溃疡性结肠炎（UC）是一种累及直肠和结肠黏膜及黏膜下层的慢性炎症性疾病，具有反复发作的特点［1］。UC的常见症状包括出血性腹泻、腹痛、体重减轻及慢性疲劳等，但发病机制尚不明确［1-2］。中医认为UC的发病是因为脾胃虚弱，正气不足时，外邪袭体而发病；西医则认为UC的发病主要与遗传因素有关，其次是环境因素引起的免疫水平紊乱、肠道菌群失调，导致肠黏膜屏障损伤，肠道中的病菌和毒素便可突破受损的肠黏膜屏障，诱发异常免疫反应及进一步的细菌异位，加速UC的发生与发展，并且产生严重的并发症［3］。自噬是真核细胞通过溶酶体对胞内受损蛋白和衰老细胞器等物质进行降解，从而促进细胞存活的过程［4-5］。现代研究发现，肠上皮细胞自噬与肠道炎症有着非常密切的关系，身体长期处于炎症反应中会造成不可逆的损伤［5-6］。有研究发现自噬可以显著抑制细胞炎症反应［2，7］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是调控自噬作用的重要信号通路，激活AMPK/mTOR信号通路可增强AMPK磷酸化，减轻mTOR磷酸化，促进自噬、抑制炎症，减轻肠道损伤［8-9］。因此，AMPK/mTOR信号通路可作为治疗UC的重要作用靶点。芍药苷作为中药芍药的主要活性成分，在黄芩汤、芍药甘草汤、四逆散等多种治疗UC的方剂中广泛存在。大量研究数据表明，芍药苷具有抗炎、抗氧化、免疫调节、促进细胞自噬、抑制细胞凋亡等生物活性［10-11］。然而芍药苷治疗UC作用机制尚不清晰。因此，本研究拟从细胞自噬角度探究芍药苷通过AMPK/mTOR信号通路对受损肠黏膜的保护作用机制。1 材料1.1　动物56只SPF级BALB/c雄性小鼠，体质量（20±2）g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号SCXK（辽）2020-0001。小鼠在（20±5）℃的温度，30%~50%的相对湿度，自然光照/黑暗循环下饲养，饲养期间小鼠自由饮水、采食。动物实验操作符合长春中医药大学动物福利和伦理原则（批准号2023477）。1.2　药品和试剂芍药苷（上海源叶生物科技有限公司，批号S31585）；葡聚糖硫酸钠（DSS，MP Biomedicals公司，批号S8634）；AMPK抑制剂compound C（上海源叶生物科技有限公司，批号S24HS195965）；联邻甲苯胺（雷根生物公司，批号0302A23）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定法（ELISA）测试盒、白细胞介素-6（IL-6）ELISA测试盒（上海江莱生物科技有限公司，批号分别为JL10484、JL20268）；苏木素-伊红（HE）染液（北京索莱宝科技有限公司，批号G1005）；AMPK、mTOR、磷酸化（p）-mTOR抗体、羊抗兔二抗、兔抗鼠二抗（美国Proteintech公司，批号为10929-2-AP、66888-1-lg、67778-1-lg、SA00001-2、SA00001-1）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（德国Boster公司，批号BM0627）；微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体（美国CST公司，批号43566s）；p-AMPK抗体（美国Abways公司，批号CY5608）；高灵敏度ECL化学发光试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20230406）；BioRT逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增试剂盒（杭州博日科技股份有限公司，批号BSB05M1）；Talent荧光定量检测试剂盒、TRIzol（德国Tiangen公司，批号分别为Y1206、03702）。1.3　仪器AB204-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SK15型台式高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；SPECTROstar Nano型多功能核算蛋白分析系统（德国BMG Labtech公司）；PowerPac型电泳仪、小型电泳槽和转印槽（美国Bio-Rad公司）；OI600MF型全自动化学发光凝胶成像系统（广州光仪生物科技有限公司）；2720 Thermal Cycler型PCR仪、7300型实时荧光定量（Real-time）PCR仪（美国Applied Biosystems公司。2 方法2.1　动物模型的建立及分组给药56只小鼠适应性饲养1周后，将其分为7组，每组8只，即空白组、模型组、抑制剂组、芍药苷+抑制剂组、芍药苷高、中、低剂量组。根据文献及预实验结果，芍药苷高、中、低剂量分别为50、25、12.5 mg·kg-1［12］，抑制剂剂量为20 mg·kg-1［13］。