五味子，习称“北五味子”，始见于《尔雅》，为木兰科植物五味子Schisandra chinensis的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，五味子含有的化学成分以木脂素类化合物为主，在生理和病理条件下该类化学成分可以发挥多种有益作用［1-2］。五味子做中药使用时多以口服方式给药，文献中报到的抗氧化、保肝、降血糖、神经保护、抗肿瘤［3］等作用也多为口服后呈现。序贯代谢方法是将多成分体内动态吸收代谢过程按照口服给药进入机体消化道的空间顺序开展研究，本课题组前期已成功将此方法用于石榴皮、陈皮、白芍、枸杞子等中药的体内研究［4］。序贯代谢方法对于口服给药后的多成分体内动态过程研究已被业界推广使用，但一直未能将透过血脑脊液屏障（BCSFB）的研究整合入方法体系中［5］。BCSFB可防止有害物质进入脑脊液和大脑，保护中枢神经系统不被外周有害物质损伤［6］。脑脊液与脑组织的细胞外液处于动态平衡中，因此脑脊液是筛选治疗中枢神经系统疾病药效成分的理想选择之一［7］。因此，本研究在原序贯代谢方法中加入后继透过BCSFB的研究，以对阿尔兹海默病（AD）认知障碍有作用的五味子［8］为实例，基于序贯代谢方法结合液质联用技术，解析该中药在大鼠体内的原型成分与代谢产物，既能探索揭示五味子进入脑脊液中成分，为后续更好地挖掘五味子治疗中枢神经系统疾病的药效物质基础提供了数据支撑，又能丰富序贯代谢方法的内容和流程。1 材料Vanquish型超高效液相色谱系统，Xcalibur 4.0型质谱工作站、Q Exactive Plus型超高分辨液质联用系统（赛默飞世尔科技公司），BSA2202S型百分之一电子分析天平（德国Sartorius公司），KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FW-100型高速万能粉碎机、HH-2A型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司），BT-100-1F型蠕动泵、LSP02-1B型注射泵（保定兰格恒流泵有限公司），1-15PK型高速冷冻离心机（德国Sigma离心机），CM-12型水浴氮吹仪（北京成萌伟业科技有限公司）。五味子饮片购于北京仟草中药饮片公司，货号211006001，经北京中医药大学王晶娟教授鉴定为木兰科植物五味子S. chinensis的干燥成熟果实。五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙（南京狄尔格医药科技有限公司，批号分别为D21062509、D21071310、D21102706、D21031412、D21121726、D22011308，纯度均≥98%），羧甲基纤维素钠（天津市福晨化学试剂厂，批号20130905）。乙腈、甲醇、甲酸均为质谱纯，其余试剂均为分析纯，娃哈哈纯净水。SPF级45只SD雄性大鼠购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2019-0010，体质量200~220 g。大鼠饲养于12 h/12 h昼夜节律光照条件下，温度25~27 ℃，相对湿度50%~70%，实验前适应性饲养7 d，自由进食进水。本研究中涉及的实验动物方案已通过北京中医药大学伦理部的伦理审批，伦理审批号BUCM-4-2022061502-2062。2 方法2.1　溶液的制备取五味子药材粉末1.50 g，加入10倍量50%乙醇超声（功率200 W，频率40 kHz）提取2次，每次20 min，合并提取液，取上清液用50%乙醇稀释2倍后，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液即得五味子提取液。取五味子药材粉末99.97 g，提取方法与上述相同，提取液60 ℃水浴挥至稠膏状，用0.5 %羧甲基纤维素钠制成生药量为1 g·mL-1的五味子提取物混悬液，用于给药。同法制备五味子灌流液。2.2　混合对照品溶液的制备取各对照品少量置同一5 mL量瓶中，加少量甲醇超声（功率200 W，频率40 kHz）溶解后，加甲醇定容至刻度，混匀，配成质量浓度均为1 g·L-1混合对照品母液。取该母液200 μL置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液即得。2.3　肠代谢成分分析随机选取4只禁食12 h但不禁水大鼠，麻醉后经腹主动脉采血，将其置于50 mL离心管，37 ℃水浴加热，用于补充实验过程中大鼠损失血液。另取同样禁食的大鼠腹腔麻醉后，分离颈静脉，插入静脉留置针，另一端通过蠕动泵与供血离心管连接。