急性肺损伤（ALI）是在非心源性疾病过程中，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，进而导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭［1］，其主要病理特征包括肺血管通透性增高、肺泡腔渗出富含蛋白质的液体、肺容积减小及肺水肿等［2］。ALI临床危险因素多，发病率高，机制复杂，死亡率持续保持在高位，患者生活质量显著下降［3］。ALI治疗方法主要有呼吸支持治疗和糖皮质激素等药物治疗，但这些治疗手段均不理想，因此研究有效的中药新药对ALI的治疗有重要意义。生姜是一种药食两用的中药材，为姜科植物姜的新鲜根茎，味辛，微温，归肺经，有化痰止咳的功效，用于风寒感冒，寒痰咳嗽［4］，在张仲景治疗肺系病证中常被使用［5］。药理研究发现，生姜有抗炎、抗氧化的作用，其有效成分6-姜烯酚可以减轻脂多糖（LPS）引起的ALI［6-10］。作用机制研究显示，生姜对LPS诱导的ALI小鼠肠道菌群有调节作用［11］。Toll样受体4（TLR4）是细胞识别LPS的重要分子，核转录因子-κB（NF-κB）是重要的炎症调节因子［12］，但生姜对ALI小鼠TLR4/NF-κB信号通路的影响尚未见报道。为此，本研究通过LPS诱导建立小鼠ALI模型，灌胃给药生姜的乙醇提取液，探讨生姜醇提物对ALI的保护作用及其对TLR4/NF-κB信号通路的影响。1 材料1.1　动物8周龄雄性Balb/c小鼠50只，体质量18~20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2019-0009。实验期间饲养于中国中医科学院西苑医院，许可证号SYXK（京）2018-0018。5只/笼，温度23~25 ℃，相对湿度45%~65%，每日12 h/12 h明暗交替。小鼠适应性饲养7 d后开始实验。实验动物符合中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会要求，批件号2022XLC035-1。1.2　药品及试剂生姜购于四川犍为，经中国中医科学院西苑医院任钧国研究员鉴定为姜科植物姜Zingiber officinale的新鲜根茎。LPS（大肠埃希菌O55：B5，美国Sigma公司，批号0000081275）；醋酸地塞米松片（天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020122，批号2111003）；红细胞裂解液、10%中性甲醛固定液、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20211227、20220303、G1120、20220102）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（英国Cohesion Biosciences公司，批号分别为CK5E66C、CK4E86C、CK5E14B）；超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）ELISA检测试剂盒（泉州九邦生物科技有限公司，批号分别为ZC21637、ZC28122）；兔来源TLR4一抗（美国Cell Signaling公司，货号14358S）；兔来源NF-κB p65、磷酸化（p）-NF-κB p65一抗（英国Abcam公司，批号分别为GR3459952-3、GR3423511-12）；小鼠来源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G-辣根过氧化物酶（HRP）二抗、山羊抗小鼠IgG-HRP二抗（成都正能生物技术有限责任公司，货号分别为200306-7E4、511203、511103）。1.3　仪器Countstar BioTech型自动细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；Olympus BX53型正置显微镜（日本Olympus公司）；Leica-RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司）；Fresco17型低温冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；CMax Plus型酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Mini Protean Tetra型垂直电泳槽、Mini Trans Blot型转印槽、PowerpacBasic型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；MX-S型数控翘班摇床［大龙兴创实验仪器（北京）股份公司］；Quintix35-1CN型精密天平（德国Sartorius公司）；WD-9423C型化学发光仪（北京六一生物科技有限公司）。2 方法2.1　溶液制备2.1.1　生姜的乙醇提取液将生姜切碎，用10倍量80%乙醇连续回流3次，每次1 h，合并滤液，减压浓缩至含生药量0.7 g·mL-1即为生姜低剂量组醇提液。相同提取方法，减压浓缩至含生药量1.4 g·mL-1即为生姜高剂量组醇提液。有研究表明20 mg·kg-1的6-姜辣素可以减轻ALI，在四川犍为生姜中6-姜辣素含量为1.38~2.87 mg·g-1，因此设置生姜低剂量为7 g·kg-1，高剂量为14 g·kg-1［13-14］。