除空白组自由摄食外，其余各组小鼠自由饮用4% DSS 5 d，灌胃给药芍药苷相应剂量7 d，其余各组灌胃蒸馏水，腹腔注射抑制剂，其余各组腹腔注射生理盐水，每天1次，每天记录小鼠体质量、粪便状态及粪便隐血状况用于疾病活动指数（DAI）评分［14］。禁食不禁水12 h，眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，取结肠组织，固定于4%多聚甲醛中进行HE染色和免疫荧光，剩余结肠锡纸包裹后-80 ℃保存用于后续检测。2.2　小鼠体质量变化、DAI评分的测定实验过程中每天观察小鼠的精神状态、活动量、毛发、饮食等一般情况。每天同一时间记录小鼠体质量变化及粪便状况，每2 d用联苯胺法试剂盒检测粪便隐血情况，用于DAI评分。DAI评分=（体质量下降率+粪便状况评分+粪便隐血评分）/3。DAI评分［15］细则：体质量下降率1%，粪便状况正常，粪便隐血阴性（-），0分；体质量下降率在1%~5%，粪便状况介于正常与松软（半稀便）之间，粪便隐血阳性1+，1分；体质量下降率在5%~10%，粪便状况松软（半稀便），粪便隐血阳性2+，2分；体质量下降率在10%~15%，粪便状况介于松软（半稀便）与血便之间，粪便隐血阳性3+，3分；体质量下降率15%，粪便状况血便，粪便隐血阳性4+，4分。2.3　HE染色观察结肠组织病理学变化禁食不禁水12 h，眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，用4%多聚甲醛将结肠组织固定24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、烤片后，用二甲苯、梯度浓度的乙醇、蒸馏水依次洗脱，使蜡片脱蜡。HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察结肠损伤程度和炎性细胞浸润情况。2.4　ELISA检测血清中TNF-α、IL-6水平眼球取血后，将收集的血液1 000 r·min-1离心20 min（离心半径为8.2 cm，下同）取上清。按照ELISA试剂盒说明书，测定各孔吸光度A，计算小鼠血清中TNF-α、IL-6含量。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达将结肠组织剪碎后加入组织裂解液，手持匀浆机充分匀浆后，12 000 r·min-1离心10 min取上清，用BCA试剂盒进行蛋白定量，沸水煮使蛋白变性。取样品10 μL进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳、电转，封闭、磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗膜后，使用β-actin、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR（1∶2 000）一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗涤后二抗（1∶1 000）室温孵育1 h，洗涤后使用ECL化学发光显影检测蛋白表达，利用Image J软件进行蛋白条带灰度值检测。2.6　免疫荧光检测结肠组织中LC3蛋白表达取固定的结肠组织样本制备冰冻切片，脱蜡后进行抗原修复，滴加5% BSA 0.5 mL室温封闭45 min，滴加稀释后的一抗LC3（1∶100），4 ℃过夜，次日加入荧光标记的二抗（1∶200），室温避光孵育2 h，之后滴加DAPI，室温避光作用10 min后封片。荧光显微镜下观察LC3的表达情况，用Image J软件计算平均光密度。2.7　Real-time PCR检测结肠组织中AMPK、mTOR、Beclin1、LC3、p62 mRNA表达取冻存的结肠组织50 mg，TRIzol法提取RNA，超微量分光光度计测RNA浓度和纯度，根据逆转录扩增试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，逆转录条件为42 ℃延伸45 min、95 ℃失活5 mim，再参考SYBR Green说明进行循环扩增，扩增条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火31 s，72 ℃延伸31 s，40个循环。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参进行计算，按照2-ΔΔCt法计算相对表达量。