沿大鼠腹中线剪开腹腔，选取空肠段约10 cm作为供试肠段，结扎实验用肠段以外肠系膜旁支血管。37 ℃生理盐水冲出供试肠段内容物后，注入空气将生理盐水排净。肠系膜静脉插入静脉留置针后，结扎肝门静脉，将注射泵与空肠段一端相连，并注入灌流液，供试肠段末端开口结扎塑料软管排出灌流液，流速0.2 mL·min-1，灌注2 h，并以0.3 mL·min-1流速进行颈静脉输血，肠系膜静脉采血2 h。空白组给予生理盐水，其余操作相同。2.4　肝代谢成分分析肝代谢研究中不结扎肝门静脉，并于股静脉处采血，其他操作同肠代谢。2.5　综合代谢成分分析低剂量综合代谢组：选取4只SD雄性大鼠，均灌胃给予灌胃液4 mL。灌胃结束后麻醉大鼠，分别在0.5、1、1.5、2 h经腹主动脉采血，并合并所有时间点的血液。空白组给予生理盐水，其余操作相同。高剂量综合代谢组：选取6只SD雄性大鼠，均灌胃给予灌胃液4 mL，连续灌胃3次，第1次间隔2.5 h、第2次间隔3 h，于第3次灌胃结束后分别在0.5、1、1.5、2 h腹腔麻醉，腹主动脉采血，并合并所有时间点的血液。空白组给予生理盐水，其余操作相同。2.6　脑脊液成分分析在2.5项下高剂量综合代谢组腹主动脉采血后，使用一次性采血针从枕骨大孔中心倾斜进针，采集脑脊液，并将所有时间点的脑脊液合并。空白脑脊液获取方法同给药脑脊液。2.7　血液样品与脑脊液样品处理血液样品：将收集后的血液样品于4 ℃、4 000 r·min-1离心（离心半径10 cm，下同）10 min，取上清液加入等体积乙腈混匀，涡旋2 min，4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，氮气吹干后，甲醇300 μL复溶，10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液用于液质分析。脑脊液样品：向脑脊液样品中加入等体积的乙腈混合，涡旋2 min，于4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，氮气吹干后，甲醇300 μL复溶，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行分析。2.8　色谱条件ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0~7 min，95%B；7~12 min，95%~35%B；12~17 min，35%~15%B；17~20 min，15%~12%B；20~22 min，12%~5%B；22~23 min，5%B；23~25 min，5%~95%B；25~28 min，95%B），柱温30 ℃，流速0.2 mL·min-1，进样量2 μL。2.9　质谱条件加热电喷雾离子化源（HESI），正、负离子检测模式，质量扫描范围m/z 100~1 500，喷雾电压3.8 kV（正离子模式），-3.2 kV（负离子模式），鞘气、辅助气体体积流量分别为35、15 arb，辅助气温度300 ℃，离子传输管温度350 ℃，扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500，碰撞能20、40、60 eV。2.10 成分鉴定和指认具体流程基于Xcalibur 4.0质谱工作站中的Qual Browser软件，对正、负离子采集模式下的质谱信息进行精确质量数筛选，获得化合物的保留时间、特征碎片、分子式等信息，并与文献、OTCML数据库及对照品信息进行综合比对，鉴定化合物。3 结果3.1　五味子提取液中化学成分鉴定对五味子中的化学成分进行定性鉴别，五味子提取液的总离子流图见图1。从五味子中共鉴定指认出42个化学成分，包括1个核苷类成分、1个酚酸类成分、1个鞣质类成分、2个氨基酸类成分、3个黄酮类成分、34个木脂素类成分，详细信息见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230967.F001图1五味子提取液的总离子流Fig. 1Total ion current chromatograms for extract of Schisandrae Chinensis Fructus（SCF）注：A.正离子模式；B.