至关重要。目前，许多学者采用体内、体外实验对补骨脂及其成分引起肝损伤的机制展开研究，发现内质网应激和氧化应激引起的肝细胞损伤和胆汁合成异常导致的胆汁淤积是造成补骨脂肝损伤的重要原因。此外，肝药酶的抑制和代谢障碍也可能与补骨脂的肝损伤相关。中药成分多样、作用靶点复杂，仅通过体内、体外实验对中药多种成分展开多维度的机制研究较难实现，若同时借助系统毒理学和网络毒理学的研究方法可大大拓宽研究维度，提高研究效率。系统毒理学是在传统毒理学和系统生物学基础上借助生物信息学和计算毒理学等模型化信息整合技术建立的新方法［6］；网络毒理学的提出也为中药毒理学研究提供了有效的工具。针对中药毒性研究构建系统毒理学和网络毒理学实验方法，能够弥补现有体内、体外毒性评价方法的不足，在高效预测中药潜在毒性的同时减少实验相关的时间和成本［7］。中药单体成分的选择影响网络毒理学潜在肝损伤作用靶点或机制的预测结果。目前，从补骨脂中分离得到的已知化合物有117种，其中补骨脂乙醇提取物给药大鼠血清中检测出的原型成分有10种；补骨脂水提物给药大鼠后血清中能检出来的原型成分有18种；补骨脂水提物给药比格犬后，血清中检出的原型成分有10种［8-11］。由此可见，动物种属和补骨脂的提取方式对其给药后体内暴露成分存在一定影响。因此，补骨脂用药情况如患者情况（性别、年龄、原发疾病、代谢情况）、补骨脂炮制品种（补骨脂药材或盐补骨脂）、给药方式（口服或外用）、是否存在联合用药等均可能对补骨脂的肝损伤产生影响。在采用网络毒理学构建肝损伤预测体系前需要制定符合实际应用情况的纳入标准，才可能获得优质的预测结果。本文首先对1962至2021年中国知网，万方数据，维普网，PubMed数据库收录的有关补骨脂肝损伤的文献报道进行整理和统计，分析临床上补骨脂肝损伤出现的特点和影响因素；进而对已报道的补骨脂中的物质成分和入血成分进行总结；并对临床前通过体内、体外实验发现的补骨脂肝损伤机制、靶点、相关成分进行梳理，总结目前已知的补骨脂中可能具有肝损伤的化合物；最后对目前采用网络毒理学构建的补骨脂肝损伤预测模型所获取的补骨脂肝损伤成分及靶点进行总结。从临床肝损伤特点、临床前肝损伤研究、计算机网络预测三方面阐释补骨脂肝损伤发生可能的相关因素，为补骨脂肝损伤研究和风险提示提供参考。1 临床补骨脂肝损伤相关因素分析补骨脂或含补骨脂的成方制剂（以下称成药）引起的肝损伤近年来被广泛关注。本文对1962年1月1日至2021年12月31日在中国知网、万方、维普网、PubMed数据库收录的有关补骨脂肝损伤的文献报道进行整理和统计。在中国知网、万方、维普网中通过检索关键词“补骨脂”“中成药”“补骨脂制剂”“肝损害”“肝损伤”“药品不良反应”“Bu Gu Zhi”得到文献全文；在PubMed数据库中，通过检索关键词“Psoralea corylifolia”或“Bu Gu Zhi”获取文献全文。纳入个案报道中明确说明怀疑药物性肝损伤是由补骨脂及其制剂用药所引起。排除文献中描述的怀疑药品不是补骨脂及其制剂，重复发表文献、综述及文献回顾病例分析、病例系列研究。本文从患者性别、年龄、是否为首次用药、服药剂量、用药时长、用药原因、肝损伤转归情况、补骨脂炮制种类、是否存在联合用药共9个方面进行统计分析。结果表明，补骨脂诱发肝损伤的患者中，女性患者远多于男性患者，占统计总人数的63.6%。发生肝损伤患者按年龄段划分最多集中在50~59岁（29.6%），其次为60~69岁（25.9%）。肝损伤患者中90.4%为第一次使用补骨脂或含补骨脂的成药。大多数患者未超量用药，剂量集中在每天6 g（83.3%）（2020年版《中华人民共和国药典》规定补骨脂的用量为6~10 g［1］）。出现不良反应的患者中，使用补骨脂生品的人数占72.7%，盐补骨脂的人数占25.5%。