序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T001表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列（5´-3´）长度/bpAMPK上游AGCCAAATCAGGGACTGCTA136下游GAGGGAGGTGACAGATGAGGmTOR上游CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG130下游GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGACBeclin1上游ATGGAGGGGTCTAAGGCGTC149下游TGGGCTGTGGTAAGTAATGGALC3上游TTATAGAGCGATACAAGGGGGAG109下游CGCCGTCTGATTATCTTGATGAGp62上游GAGGCACCCCGAAACATGG79下游ACTTATAGCGAGTTCCCACCAGAPDH上游TGACCTCAACTACATGGTCTACA85下游CTTCCCATTCTCGGCCTTG2.8　统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行各组数据间比较，所有数据以x¯±s表示。P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对小鼠体质量及DAI评分的影响空白组小鼠饮食、排便正常，毛发润滑有光泽，体质量逐渐上升，各造模组小鼠饮食量减少，体质量下降，精神萎靡，背毛粗糙，喜扎堆，实验3 d出现便稀、便血现象，实验6 d造模组体质量显著下降。与空白组比较，模型组小鼠体质量显著下降（P0.01）；与模型组比较，芍药苷高、中、低剂量组小鼠体质量明显升高（P0.05，P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，芍药苷高剂量组小鼠体质量明显升高（P0.05，P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T002表2芍药苷对UC小鼠体质量变化的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of paeoniflorin on body mass changes in UC mice （x¯±s，n=8）组别剂量/mg·kg-11 d2 d3 d4 d5 d6 d空白组19.38±0.8219.90±0.5719.75±0.7819.97±0.3719.81±0.7020.33±0.66模型组19.61±0.4120.18±0.6719.86±0.5019.62±0.7219.66±0.6718.94±0.701）抑制剂组2019.66±0.4119.79±0.2719.67±0.4919.49±0.5519.52±0.6318.69±0.59芍药苷+抑制剂组50+2019.66±0.4519.81±0.9519.60±0.8019.38±0.6919.10±0.7418.47±0.74芍药苷高剂量组5019.62±0.6919.87±0.8019.95±1.0219.74±0.7219.79±0.744）19.21±0.574）芍药苷中剂量组2519.80±0.2820.09±0.4719.97±0.3219.87±0.3519.78±0.2818.90±0.34芍药苷低剂量组12.519.58±0.5119.71±0.4419.59±0.6719.44±0.6419.58±0.5218.97±0.54组别剂量/mg·kg-17 d8 d9 d10 d11 d12 d空白组20.42±0.6820.51±0.6320.42±0.5820.73±0.6121.00±0.6721.19±0.57模型组17.79±0.871）17.24±1.081）16.62±1.421）16.46±2.081）16.81±2.271）17.21±2.291）抑制剂组2018.57±1.132）17.52±1.0616.69±1.0416.59±1.1716.70±1.5217.09±1.65芍药苷+抑制剂组50+2018.82±1.0117.82±1.5017.34±1.7117.49±2.4317.86±2.6218.25±2.29芍药苷高剂量组5019.57±0.653）19.21±0.583，5）19.05±0.603，4）19.72±0.633，5）20.72±0.513，5）21.14±0.603，5）芍药苷中剂量组2519.30±0.493）18.54±0.612）18.45±1.133）18.37±1.412）19.02±1.672）20.41±1.223）芍药苷低剂量组12.519.25±0.993）18.69±1.153）18.53±1.873）18.23±1.932）18.90±2.372）19.55±2.522）注：与空白组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01；与芍药苷+抑制剂组比较4）P0.05，5）P0.01（表3-表7同）g实验期间，空白组DAI评分接近0，自由饮用DSS后各组小鼠DAI评分逐渐升高，经过药物处理后，小鼠DAI评分逐渐下降。