负离子模式10.13422/j.cnki.syfjx.20230967.T001表1五味子提取液中化学成分的鉴定Table 1Chemical constituents identified in extract of SCFNo.tR/min化合物名称离子模式m/z实测值δ/ppm分子式离子碎片11.21腺嘌呤［9］［M+H］+136.061 90.722C5H5N5119.035 5、94.040 421.21谷氨酰胺［9］［M+H］+147.076 50.417C5H10N2O3130.050 0、101.071 4、84.045 031.24谷氨酸［9］［M+H］+148.060 50.241C5H9NO4130.050 0、102.055 4、84.045 0411.49儿茶素［10］［M+H］+291.086 2-0.256C15H14O6291.086 2、273.075 2、249.075 9、207.065 2、165.054 7、147.044 1、139.039 1、123.044 3511.61原花青素B4或异构体［11］［M-H］-577.136 44.085C30H26O12451.104 4、425.088 7、407.077 8、289.072 3612.23芦丁［10］［M+H］+611.160 5-0.231C27H30O16465.101 7、303.049 9、129.054 9、85.029 0712.43槲皮素［10，12-13］［M+H］+303.049 8-0.294C15H10O7285.039 7、257.044 4、247.060 2、229.049 6、201.054 7、153.018 4812.43金丝桃苷［9］［M+H］+465.102 80.124C21H20O12303.050 0、285.038 7、153.018 5913.85戈米辛S或T或H［10，14-16］［M+H］+419.206 2-0.524C23H30O7401.194 2、370.177 0、369.169 6、355.152 4、332.124 2、323.127 5、295.132 01014.02戈米辛S或T或H［10，14-16］［M+H］+419.206 2-0.524C23H30O7419.182 6、401.196 8、370.176 6、369.168 4、355.154 6、332.126 0、323.128 8、295.132 11114.38戈米辛S或T或H［10，14-16］［M+H］+419.206 0-0.410C23H30O7419.201 0、401.195 9、386.171 7、370.177 1、369.169 6、355.154 2、323.127 9、295.132 8121）14.66五味子醇甲［10，17-21］［M+H］+433.221 5-1.269C24H32O7415.211 6、400.188 7、384.192 9、373.163 8、369.169 1、361.163 8、359.149 0、353.174 7、346.140 6、338.150 91314.86戈米辛D［10，20，22］［M+H］+531.222 0-0.572C28H34O10485.216 1、401.159 4、383.148 9、371.148 6、369.130 9、353.138 5、351.122 1、341.102 1、328.093 8141）15.02五味子醇乙［10］［M+H］+417.190 4-0.982C23H28O7-1515.19当归酰戈米辛H［9，19，23］［M+H］+501.248 0-0.488C28H36O8483.238 1、427.175 4、401.196 2、386.171 2、370.177 1、355.154 5、337.143 5、332.125 5、327.121 71615.22戈米辛J或其异构体［14，20-21，23-24］［M+H］+389.195 6-0.630C22H28O6389.195 7、374.171 8、358.174 0、357.169 3、342.144 5、329.173 6、319.117 4、288.098 5、287.091 3、259.096 5、227.070 3、137.059 81715.32戈米辛J或其异构体［14，20-21，23-24］［M+H］+389.195 6-0.553C22H28O6389.196 1、374.171 6、357.169 5、329.178 1、319.117 6、288.099 0、287.090 9、259.096 1、227.070 3、137.059 91815.39巴豆酰戈米辛H［10］［M+H］+501.248 0-0.667C28H36O8483.238 4、401.195 4、395.147 8、370.176 1、355.154 1、332.125 81915.42五脂酮A或其异构体［10，23］［M+H］+431.206 