在开始用药后的7~180 d内肝损伤发生率为91%，有1.8%的患者用药后的1周内即出现肝损伤；出现肝损伤的患者中口服用药大多用于治疗骨质疏松和肌肉损伤（35.2%），外用主要用于治疗皮肤相关疾病（27.8%）；89.3%的补骨脂肝损伤患者经停药或药物干预治疗后有所好转或完全治愈，但仍有7.1%的患者出现死亡。在55例不良反应患者中，共有24例患者存在联合用药的情况。口服联合用药中，补骨脂与上市西药联用的患者占比最大（32.7%），并且存在同时联用多种类型药物的情况，见增强出版附加材料。该统计结果显示，50~69岁女性为使用补骨脂出现肝损伤的高风险人群，提示该类人群在首次使用补骨脂或含补骨脂成药的过程中应考虑进行肝损伤检查，且应注意不要超量使用，降低出现肝损伤的风险。2 补骨脂中主要的化学成分研究进展据报道，补骨脂中已知的成分有117种［12］。按照化学结构，主要分为香豆素类、黄酮类、单帖酚类及苯并呋喃类。其他类化合物还包含挥发油、酚类、皂苷、多糖、类脂等成分。其中香豆素类、黄酮类及单萜类为主要成分。香豆素是补骨脂的主要成分，可进一步分为3个亚组，即呋喃香豆素、香豆素和其他香豆素。JOIS于1933年分离出第1个呋喃香豆素补骨脂素［13］，补骨脂苷被认为是与补骨脂素相关的糖苷。目前，补骨脂素和异补骨脂素在2020年版《中华人民共和国药典》中为质量标志物，规定补骨脂中含补骨脂素与异补骨脂素的总量不得少于0.70%［1］。香豆雌酚因具有香豆素骨架和雌激素样作用而得名，被认为是天然植物雌激素［14］。香豆素类物质还包括补骨脂定、异补骨脂定、双羟异补骨脂定、补骨脂定2′，3′-环氧化合物、补骨脂香豆雌烷A、补骨脂香豆雌烷 B、槐属香豆雌烷A等［15-16］。补骨脂主要含有的黄酮类成分有黄酮类、二氢黄酮、查尔酮、异黄酮类，包括补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂查尔酮、新补骨脂查尔酮、补骨脂色酚酮等［17］。明确中药的吸收成分、代谢成分和蓄积成分是中药药理毒理机制研究，特别是体外的机制研究的重要基础［18-19］。根据文献报道，目前共有23个补骨脂的原型代谢产物可在动物给药后的血浆中检出，见表1。李晶晶等［8］应用UPLC-MS/MS方法鉴定Wistar大鼠给予补骨脂后血浆中的代谢产物，共检出补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、大豆酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂色烯查尔酮、异补骨脂查尔酮、补骨脂宁、异新补骨脂异黄酮、次苷酸查尔酮、补骨脂查尔酮、甲基补骨脂黄酮13个成分。聂丽娟［10］通过建立LC-MS/MS方法检测到SD大鼠给予补骨脂水提物后血浆中的补骨脂原型成分18种，其中补骨脂定、异补骨脂二氢黄酮、异补骨脂色烯查尔酮、补骨脂甲素首次在大鼠血浆中检测到。魏蒙蒙等［11］采用UPLC-MS /MS方法测定Beagle犬给予补骨脂水提物后血浆中补骨脂的代谢产物，共检出10种，分别为补骨脂素、异补骨脂素、芹菜素、染料木素、补骨脂宁、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂苷、异补骨脂苷。大鼠和犬给药后补骨脂原型代谢产物检出情况见表1，可见补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂二氢黄酮甲醚、新补骨脂异黄酮在不同种属中检出最多的入血成分。