与空白组比较，其余各组小鼠DAI评分均有不同程度的上升，尤其是模型组DAI评分显著上升（P0.01）；与模型组比较，芍药苷各剂量组小鼠DAI评分明显下降（P0.05，P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，芍药苷高剂量组小鼠DAI评分显著下降（P0.05，P0.01），抑制剂组小鼠DAI评分显著上升（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T003表3芍药苷对UC小鼠DAI评分的影响 （x¯±s，n=8）Table 3Effect of paeoniflorin on DAI changes in UC mice （x¯±s，n=8）组别剂量/mg·kg-12 d4 d6 d8 d10 d12 d空白组0.00±0.000.08±0.150.00±0.000.08±0.150.04±0.120.00±0.00模型组0.00±0.001.13±0.561）2.63±0.451）2.75±0.501）2.54±0.471）2.21±0.351）抑制剂组200.08±0.151.00±0.312.17±0.442）2.75±0.505）2.29±0.285）2.17±0.185）芍药苷+抑制剂组50+200.12±0.171.17±0.561.88±0.252.04±0.701.54±0.401.38±0.28芍药苷高剂量组500.08±0.240.88±0.352.04±0.423）1.96±0.383）1.08±0.153）0.42±0.153，5）芍药苷中剂量组250.04±0.121.29±0.492.08±0.243）1.92±0.463）1.67±0.803）1.21±0.313）芍药苷低剂量组12.50.04±0.121.08±0.501.79±0.353）2.00±0.593）1.92±0.642）1.17±0.403）分3.2　对小鼠结肠组织病理学变化的影响结肠组织HE染色结果显示，空白组无组织病理学损伤，结肠黏膜层完整，杯状细胞排列整齐，隐窝完整；模型组、抑制剂组结肠可见不同程度的黏膜损伤，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润及出血现象，杯状细胞明显减少，隐窝缺失；经药物治疗后，各组结肠黏膜损伤均有明显改善，杯状细胞增多，隐窝基本完整，仅有少量炎性细胞浸润。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.F001图1芍药苷对UC小鼠结肠组织病理学变化的影响（HE， ×100）Fig.1Effect of paeoniflorin on pathological changes of colon tissue in UC mice （HE， ×100）注：A.空白组；B.模型组；C.抑制剂组；D.芍药苷+抑制剂组；E.芍药苷高剂量剂量组；F.芍药苷中剂量组；G.芍药苷低剂量组（图2、图3同）3.3　对小鼠血清中TNF-α和IL-6表达水平的影响ELISA结果显示，与空白组比较，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6含量显著上升（P0.01）；与模型组比较，芍药苷高、中、低剂量组小鼠TNF-α、IL-6含量明显下降（P0.05，P0.01），抑制剂组小鼠TNF-α、IL-6含量明显上升（P0.05，P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，抑制剂组小鼠TNF-α、IL-6含量显著上升（P0.01），芍药苷高剂量组小鼠IL-6含量显著下降（P0.01）。结果显示芍药苷可减低UC小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6含量。见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T004表4芍药苷对UC小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of paeoniflorin on TNF-α，IL-6 levels in serum of UC mice （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1TNF-αIL-6空白组46.09±5.0014.30±1.51模型组103.09±5.921）48.20±1.571）抑制剂组20116.45±8.802，5）63.04±6.833，5）芍药苷+抑制剂组50+2074.38±7.6039.98±4.98芍药苷高剂量组5069.82±3.833）20.64±0.143，5）芍药苷中剂量组2571.77±8.153）32.43±3.943）芍药苷低剂量组12.574.24±6.633）40.92±3.952）ng·L-13.4　对小鼠结肠组织p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平的影响Western