2-0.579C24H30O7400.188 4、372.156 7、356.161 52015.42当归酰戈米辛Q［10，24-25］［M+Na］+553.240 5-0.477C29H38O9553.241 1、453.188 7、431.206 5、387.180 8、372.156 1、371.147 8、358.140 8、357.169 1、356.161 72115.46前五味子脂素［10］［M+H］+391.211 3-0.627C22H30O6327.159 5、257.080 72215.49苯甲酰戈米辛H［10，17，20，23］［M+H］+523.231 9-1.480C30H34O8505.226 4、493.179 8、401.197 1、105.033 92315.59五脂酮A或其异构体［10］［M+H］+431.206 1-0.649C24H30O7400.186 8、372.156 9、356.161 22415.62巴豆酰戈米辛Q［10，24-25］［M+Na］+553.240 5-0.585C29H38O9553.241 6、453.188 3、431.205 9、387.179 9、372.155 9、358.140 7、357.170 5、356.160 92515.66戈米辛J或其异构体［14，20-21，23-24］［M+H］+389.195 4-1.118C22H28O6389.195 2、357.168 6、329.178 1、319.117 1、288.098 6、287.091 3、259.095 9、227.070 2、137.059 52615.82戈米辛G［17，21，24-26］［M+Na］+559.193 4-0.776C30H32O9559.193 8、437.156 9、415.175 1、400.150 6、397.165 1、384.156 9、383.149 9、373.127 2、371.148 7、356.124 7、351.123 2、343.117 7、340.130 3、325.107 3271）16.06五味子酯甲［9，20-21，24］［M+Na］+559.193 4-0.776C30H32O9560.197 3、437.157 1、415.175 1、397.164 8、385.165 0、373.127 9、371.149 0、367.151 8、356.125 8、340.130 4、325.106 9、310.119 8、299.090 6、297.112 1、295.096 4、267.101 2281）16.06五味子酯乙［9，19，23-24，27］［M+Na］+537.209 3-0.398C28H34O9437.156 8、415.175 0、397.163 1、373.128 4、385.165 4、312.098 62916.16戈米辛K1、K2或K3［17，23-25，28］［M+H］+403.211 3-0.534C23H30O6403.211 4、388.188 3、371.185 3、356.163 1、340.166 9、333.133 6、325.143 5、302.114 8、301.106 8、287.091 63016.23五味子酯丙或其异构体［16，25，27，29-30］［M+Na］+537.209 2-0.621C28H34O9537.209 8、437.157 2、415.174 9、385.163 7、371.149 5、340.129 63116.23戈米辛M1或M2［10，17，30］［M+H］+387.179 7-1.356C22H26O6372.156 0、355.153 7、324.135 5、285.076 03216.29五味子酯丁［21］［M+Na］+543.162 2-0.706C29H28O9421.125 8、399.143 7、369.133 0、357.092 7、355.117 3、326.078 6、325.106 93316.33戈米辛M1或M2［10，17，30］［M+H］+387.179 9-0.736C22H26O6372.157 0、355.153 4、324.135 6、285.075 83416.46五味子酯丙或其异构体［16，25，27，29-30］［M+H］+515.227 5-0.153C28H34O9515.230 3、469.222 2、385.164 5、355.153 8、343.117 0、316.093 93516.66戈米辛L1或L2［23，30］［M+H］+387.180 0-0.581C22H26O6355.153 