10.13422/j.cnki.syfjx.20231922.T001表1补骨脂入血成分总结Table 1List of PF components that can be detected in plasma化合物中文名分子式CAS来源物种香豆素类补骨脂素C11H6O366-97-7Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬异补骨脂素C11H6O3523-50-2Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬补骨脂苷C17H18O9905954-17-8Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬异补骨脂苷C17H18O9905954-18-9Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬补骨脂定C20H16O518642-23-4SD大鼠黄酮类补骨脂二氢黄酮甲醚C21H22O419879-30-2Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬新补骨脂异黄酮C20H18O441060-15-5Wistar大鼠、SD大鼠、Beagle犬补骨脂宁C20H16O453947-92-5Wistar大鼠、Beagle犬补骨脂甲素C20H20O419878-32-4SD大鼠、Beagle犬次苷酸查尔酮C25H26O4775351-88-7Wistar大鼠、SD 大鼠异补骨脂查尔酮C20H20O420784-50-3Wistar大鼠、SD大鼠补骨脂色烯查尔酮C20H18O441743-38-8Wistar大鼠补骨脂查尔酮C20H20O428448-85-3Wistar大鼠大豆酮C15H10O4486-66-8Wistar大鼠异新补骨脂异黄酮C20H18O440357-43-5Wistar大鼠异补骨脂二氢黄酮C20H20O431524-62-6SD大鼠异补骨脂色烯查尔酮C20H18O456083-03-5SD 大鼠芹菜素C15H10O5520-36-5Beagle犬染料木素C15H10O5446-72-0Beagle犬酚类13-羟基补骨脂酚C18H24O2178765-49-6SD大鼠补骨脂酚C18H24O10309-37-2SD大鼠双补骨脂酚AC36H46O4-SD大鼠双补骨脂酚BC36H46O4-SD大鼠3 临床前补骨脂肝损伤研究进展补骨脂肝损伤病例中肝细胞损伤型占52.72%，胆汁淤积型肝损伤占9.09%，肝损伤多表现为轻至中度肝细胞损伤［20］。目前，临床研究中补骨脂肝损伤的机制研究主要集中在内质网应激和氧化应激造成的肝细胞损伤［21-35］；此外，胆汁酸的异常合成和转运［36-52］、特异性体质［53-57］、代谢酶活性抑制［58-63］等因素也被认为对补骨脂的肝损伤具有一定影响。3.1　补骨脂肝细胞损伤型肝损伤机制研究目前研究发现，内质网应激和氧化应激是补骨脂引起肝细胞损伤的重要原因。在内质网应激反应中，活性氧（ROS）的过度积累破坏内质网Ca2+平衡，诱导未折叠蛋白反应（UPR），引起细胞损伤。其中，肌醇需求酶1（IRE1α）、蛋白激酶样内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）被证实是未折叠蛋白反应中起关键作用的3个蛋白。稳态条件下，他们附着在结合免疫球蛋白（BIP）上呈失活态；当细胞中未折叠蛋白反应发生后，为了辅助折叠未折叠的蛋白，IRE1α、PERK、ATF6被激活，继而引起Caspases激活、内质网Ca2+泄漏和线粒体损伤等环节的启动，触发细胞死亡［21-22］。此外，有害的氧化应激也可介导多种因素引发的肝损伤。正常情况下，肝脏中会产生少量ROS作为线粒体呼吸的副产物分布在线粒体、内质网或细胞质中；在异常情况下，谷胱甘肽（GSH）被过度抑制导致ROS的过量产生，诱导肝细胞损伤和死亡［23-24］。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）促进ROS的生成；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和细胞色素P450酶（CYP）参与清除生成的ROS［25］。