blot结果显示，模型组小鼠结肠中p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著下调（P0.01），p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著上调（P0.01）；与模型组比较，芍药苷高、中、低剂量组小鼠结肠中pAMPK/AMPK蛋白表达水平显著上调（P0.01），p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著下调（P0.01），抑制剂组小鼠结肠中p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著下调（P0.01），p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著上调（P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，芍药苷高剂量组小鼠结肠组织中p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著上调（P0.01），p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著下调（P0.01），抑制剂组小鼠结肠中p-AMPK/AMPK蛋白表达水平显著下调（P0.01），p-mTOR/mTOR蛋白表达水平显著上调（P0.01）。结果显示，芍药苷能激活AMPK，使其磷酸化，抑制mTOR的磷酸化从而促进自噬。见图2、表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.F002图2各组小鼠结肠组织中p-mTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of p-mTOR， mTOR， p-AMPK， and AMPK protein expression in colon tissue of mice in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T005表5芍药苷对UC小鼠结肠组织中AMPK、mTOR蛋白磷酸化的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of paeoniflorin on AMPK and mTOR protein phosphorylation in colon tissue of UC mice （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1p-AMPK/AMPKp-mTOR/mTOR空白组0.93±0.020.55±0.02模型组0.45±0.021）1.07±0.031）抑制剂组200.26±0.013，5）1.33±0.033，5）芍药苷+抑制剂组50+200.50±0.010.82±0.01芍药苷高剂量组500.85±0.013，5）0.60±0.053，5）芍药苷中剂量组250.75±0.043）0.71±0.053）芍药苷低剂量组12.50.64±0.013）0.90±0.023）3.5　对小鼠结肠组织中LC3蛋白表达水平的影响免疫荧光结果显示，模型组小鼠结肠黏膜细胞中LC3的平均荧光密度较空白组显著降低，LC3的表达下降（P0.01）；与模型组比较，芍药苷高、中、低剂量组小鼠结肠黏膜细胞中LC3的表达显著上升（P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，芍药苷高剂量组小鼠结肠黏膜细胞中LC3的表达上升（P0.01），抑制剂组小鼠结肠黏膜细胞中LC3的表达下降（P0.01）。见图3、表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.F003图3芍药苷对UC小鼠结肠组织中LC3蛋白表达的影响 （免疫荧光， ×200）Fig.3Effect of paeoniflorin on expression of LC3 protein in colon tissue of UC mice （IF， ×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T006表6芍药苷对UC小鼠结肠组织中LC3蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of paeoniflorin on expression of LC3 protein in colon tissue of uc mice （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1平均荧光密度空白组0.51±0.01模型组0.25±0.001）抑制剂组200.24±0.015）芍药苷+抑制剂组50+200.33±0.01芍药苷高剂量组500.46±0.023，5）芍药苷中剂量组250.40±0.023）芍药苷低剂量组12.50.29±0.013）3.6　