3、165.054 83616.76戈米辛L1或L2［23，30］［M+H］+387.180 0-0.581C22H26O6355.155 1、165.055 0371）17.16五味子甲素［17，20，24-26，31］［M+H］+417.227 0-0.492C24H32O6417.227 1、402.203 3、400.203 3、386.208 5、355.153 3、347.148 8、332.124 7、316.130 2、301.107 1、285.111 33817.69巴豆酰戈米辛O［24-25］［M+Na］+521.214 4-0.324C28H34O8421.162 2、399.180 3、369.170 0、368.161 5、337.143 5、330.109 7、326.114 7、281.081 1391）17.79五味子乙素［20-21，24，26，32］［M+H］+401.195 7-0.461C23H28O6401.195 8、386.172 4、371.185 1、340.166 0、339.160 9、331.117 6、329.101 2、316.093 6、300.099 1、285.075 9、273.111 8、270.088 2、269.081 04017.92苯甲酰戈米辛O［10，21，24-25］［M+Na］+543.198 5-0.827C30H32O8439.173 5、421.161 8、399.180 1、384.155 6、369.169 8、368.161 5、353.138 2、341.173 4、337.143 2、330.109 3、326.114 34118.09苯甲酰异戈米辛O［10，21，24-25］［M+Na］+543.198 5-0.716C30H32O8421.162 1、399.180 2、384.156 9、369.169 8、368.161 7、341.175 5、337.143 0、330.109 7、326.115 1421）18.19五味子丙素［10，19-21，26，31-32］［M+H］+385.164 2-1.077C22H24O6385.168 2、370.138 2、355.154 1、354.143 8、353.141 3、325.142 6、315.086 3、285.075 7、270.052 0、257.080 7、242.057 6、227.070 3、199.075 6注：1）经与对照品比对鉴别3.1.1　木脂素化合物鉴定从五味子中共鉴别出34个木脂素类化合物，按照母核结构的不同大致可以分为2类，即联苯环辛烯类和2，3-二甲基-1，4-二芳基丁烷类［33］。除了前戈米辛外，其他化学成分均为联苯环辛烯类木脂素。例如，化合物12在正离子模式下，准分子离子峰为m/z 433.221 9 ［M+H］+，推测分子式C24H32O7，二级碎片离子可能由3种裂解方式形成，准分子离子失去1分子水，得到碎片离子m/z 415.211 6 ［M+H-H2O］+，其继续失去甲基、甲氧基，得到碎片离子m/z 400.188 7 ［M+H-H2O-CH3］+、m/z 384.192 9 ［M+H-H2O-CH3O］+、m/z 353.174 7 ［M+H-H2O-2OCH3］+、m/z 369.169 1 ［M+H-H2O-CH3O-CH3］+、m/z 338.150 9 ［M+H-H2O-2OCH3-CH3］+，碎片离子m/z 415.211 6 ［M+H-H2O］+八元环的断裂，形成碎片离子m/z 373.163 8 ［M+H-H2O-C3H6］+、m/z 361.163 8 ［M+H-H2O-C4H6］+、m/z 359.149 0 ［M+H-H2O-C4H8］+、m/z 346.140 6 ［M+H-H2O-CH3-C4H6］+。其中推测m/z 400.188 7、384.192 9、346.140 6、338.150 9为自由基离子。通过与对照品进行比较，推测化合物12为五味子醇甲，裂解途径见增强出版附加材料。化合物13和五味子中大多数木脂素结构有很大的不同。在正离子模式下，化合物13一级质谱离子峰为m/z 531.222 0 ［M+H］+，软件给出的精确分子式为C28H34O10，母离子进一步脱去中性碎片CH2O2和C6H10O3，分别形成碎片离子m/z 485.216 1 ［M+H-CH2O2］+和m/z 401.159 4 ［M+H-C6H10O3］+，后者继续失去1分子水，产生m/z 383.148 9［M+H-C6H10O3-H2O］+的碎片离子；亚甲二氧基结构中-OCH2脱去，产生m/z 371.148 6 ［M+H-C6H10O3-OCH2］+。