同时，内质网应激反应也受到线粒体分裂和融合事件的影响［26］。体内试验表明，80 mg·kg-1补骨脂素给药小鼠3 d后，内质网应激相关标志物IRE1α、PERK、ATF6真核起始因子（EIF2A）等水平显著增加［27］。补骨脂素刺激HepG2细胞24 h（200~400 μmol·L-1）可增加Caspase-8和Caspase-3的活性，显著上调PERK和的表达，并降低细胞存活率［28］。也有研究发现，补骨脂甲素（20 μmol·L-1）干预HepG2细胞12 h后诱导ROS积聚、人线粒体融合素2（MFN2）减少和磷酸化Akt激活，触发内质网应激，显著抑制细胞增殖［29］。补骨脂素和异补骨脂素可显著降低斑马鱼和小鼠肝脏中GSH含量和SOD活性，引起过氧化物酶体增殖体激活受体-γ共激活因子-1α（PGC-1α）和PTEN蛋白激酶（PINK1）的抑制，B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）mRNA表达下调，Bcl-2相关X蛋白（Bax） mRNA表达上调［30］。单独腹腔注射补骨脂中成分芹菜素（100、200 mg·kg-1），小鼠血清中氧化型谷胱甘肽比还原型谷胱甘肽的比值（GSSG/GSH）和脂质过氧化（LPO）增加，ROS上调，引起丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）水平上升，肝组织结构受损；同时肝组织中SOD、CAT活性被显著抑制［31］。500、100 mg·kg-1染料木素给药小鼠时，LPO显著增加，同时GSH降低，肝脏组织结构发生变化［32］。体外测试发现，补骨脂甲素、补骨脂定、补骨脂二氢黄酮甲醚、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚等l5种成分可增加L02和HepG2的ROS水平［33］。此外，补骨脂二氢黄酮甲醚诱导的HepaRG细胞ROS产生和细胞死亡被发现与c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38蛋白激酶的激活密切相关［34］。因此，补骨脂中成分补骨脂素、补骨脂甲素、异补骨脂素、芹菜素、染料木素、补骨脂定、补骨脂二氢黄酮甲醚、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚等均可能通过激活氧化应激及内质网应激引起肝细胞损伤。3.2　补骨脂胆汁淤积型肝损伤机制研究胆汁酸是胆汁的主要成分，胆汁淤积会造成肝脏和血清中胆汁酸水平升高，引起肝细胞和胆道损伤［35］。法尼醇X受体（FXR）是一种重要的胆汁酸受体，能够影响多种参与胆汁酸合成、代谢和运输的基因表达［36-39］。被胆汁酸激活的FXR通过核受体小异源二聚体（SHP）抑制胆固醇-7-α-羟化酶（CYP7A1）的活性［40］。CYP7A1对维持胆固醇动态平衡具有重要意义，而胆固醇又可以刺激胆汁酸的合成［41］。同时，由FXR 直接激活的胆盐输出泵（BSEP）是主要的胆汁酸流出泵［42］，利用ATP水解来分泌结合胆汁酸。补骨脂的肝损伤与胆汁酸的异常合成和转运有关。定量蛋白质组学研究结果表明，给予雄性大鼠2.1 g·kg-1·d-1补骨脂水提物28 d后，胆汁酸合成相关蛋白中性胆固醇水解酶（NCEH1）和CYP7A1的蛋白表达增加，代谢和转运相关蛋白硫转移酶2A家族1（SULT2A1）和BSEP蛋白表达降低［43］。在肝细胞中，多药耐药相关蛋白2（MRP2）在管膜中表达，在功能丧失突变或MRP2化学抑制的大鼠中发现胆汁流量减少［44-45］。MRP2和多药耐药蛋白3（MDR3）也直接或间接由FXR配体诱导［46-47］。