2.1.2　醋酸地塞米松溶液取醋酸地塞米松片，置于研钵中研磨成粉末，加入纯水制成质量浓度为0.5 g·L-1的溶液。2.2　分组、造模及给药将小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组、生姜醇提液低、高剂量组，每组10只，异氟烷麻醉，正常组经鼻滴入生理盐水溶液50 μL，其余各组经鼻滴入LPS生理盐水溶液（含LPS 50 μg）50 μL［15-17］。造模30 min后，各给药组按0.01 mL·g-1灌胃给予相应药物，正常组、模型组小鼠灌胃给予对应体积纯水。造模24 h后，小鼠戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉放血处死，迅速取出肺组织，结扎右主支气管，取右肺下叶放入10%中性甲醛固定液中固定，其余右肺-80 ℃保存备用，以磷酸盐缓冲液（PBS）0.6 mL灌洗左肺3次，收集肺泡灌洗液（BALF）［18］。2.3　BALF白细胞计数取重悬BALF 0.02 mL，加入红细胞裂解液0.04 mL，涡旋混匀，静置15 min，使用自动细胞计数仪进行白细胞计数。2.4　ELISA检测肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平剪取适量小鼠肺组织，加入9倍量预冷PBS溶液，加入研磨珠用冷冻组织研磨仪研磨，4 ℃条件下3 000 r·min-1离心10 min（离心半径8.6 cm，下同），收集上清液，即为10%肺组织匀浆液，按照相关试剂盒说明书操作步骤，采用ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平。2.5　ELISA检测BALF中SOD、MPO水平BALF以1 000 r·min-1在4 ℃下离心10 min，收集上清液，按照相关试剂盒说明书操作步骤，采用ELISA检测SOD、MPO水平。2.6　HE染色观察小鼠肺组织病理学变化小鼠右肺下叶在10%中性甲醛固定液中固定24 h，冲洗，脱水，浸蜡包埋，切片，烘干，脱蜡至水，HE染色，脱水透明，封片晾干，在显微镜下观察肺组织病理学变化并拍照。根据炎性细胞浸润程度、肺泡壁厚度、出血程度3个方面对每个样本进行评分：0分为无组织损伤；1分为组织损伤小于25%；2分为组织损伤25%~50%；3分为组织损伤50%~75%；4分为组织损伤75%，相加即为该样本的肺损伤评分［17，19］。2.7　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的蛋白表达取适量小鼠肺组织在冰上剪成碎片，加入预冷RIPA裂解缓冲液，4 ℃玻璃匀浆机匀浆，冰浴放置10 min，4 ℃条件下12 000 ×g离心10 min，分离上清，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，以裂解液为稀释液，最终将质量浓度调整为2 g·L-1。配置十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶，沸水浴变性制备蛋白样品，样品上样，电泳分离，转膜，5%牛奶-TBST封闭1 h，一抗孵育（1∶500）4 ℃过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育（1∶10 000）1 h，TBST洗膜3次，ECL发光液显影，自动曝光并拍摄照片。使用Image J软件分析各条带灰度值，将样本目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值进行数据分析，该比值表示目的蛋白相对表达水平。2.8　统计学分析采用SPSS 20.0软件进行数据处理，计量资料以x¯±s表示，两组间采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性差异检验，不满足正态分布和方差齐性的用非参检验，P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　对ALI小鼠BALF白细胞计数的影响与正常组比较，模型组小鼠BALF白细胞计数显著升高（P0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠BALF白细胞计数降低，其中生姜高剂量组更显著（P0.01）。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.T001表 1生姜醇提液对ALI小鼠BALF白细胞计数的影响 （x¯±s，n=10）Table 1Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on white blood cell count in BALF of ALI mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1白细胞计数/×106个/mL正常组0.23±0.04模型组1.46±0.302）醋酸地塞米松组0.0050.71±0.304）生姜低剂量组71.13±0.293）生姜高剂量组141.00±0.294）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2-表4同）3.2　