与之断裂方式相似的水分子和-OCH2的脱去还生成碎片离子m/z 353.138 5 ［M+H-C6H10O3-H2O-OCH2］+。碎片离子m/z 351.122 1 ［M+H-C6H10O3-H2O-CH4O］+的生成是由于脱去-OCH3，同时相邻γ-C的-OH基团氧氢键发生断裂，因此生成五元环，碎片离子m/z 369.130 9 ［M+H-C6H10O3-CH4O］+的生成与其类似，均涉及脱去-OCH3，不同的是前者是相邻α-C上所连的-OCH3基团中的碳氢键发生断裂，生成四元环。八元环上双键和单键的断裂生成碎片离子m/z 341.102 1 ［M+H-C6H10O3-H2O-C3H6］+，进一步失去-CH基团生成碎片离子m/z 328.093 8 ［M+H-C6H10O3-H2O-C3H6-CH］+。通过与文献信息进行比较，推测化合物13为戈米辛D，裂解途径见增强出版附加材料。3.1.2　其他化合物鉴定除了木脂素类化学成分以外，还从五味子鉴定出腺嘌呤、谷氨酰胺、谷氨酸、儿茶素、原花青素B4、芦丁、金丝桃苷、槲皮素等化合物。例如，化合物5的准分子离子为m/z 577.136 4 ［M-H］-，软件给出的精确分子式为C30H26O12，二级碎片离子有m/z 451.104 4 ［M-H-C6H6O3］-、m/z 425.088 7 ［M-H-C8H8O3］-、m/z 407.077 8 ［M-H-C8H8O3-H2O］-，以及通过醌甲基裂变机制所形成的m/z 289.072 3。由于目前已报道的五味子中所含有原花青素B1、B2、B4等均为同分异构体，根据质谱裂解结果无法准确判断，通过与文献进行比较，推测化合物5为原花青素B4或其同分异构体，裂解途径见增强出版附加材料。3.2　原型成分鉴定和指认通过参考五味子提取液中已鉴定化学成分的保留时间、碎片离子质谱数据等信息，进一步与空白血浆、含药血浆、空白脑脊液、给药脑脊液色谱图比对分析，扣除空白血浆与空白脑脊液中含有的内源性成分，在各血浆样品中共鉴定和指认出27种原型入血成分；在脑脊液样品中共鉴定和指认出15种原型成分。在各类血浆样品中和脑脊液样品中只检测到木脂素类化合物，这可能是由于其他入血成分含量低不足以检测到。原型入血、入脑脊液成分见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20230967.T002表2五味子提取液中原型入血、入脑脊液成分信息Table 2Component information of prototype into blood and cerebrospinal fluid in SCFNo.化合物名称综合代谢肠代谢肝代谢脑脊液高剂量低剂量9戈米辛S、T或HYYYYY10戈米辛S、T或HYYYYY11戈米辛S、T或HYYYYND12五味子醇甲YYYYY13戈米辛DYYYYY14五味子醇乙YYYYY15当归酰戈米辛HYYYYY16戈米辛J或其异构体YYYYND17戈米辛J或其异构体YYYNDND18巴豆酰戈米辛HYYYNDY23五脂酮A或其异构体YYYYY24巴豆酰戈米辛QNDNDNDNDY25戈米辛J或其异构体YYNDNDND26戈米辛GYNDNDNDY27五味子酯甲NDNDNDNDY28五味子酯乙YYYYY29戈米辛K1、K2或K3YYYYY30五味子酯丙或其异构体YYNDNDND31戈米辛M1或M2YYNDNDND33戈米辛M1或M2YYYYND34五味子酯丙或其异构体YYNDNDND35戈米辛L1或L2YYYNDND36戈米辛L1或L2YYYNDND37五味子甲素YYYNDY38巴豆酰戈米辛OYYNDNDND39五味子乙素YYYYY40苯甲酰戈米辛OYYNDNDND41苯甲酰异戈米辛OYYNDNDND42五味子丙素YYYNDND注：Y.原型入血成分；ND.未检测到该成分；化合物编号同表1血浆样品的成分鉴定指认结果如下：其中化合物25、26、30、31、34、38、40、41在综合代谢样品中可以检测到，而在肝代谢、肠代谢样品中检测不到，推测这些木脂素类化合物可以直接在胃中吸收入血，进入肠道和肝脏后可能被肠道菌群和酶代谢；化合物17、18、35、36、37、42在综合代谢、肠代谢样品中可以检测到，而肝代谢样品中检测不到，推测这些化合物可能经过胃肠道吸收入血，可分布在肝脏中并经由肝药酶代谢。现有研究表明，五味子甲素在大鼠肝微粒体中代谢的半衰期30 min，表明这类木脂素在肝微粒体中易发生代谢［34］；化合物9、10、11、12、13、14、15、16、23、28、29、33、39在肠代谢、肝代谢与综合代谢血浆样品中均被检出，表明上述化合物在经过胃肠道消化、肠壁酶、肠道菌群等代谢仍可原型吸收入血。