SD大鼠灌胃补骨脂乙醇提取物28 d后（0.625、1.25、1.875 g·kg-1），雌性大鼠均出现明显肝损伤，肝组织中CYP7A1、MRP3、MRP2、Bsep mRNA表达增加，FXR mRNA表达降低［48］。给予262.5 mg·kg-1补骨脂酚6周的SD大鼠Cyp7a1 mRNA表达降低，低剂量组Bsep mRNA表达增加，高剂量组Bsep mRNA表达降低［49］。80 mg·kg-1补骨脂素和80 mg·kg-1异补骨脂素灌胃28 d，可以显著抑制Wistar大鼠肝脏中CYP7A1、Bsep、MRP2和Sult2a1 mRNA表达，同时FXR、MRP3 mRNA表达显著增加［50］。SD大鼠每日灌胃8-甲氧补骨脂素（200、400 mg·kg-1）28 d后胆汁磷脂产量显著减少，检测发现Mdr3 mRNA表达下调。在L02细胞水平上，8-甲氧补骨脂素干预后向相邻细胞之间形成的假小管分泌的磷脂酰胆碱（PC）减少［51］。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A1）是胆红素代谢消除的关键酶。补骨脂中5个主要成分对人肝微粒体（HLM）中的UGT1A1均有明显的抑制作用，其中补骨脂甲素和corylifol A是UGT1A1的强抑制剂，其抑制动力学参数（Ki）值1 μmol·L-1；而新补骨脂异黄酮、补骨脂乙素和补骨脂二氢黄酮甲醚对UGT1A1的抑制作用中等，Ki值为1.61~9.86 μmol·L-1［52］。由此可见，补骨脂及其成分补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素、8-甲氧补骨脂素等对胆汁的合成和转运均有影响，因而可能造成胆汁淤积型肝损伤，该作用主要与FXR、CYP7A1、BSEP、MRP2等蛋白的调节相关。3.3　补骨脂免疫型特异质肝损伤机制研究炎性小体的异常激活被认为是诱导药物特异质肝损伤（IDILI）和肝纤维化等［53-54］的重要原因。炎性小体是一种胞质多蛋白复合物，由NOD样受体蛋白3（NLRP3）、凋亡相关斑点蛋白（ASC）和炎性蛋白酶Caspase-1组成。组装后的NLRP3炎性小体可以激活Caspase-1，诱导消皮素D（GSDMD）依赖性细胞焦亡，随后促进炎症细胞因子pro-IL-1β的蛋白水解裂解，诱导白细胞介素-1β（IL-1β）的分泌［55-56］。小鼠体内试验发现补骨脂定（50 mg·kg-1）可剂量依赖地激活炎性小体，增加IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α的蛋白表达，诱导肝损伤。其中，促进C端Caspase募集结构域寡聚激活炎性小体和线粒体活性氧（mtROS）的产生是补骨脂定诱导炎性小体激活的决定性因素［57］。补骨脂对炎性小体的激活同时与凋亡过程和活性氧代谢相关，但是目前报道的成分中与炎性小体激活相关的成分类型较少。3.4　肝药酶活性抑制CYP450酶与药物在肝脏中的转化密切相关［58］。而CYP1A1、CYP1A2、GSTM1和AKR7A3是目前已知的与肝损伤的产生密切相关的CYP亚型［59］。研究发现，补骨脂素、异补骨脂素、欧前胡、伊欧前胡、花椒毒素（每类单体成分40 mg·kg-1，灌胃给药28 d）可改变雄性昆明小鼠血清ALT、AST、ALP水平，表现为肝损伤。其中补骨脂素和异补骨脂素抑制细胞色素CYP2E1的活性和蛋白表达，而花椒毒素则增强细胞色素CYP2E1的活性和蛋白表达［59］。肝组织转录组结果显示，给予SD大鼠60 mg·kg-1补骨脂素和异补骨脂素后，化学致癌和细胞色素P450代谢是2个最显著富集的途径［60］。在亚细胞水平上，肝脏是受影响最大的器官，内质网是受影响最大的细胞器。其中，CYP1A1、CYP1A2、GSTM1和AKR7A3是肝损伤的关键基因［61］。体外实验中，补骨脂素和异补骨脂素对HepaRG细胞呈浓度依赖性地抑制CYP3A4活性［61］。