对ALI小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响与正常组比较，模型组小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.T002表 2生姜醇提液对ALI小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on level of TNF-α，IL-1β and IL-6 in lung tissue of ALI mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1TNF-αIL-1βIL-6正常组116.13±46.7030.48±8.4813.15±5.27模型组472.44±49.072）107.74±10.962）84.68±9.882）醋酸地塞米松组0.005176.50±69.204）42.61±7.804）33.35±5.114）生姜低剂量组7294.89±38.674）63.89±3.624）54.56±6.804）生姜高剂量组14253.63±104.934）50.01±6.854）40.73±4.354）ng·L-13.3　对ALI小鼠BALF中SOD、MPO水平的影响与正常组比较，模型组小鼠BALF中SOD水平明显降低（P0.05），MPO水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠BALF中SOD水平升高，其中生姜低剂量组更显著（P0.01），生姜给药组小鼠BALF中MPO水平显著降低（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.T003表 3生姜醇提液对ALI小鼠BALF中SOD、MPO水平的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on level of SOD and MPO in BALF of ALI mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1SOD/μg·L-1MPO/ng·L-1正常组20.91±2.09357.83±35.23模型组19.17±1.401）418.43±29.492）醋酸地塞米松组0.00522.19±1.374）388.05±33.43生姜低剂量组721.95±1.834）366.06±40.024）生姜高剂量组1421.03±1.433）359.02±36.484）3.4　对ALI小鼠肺组织病理学变化的影响正常组小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡间隔未见增厚，肺泡间质内未见纤维组织增生和炎性细胞浸润，支气管上皮细胞完整；模型组小鼠肺组织结构破坏，部分肺泡融合，肺泡间隔增宽伴大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润，部分肺泡腔内可见中性粒细胞聚集和充血，支气管上皮变性；与模型组比较，各给药组小鼠肺组织损伤均有缓解，肺间质水肿减少，肺泡间隔增厚减轻，炎性细胞浸润减少，见图1。与正常组比较，模型组小鼠肺损伤评分显著升高（P0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肺损伤评分显著降低（P0.01）。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.F001图 1生姜醇提液对ALI小鼠肺组织病理学变化的影响 （HE，×100）Fig.1Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on pathological changes of lung tissue of ALI mice （HE，×100）注：A.正常组；B.模型组；C.醋酸地塞米松组；D.生姜低剂量组；E.生姜高剂量组（图2同）10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.T004表 4生姜醇提液对ALI小鼠肺损伤评分的影响 （x¯±s，n=10）Table 4Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on lung injury score of ALI mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1评分/分正常组0.90±0.74模型组8.00±1.252）醋酸地塞米松组0.0055.10±0.744）生姜低剂量组74.90±1.014）生姜高剂量组144.60±0.974）3.5　对ALI小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和TLR4蛋白表达的影响与正常组比较，模型组小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和TLR4的蛋白表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和TLR4的蛋白表达显著降低（P0.01）。