脑脊液样品的成分鉴定指认结果可以分为两类：①在血浆样品中和脑脊液中均可以检测到：推测这些化合物在经过胃肠道消化、肝药酶、肠壁酶等代谢仍可原型吸收入血，并可透过血脑脊液屏障，进入脑脊液中，如化合物9、10、12、13、14、15、18、23、26、28、29、37、39。②血浆样品中没有检测到，但在脑脊液样品中可以检测到：推测这些化合物进入血液循环，通过主动转运机制透过血-脑脊液屏障进入脑脊液中，并在脑脊液中有驻留时间，同时脑脊液中缺少清除这些化合物的主动转运机制［35］，如化合物24、27。3.3　代谢产物指认在各血浆样品中共鉴定出14种代谢产物；在脑脊液样品中共鉴定出9种代谢产物。代谢产物生成过程中涉及的代谢反应主要有去甲基化、甲基化、去甲氧基化和羟基化等，代谢产物具体信息见表3，具体的生成方式见增强出版附加材料，以代谢产物M1为例进行质谱解析。代谢产物M1在正离子模式下，一级质谱离子峰为m/z 724.239 6 ［M+H］+，软件给出的精确分子式为C32H41N3O14S，二级碎片离子有m/z 706.226 7 ［M+H-H2O］+、m/z 595.196 4 ［M+H-C5H7NO3］+、m/z 578.168 9 ［M+H-C5H10N2O3］+、m/z 560.159 4 ［M+H-C5H10N2O3-H2O］+、m/z 492.169 1 ［M+H-C5H7NO3-C3H5NO3］+、m/z 451.142 9 ［M+H-C5H7NO3-C3H5NO3-C2H3N］+，通过与文献进行比较，推测化合物M1为五味子酯甲失去C7H4O后去甲基化结合谷胱甘肽生成的代谢产物，裂解途径见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20230967.T003表3五味子提取液给药后代谢产物的鉴定Table 3Identification of metabolites of SCF extract after administrationNo.tR/min代谢产物m/z实测值δ/ppm分子式二级碎片离子S1S2S3CSFHLM112.25五味子酯甲失去C7H4O后去甲基化结合谷胱甘肽代谢产物［16，36］724.239 61.878C32H41N3O14S706.226 7、595.196 4、578.168 9、560.159 4、492.169 1、451.142 9YYYYNDM212.50五味子醇乙去甲基化去甲氧基化+消除代谢产物［16］355.154 00.055C21H22O5340.129 5、327.158 8、324.135 4、309.111 1、294.124 2、281.116 2、279.101 3、272.101 3YYNDYYM312.76五味子醇乙去甲基化代谢产物或五味子乙素去甲基化-羟基化代谢产物或五味子酯甲失去C7H4O后去甲氧基化代谢产物［16，37-38］403.175 1-0.020C22H26O7385.164 6、353.137 2、345.133 2、329.138 0、317.101 9、287.090 7、303.083 3、388.151 9、417.190 5、402.167 1、386.170 7、359.148 7、331.117 6、313.107 0、296.104 0YYYYYM413.26五味子醇甲去甲基化羟基化代谢产物或五味子甲素去甲基化-羟基化代谢产物［16，37］435.201 2-0.174C23H30O8386.169 6、331.117 4、301.106 8、285.111 5YYYYYM513.26五味子乙素羟基化代谢产物［38］417.190 80.020C23H28O7316.094 5、330.110 2、385.164 2、399.178 8YYYYNDM613.36五味子酯甲失去C7H4O后去甲基化代谢产物［16］419.169 9-0.439C22H26O8401.159 5、370.139 5、369.133 4、355.119 4、331.117 5、327.123 0、316.094 2、300.100 2YYYYYM713.42五味子醇乙羟基化代谢产物或五味子酯甲失去C7H4O代谢产物［16，37］433.185 70.036C23H28O8415.174 7、387.179 5、384.154 9、383.147 3、375.143 6、369.132 4、357.133 1、345.132 6、331.116 1、327.122 6、289.107 1、314.114 3、299.125 