此外，补骨脂呋喃香豆精对CYP1A1、CYP1A2也具有显著抑制作用［62］。由于P450酶主要参与肝脏中的Ⅰ相代谢反应［63］，因此补骨脂及其成分补骨脂素和异补骨脂素可能通过影响肝脏的代谢功能造成肝脏损伤。3.5　能量代谢和氨基酸代谢目前代谢组学被广泛应用于药物安全性评价和毒性预测，是肝损伤研究的重要手段。不同剂量的补骨脂水提物（15、25 g·kg-1）连续7 d灌胃Wistar大鼠，采用非靶向代谢组学方法筛选出了肝损伤相关的4条异常代谢途径（甘油磷脂代谢障碍、氨基酸代谢障碍、能量代谢障碍和嘌呤代谢障碍）及7个可疑生物标志物（胱氨酸、肉毒碱、丙氨酸、尿酸、酪氨酸、软脂基肉毒碱、亚油酸）［64］。此外，60 mg·kg-1补骨脂素连续7 d给予SD大鼠后发现血清中7种代谢物（3-羟基丁酸、丙酮、天冬氨酸、葡萄糖、异亮氨酸、赖氨酸和琥珀酸）和肝脏中15种代谢物（3-羟基丁酸盐、乙酰乙酸盐、胞苷、甘氨酸、肌苷、异亮氨酸、赖氨酸、烟酸盐、邻磷胆碱、鸟氨酸、泛酸盐、苯丙氨酸、色氨酸、尿嘧啶和缬氨酸）是致肝损伤的潜在生物标志物，表明补骨脂素可以引起氨基酸代谢的紊乱，特别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在血清和肝脏中的生物合成［65］。此外，肝损伤发生时补骨脂中不同成分的能量代谢机制具有很大差异。实验发现，补骨脂素（56 mg·kg-1，灌胃给药4周）能显著提高福尔瓦林、异丁酸、丙氨酸、丙酮、谷氨酰胺、柠檬酸、不饱和脂质、胆碱、肌酸、苯丙氨酸和4-羟基苯甲酸的含量，降低乙醇和二甲基砜的含量；然而，异补骨脂素（28 mg·kg-1）却仅引起SD大鼠少数代谢产物的变化［56］。因此，补骨脂及其成分补骨脂素的肝损伤可能与其影响能量代谢和氨基酸代谢有关。补骨脂提取物及其所含单体引起肝脏损伤表现及肝损伤相关机制见增强出版附加材料。4 基于网络毒理学的补骨脂肝损伤预测网络毒理学方法是通过构建描述药物毒理性质的“毒性表征化合物-基因-蛋白质”网络模型，从生物网络的角度阐释药物与人体的相互作用方式［66-67］。与传统的体内体外实验相比，网络毒理学通过构建多个化合物和多个靶点的相互作用关系，高效的预测中药的潜在毒性成分及潜在靶点，从而对中药肝损伤的潜在机制进行预测，一定程度上弥补了体内和体外肝损伤研究的不足。通过对补骨脂肝损伤预测网络构建思路的梳理，本文将预测流程概括为4步，见图1。第一步，通过开源数据库获得补骨脂组分或单体成分的药物靶点信息，构建补骨脂成分靶点列表；同时搜集疾病数据库中收录的肝损伤靶点，形成肝损伤靶点列表。第二步，为了得到药物补骨脂中的肝损伤靶点，将补骨脂成分靶点列表和肝损伤靶点列表取交集，2个靶点列表中重叠靶点即认为是补骨脂的肝损伤靶点。再利用蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建方法，搭建肝损伤靶点相互作用网络。当靶点在PPI网络中越处于核心的位置时，认为靶点的功能越重要。因此，第三步时采用网络拓扑特征计算的方法，计算靶点的连接度值，筛选获得补骨脂肝损伤的核心靶点。第四步，将核心靶点与化合物进行关联分析，并将核心靶点进行富集分析，进而阐释补骨脂肝损伤相关的潜在生物学过程和通路，通过核心靶点挖掘补骨脂中潜在的肝损伤成分与机制的关联关系。张娜等［68］通过测定大鼠肝脏获得补骨脂成分后通过Pharm Mapper获得补骨脂药物靶点列表。在在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、CTD、GeneCards等数据库中获得肝损伤相关靶点。原型成分靶点与肝损伤靶点的交集被认为是补骨脂肝损伤的潜在直接作用靶点。在构建得到补骨脂肝损伤靶点的蛋白质相互作用网络后，进而利用GeneMANIA数据库获取补骨脂肝损伤潜在直接作用靶点相关的间接作用靶点。