见图2和表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.F002图 2各组小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of NF-κB p65，p-NF-κB p65 and TLR4 protein expression in lung tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20231003.T005表 5生姜醇提液对ALI小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和TLR4蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Zingiberis Rhizoma Recens alcohol extract on protein expression of NF-κB p65，p-NF-κB p65 and TLR4 in lung tissue of ALI mice （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1NF-κB p65/GAPDHp-NF-κB p65/GAPDHTLR4/GAPDH正常组0.59±0.040.26±0.020.66±0.17模型组1.14±0.042）0.43±0.082）1.36±0.252）醋酸地塞米松组0.0051.02±0.114）0.30±0.054）1.02±0.154）生姜低剂量组70.70±0.084）0.30±0.034）0.88±0.194）生姜高剂量组140.44±0.074）0.21±0.054）0.50±0.094）4 讨论LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，被吸入体内后可导致ALI，表现为肺内血管通透性增加、细胞因子过度产生、白细胞募集、肺水肿等［20］。LPS进入体内后被模式识别受体（PRRs）识别，从而启动炎症级联反应，释放促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等）、趋化因子等炎性介质，中性粒细胞在肺内大量聚集，联合肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等通过脱颗粒等机制再次释放大量炎症介质加强炎症反应。炎性介质还可激活NF-κB等因子，诱导促炎因子、黏附分子及趋化因子的基因转录，进一步加强炎症反应。中性粒细胞还可以释放大量活性氧（ROS），破坏氧化还原动态平衡导致氧化应激，生成氧化产物对肺组织造成损伤。氧化应激与炎症反应相互影响，ROS也可以激活NF-κB，从而形成恶性循环，使肺组织受到更严重的损伤，导致ALI［21-23］。小鼠鼻内滴注LPS可在数小时内导致ALI，并在24~48 h达到最大损伤，与腹腔注射LPS相比肺损伤更严重，且操作简单方便，是一种有效的小鼠ALI模型制备方法［24-26］。本研究运用鼻腔滴注LPS的方法建立小鼠ALI模型，在造模24 h取材，通过检测BALF白细胞计数、TNF-α、IL-1β、IL-6、SOD、MPO水平及NF-κB p65、p-NF-κB p65及TLR4的蛋白表达，观察肺组织病理学变化，探究生姜醇提物对ALI的保护作用。结果表明，模型组小鼠BALF白细胞计数、TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO水平及NF-κB p65、p-NF-κB p65、TLR4的蛋白表达显著升高，SOD水平显著下降，肺组织损伤严重，表明ALI模型建立成功。生姜醇提物可以降低BALF白细胞计数及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平，减轻炎症反应；降低MPO水平，升高SOD水平，减轻氧化应激；降低小鼠肺组织炎性细胞浸润，缓解肺泡间隔增厚，减少肺组织水肿，减轻肺组织损伤，对ALI小鼠起到保护作用。在LPS诱导ALI的信号通路中，肺上皮细胞表面的TLR4作为LPS的受体，控制着LPS炎症信号向胞内传导，以及NF-κB的激活和炎症因子的细胞内转录和释放［27］。NF-κB是炎症的主要调节因子，它可以介导细胞因子风暴，使大量中性粒细胞外渗、细胞因子释放导致炎症反应加剧，从而对肺组织造成损伤［28］。其中发挥主要生理功能的是p50-p65异二聚体，在潜伏阶段与抑制性蛋白结合呈非活化状态，活化后抑制性蛋白被降解，p50-p65异二聚体进入细胞核与DNA上特定位点结合，受到一系列翻译后的修饰如磷酸化后发挥作用，介导细胞因子风暴，加剧炎症反应［29-31］。因此TLR4和NF-κB都对LPS诱导引发ALI有着重要作用，研究表明ALI动物模型的肺组织中TLR4、NF-κB较正常组显著升高，人为阻断TLR4受体可以明显减缓肺组织TLR4、NF-κB表达［32-35］。本研究结果表明，生姜醇提物可以降低小鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和TLR4的蛋白表达，表明其可以抑制TLR4及NF-κB p65的表达，抑制NF-κB p65的活化，从而起到对ALI小鼠的保护作用。综上所述，生姜醇提物可以降低炎症反应和氧化应激水平，减轻肺组织损伤，对LPS诱导的小鼠ALI具有保护作用，其机制可能与抑制TLR4/NF-κB通路的表达活化有关。