8YYYYYM813.52五味子丙素羟基化代谢产物［16，38］401.159 5-0.074C22H24O7315.085 2、355.153 1、383.148 7、368.125 0、353.137 2、352.130 1、343.117 2、326.114 0、312.096 4YYYYYM913.80五味子乙素脱氢代谢产物或五味子醇乙消除代谢产物［38］399.180 1-0.338C23H26O6309.112 2、337.143 5、338.147 5、339.158 1、368.160 8、369.170 6、384.156 3YYNDYYM1013.86五味子丙素开环代谢产物或五味子醇乙去甲氧基化去甲基化产物［16，38］373.165 21.675C21H24O6273.075 9、341.138 0、373.162 9、355.262 9、345.280 7、342.144 2、327.124 0、309.112 9、281.116 2YYYYYM1113.92五味子酯甲失去C7H4O后甲基化代谢产物［16，38］447.201 3-0.054C24H30O8385.164 9、429.190 9、416.182 8、401.194 7、386.173 0、373.164 0、356.161 6、342.145 2、327.121 8YYYYYM1214.39五味子甲素去甲基化代谢产物或五味子醇甲去甲基化去甲氧基化代谢产物［16］389.195 7-0.155C22H28O6374.172 6、371.257 7、357.168 9、342.144 0、326.146 5、311.126 5、288.098 6、273.075 6、270.088 5、257.080 3、256.072 6、229.049 4、227.070 3、201.055 2YYNDYNDM1314.58五味子甲素脱氢后去甲基化产物［38］345.133 70.465C19H20O6287.091 0、330.109 3YYNDNDNDM1414.82五味子醇甲消除代谢产物［16］415.211 80.305C24H30O6400.187 5、385.163 7、384.193 5、373.165 3、369.169 2、353.175 5、342.145 4、338.151 7、327.123 7、331.118 3，300.099 4NDNDYYND注：所有代谢产物离子模式均为［M+H］+；S1.综合代谢组（H为高剂量、L为低剂量）；S2.肝代谢组；S3.肠代谢组；CSF.脑脊液；Y.检测到成分；ND.未检测到该成分4 讨论中药是个多成分的复杂体系，并非每种成分都能发挥药效，进入血液达到靶组织或靶器官的原型成分和代谢产物是多数中药发挥药效的潜在活性成分，因此要阐明中药药效物质基础与作用机制，明确中药成分在体内代谢规律是一个可行的策略［39］。序贯代谢按照口服药物进入机体后的顺序时间和连贯空间开展研究［40］，但随着不断总结与优化，发现其对透过BCSFB，中枢神经系统中化学成分的研究尚有方法链条上的空白，因此本研究力争通过五味子多成分体系动态过程阐述探索弥补序贯代谢链条。本研究基于序贯代谢方法，借助UPLC Q-Exactive Orbitrap MS对五味子在大鼠体内的原型成分与代谢产物进行了较全面分析与系统的结构鉴定，从不同血浆样品中共鉴定指认出27种原型入血成分与14种代谢产物；在脑脊液中共鉴定指认出15种原型成分，9种代谢产物，其中14种原型成分和9种代谢产物从脑脊液中首次鉴定。另一方面，代谢产物生成过程中涉及的代谢反应主要有去甲基化、甲基化、去甲氧基化和羟基化等。此外，本研究通过比较不同血浆样品，动态连续地阐明了五味子中化学成分在各部位的吸收代谢情况。五味子中绝大多数木脂素类化学成分母核是联苯环烯类木脂素，在结构上十分相似，因此在化学成分的鉴别上存在较大的挑战，特别是代谢产物，不同的化学成分可以生成相同的代谢产物或同分异构体。这是由于五味子所含有的联苯环烯类木脂素在复杂的机体内可能相互转化［41］，如五味子醇甲是五味子甲素的羟基化产物，因此二者可以在不同的代谢途径下生成互为同分异构体的代谢产物M12。目前已有研究发现五味子提取物［42］、多糖［43］、挥发油［44］及木脂素［45］均对改善AD的认知障碍有生物活性。木脂素类单体化合物如五味子酯甲、五味子酯乙、五味子乙素等已被证明可以改善β淀粉样蛋白（Aβ）诱导的AD小鼠模型的认知能力下降，本研究已证实了这3个木脂素化合物可以进入大鼠脑脊液中，这可能是其发挥改善AD药效可能的物质基础。此外，本研究鉴定的24个可透过血脑脊液屏障的化学成分有可能成为五味子改善AD所引起的认知障碍的潜在药效成分。