通过计算连接度（Degree）值排名前5位的ALB、HOMX1、GSR、GSTM3、CYP2C9被定义为补骨脂肝损伤潜在核心靶点，与之相关的补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂呋喃查耳酮等11种成分被认为是其潜在的肝损伤成分。核心网络的基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析结果表明甲状腺合成途径和谷胱甘肽代谢途径可能与补骨脂肝损伤有较强的相关性。刘伟等［69］利用开源数据库比较毒物基因组学数据库（CTD）和admetSAR数据库筛选文献记载的补骨脂成分中的毒性成分，并通过Pharmmapper和GeneCards数据库预测肝损伤靶点。补骨脂药物靶点和肝损伤靶点进行交集后，导入Cytoscape软件后，利用CytoHubba插件进行PPI网络拓扑分析，最大团中心性（MCC）计算得到的排名前10位的基因被认为是补骨脂肝损伤关键靶点（hub靶点）。分子对接结果表明补骨脂毒性成分与10个hub靶点（PTPN11、GRB2、SRC、HRAS、EGFR、PIK3R1、JAK2、MAPK1、LCK、MET）有着较好的结合活性；GO和KEGG富集分析表明补骨脂肝损伤靶点主要与刺激反应、激酶活性、脂质结合、肽反应和辅因子代谢过程等生物过程及癌症通路、胰岛素信号通路、化学致癌、PPAR信号通路、HIF-1信号通路和Th17细胞分化等信号通路密切相关。陈成龙等［70］针对补骨脂酚的肝损伤进行了网络构建。采用数据库BATMAN-TCM挖掘补骨脂酚的药物靶点，以“hepatotoxicity”为关键词通过DisGeNET数据库挖掘肝损伤靶点。构建蛋白质相互作用网络后，通过Degree值筛选网络中的核心靶点，构建生物学总调控网络，最后采用分子对接方法评价补骨脂酚与潜在关键靶点结合的亲和力。结果表明补骨脂酚可能主要通过作用于TP53、HSP90AA1、EP300等关键靶点产生肝损伤，GO和KEGG富集分析结果显示核心靶点与氧化应激反应与细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控有关。10.13422/j.cnki.syfjx.20231922.F001图1基于网络毒理学构建的补骨脂肝损伤预测策略流程Fig. 1Flow chart of liver injury prediction strategy of PF based on network toxicology5 讨论本文从临床文献梳理、临床前实验研究和网络毒理学预测3个方面对目前补骨脂的肝损伤研究现状展开综述。首先就对临床使用补骨脂或含有补骨脂的成方制剂进而出现肝损伤的患者的相关因素进行统计分析。进而根据统计结果中产生肝损伤的患者使用补骨脂生品占比较多的结果，从补骨脂肝损伤机制的研究层面进行总结，归纳目前在临床前研究中已经发现的补骨脂的潜在毒性成分、潜在毒性靶标和潜在机制。最后对根据目前网络毒理学技术在补骨脂肝损伤预测方面的应用进展，总结了补骨脂肝损伤的网络构建方法，并对预测结果的进展进行梳理。为补骨脂临床肝损伤成分的发现和肝损伤机制的研究提供了指向性思路。根据临床补骨脂肝损伤的报道，发生肝损伤的患者中使用补骨脂生品者居多，可见补骨脂经炮制后可能具有减毒的效果［71］。有研究表明，采用雷公法和盐炙法炮制补骨脂后，补骨脂酚、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂素和异补骨脂素的含量显著降低；与给予生品补骨脂水提物相比，小鼠给予经炮制的补骨脂水提物的肝损伤明显减轻［72］。此外，文献报道的补骨脂肝损伤患者中存在联合用药的情况。研究发现，淫羊藿与补骨脂同时给药可以造成大鼠的肝损伤程度加深［73-74］。因此，联合用药也可能是引起临床补骨脂肝损伤的重要因素之一，不应只单纯将肝损伤归因于补骨脂。在免疫方面，根据本文的调研结果，临床中使用补骨脂出现肝损伤的患者进行自身免疫性指标检测的结果显示均为阴性，并且通过检测结果排除了病毒性肝炎的发生。同时，个体体质差异、疾病等的影响也是影响中药肝损伤的重要因素［75-77］。根据临床文献报道，补骨脂及成药所造成的肝损伤与患者的性别、年龄、患病等因素关联较为密切。而临床前体内、体外实验研究中也发现补骨脂素和异补骨脂素等16种成分导致的肝损伤严重程度和毒性机制呈现动物种属和性别的差异。性别差异是导致药物安全性出现个体差异的重要因素之一［78］。临床补骨脂肝损伤患者中女性是高发人群，男-女将近1∶2；同时，女性较男性服用补骨脂更易在短时间内出现肝损伤表现［12］。在动物实验中，同样给药剂量的异补骨脂素在雌性大鼠体内的血药浓度明显高于雄鼠，同时雌性药物清除速率低于雄鼠，更容易出现蓄积［79］。补骨脂酚在雄性SD大鼠肝微粒体的代谢以CYP酶介导的Ⅰ相反应为主，而雌性的代谢以UGT酶介导的Ⅱ相反应为主［80］。由此看来，补骨脂肝损伤的性别差异与体内代谢酶相关。此外，不同疾病状态下使用补骨脂的患者肝损伤发生具有较大差异。历代医家认为，补骨脂的肝损伤与证候的关系密切，补骨脂适用于阳虚证而阴虚者忌服［81］。补骨脂的肝损伤机制研究涉及多种生物学过程，仅通过单一种属动物评价其肝损伤可能产生误判［50，82-84］。临床中报道的补骨脂肝损伤一般并非在服药初期即出现，其发生存在一定的阶段性影响。动物体内实验研究表明，随着补骨脂用药时间延长，其肝损伤程度加重，但目前尚无肝损伤在不同阶段的特征靶点或生物标志物的报道。此外，引起药物肝损伤的不同机制之间具有关联性 ［85］。由此可见，仅采用体内、体外实验对补骨脂肝损伤机制进行挖掘存在一定的局限性。网络毒理学研究方法是体内、体外实验方法的有效补充。目前网络毒理学预测到的补骨脂肝损伤机制中，氧化应激、谷胱甘肽代谢和能量代谢通路在动物试验中已得到相关验证，其中单体成分补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂乙素、花椒毒素和补骨脂酚在动物和细胞水平也进行了毒性机制的探究，见图2。另外，目前网络毒理学方法的研究进展表明，补骨脂肝损伤的机制与补骨脂中多种成分相关，仍有较多化合物与靶点目前未得到关注或通过实验证实。这些未验证的靶点可能是以后补骨脂肝损伤研究的新方向。10.13422/j.cnki.syfjx.20231922.F002图2临床数据与试验研究中补骨脂肝损伤结论的关联Fig. 2Plot of association between clinical data and conclusions on liver injury of PF in experimental studies使用网络毒理学进行肝损伤研究可以同时阐释多种机制间靶点的相互作用关系，进而阐释机制间的关联性。但网络毒理学方法中纳入的化合物或肝损伤靶点构建的毒性预测网络数据量较小，单纯凭借数据库中获取的预测结果有可能是肝损伤发生后的某一状态下的靶点间相互作用关系，无法结合肝损伤表型判断肝损伤的进程。因此，从毒性预测方面，还可以从以下两方面进行优化。第一，参考计算毒理学方法，定量构效关系（QSAR）为经典动物实验之外的代表性方法，为药物毒理学开发生物标志物方面具有贡献［86］。将目前监测的肝损伤风险的上市西药与中药成分单体进行分子指纹描述，数据训练和多次分类后，筛选得到化合物结构特征与肝损伤的效应关系。这对于从补骨脂的复杂成分群中筛选得到针对肝损伤具有结构特点的成分是有利的。第二，进一步结合系统生物学技术，运用组学测试结果不断扩充肝损伤预测网络中的靶点信息的数据量，并且以临床肝损伤因素分析为导向，构建能够模拟补骨脂在不同性别人群或不同疾病用药情况下的肝损伤预测网络，为肝损伤早期预警提供方法学支持。