对小鼠结肠组织中AMPK、mTOR、Beclin1、LC3、p62 mRNA表达水平的影响与空白组比较，模型组结肠组织中AMPK、LC3 mRNA表达水平显著下调（P0.01），mTOR、p62 mRNA表达水平显著上调（P0.01）；与模型组比较，芍药苷高、中、低剂量组AMPK、Beclin1、LC3 mRNA表达水平显著上调（P0.01），mTOR、p62 mRNA表达水平显著下调（P0.01），抑制剂组AMPK、Beclin1、LC3 mRNA表达水平显著下调（P0.05），mTOR、p62 mRNA表达水平显著上调（P0.01）；与芍药苷+抑制剂组比较，芍药苷高剂量组AMPK、LC3 mRNA表达水平显著上调（P0.01），mTOR、p62 mRNA表达水平显著下调（P0.01），抑制剂组AMPK、Beclin1、LC3 mRNA表达水平显著下调（P0.01），mTOR、p62 mRNA表达水平显著上调，差异具有统计学意义（P0.01）。见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20231942.T007表7芍药苷对UC小鼠结肠组织中自噬相关基因表达影响 （x¯±s，n=3）Table 7Effect of paeoniflorin on expression of autophagy related genes in colon tissue of UC mice （x¯±s，n=3）组别剂量/mg·kg-1AMPKmTORBeclin1LC3p62空白组1.00±0.041.00±0.081.00±0.081.00±0.101.00±0.09模型组0.20±0.021）2.31±0.131）2.58±0.371）0.24±0.021）2.08±0.091）抑制剂组200.08±0.013，5）2.59±0.073，5）1.31±0.183，5）0.10±0.012，5）2.76±0.203，5）芍药苷+抑制剂组50+200.51±0.020.68±0.0713.04±0.610.99±0.051.07±0.17芍药苷高剂量组500.86±0.013，5）0.33±0.023，5）13.37±0.603）1.27±0.083，5）0.52±0.053，5）芍药苷中剂量组250.44±0.013）0.65±0.043）7.60±0.603）0.59±0.013）0.62±0.083）芍药苷低剂量组12.50.35±0.013）1.28±0.073）6.11±0.453）0.38±0.043）0.82±0.053）4 讨论UC是一种反复发作的慢性非特异性炎症性肠病，其发病原因尚不清楚［16］。UC无法治愈，只能改善，且疾病过程中伴有多种并发症。目前，临床上主要采用氨基水杨酸类、糖皮质激素和免疫抑制剂等治疗，但这些药物在治疗初期可快速缓解症状，但停药后易复发且有明显的不良反应，总体治疗效果欠佳［17-18］。近年来，多种中药被证明能够治疗UC且不良反应较小，人们开始关注中药对UC的治疗价值。芍药苷作为芍药的主要成分，具有抗炎、免疫调节、促进细胞自噬等作用，是黄芩汤、芍药甘草汤、四逆散等多种治疗腹泻经典方剂中的主要成分［19］。本研究使用4% DSS诱导建立UC小鼠模型，并在造模成功后给予芍药苷进行治疗，研究了芍药苷的治疗价值及其潜在作用机制。实验结果显示，模型小鼠出现UC症状：结肠组织黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润及出血现象，杯状细胞明显减少，隐窝缺失，DAI评分升高、体质量下降；经芍药苷治疗后，小鼠结肠黏膜损伤均有明显改善，结肠腺体结构和隐窝基本完整，仅有少量炎性细胞浸润，DAI评分降低、体质量恢复。结果提示芍药苷对UC小鼠有治疗作用。炎症反应是导致UC产生及加重的重要因素。有研究报道，UC患者肠道和血浆促炎因子TNF-α、IL-6水平显著上升，并且其升高程度与结肠黏膜炎症严重程度呈正相关［20-21］。在炎症反应中，肥大细胞、巨噬细胞和中性粒细胞产生IL-6；活化的巨噬细胞，单核细胞和T淋巴细胞共同释放TNF-α［22-23］。TNF-α的增多会破坏肠道屏障、诱导上皮细胞凋亡、促进促炎因子IL-6、γ干扰素（IFN-γ）等的分泌，减少抗炎因子IL-4、IL-10等的分泌，最终导致黏膜炎症［23］。同时有研究证明，阻断TNF-α可减少细胞凋亡和减少紧密连接的通透性、增加调节性T细胞（Treg）细胞活性，降低各种炎症介质和T细胞的活性，从而减轻炎症介导的肠道黏膜损伤［24］。自噬可减轻UC小鼠的肠道黏膜损伤，增强自噬活性，可抑制炎症反应的发生，减轻肠黏膜损伤，促进肠黏膜修复，从而减轻UC症状［8，25］。据报道，盐酸青藤碱、薯蓣皂苷等均可通过提高AMPK/mTOR自噬通路的活化状态而降低促炎细胞因子的水平，进而改善结肠炎症损伤［26-27］。mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以对雷帕霉素敏感的mTORC1和对雷帕霉素不敏感的mTORC2两种复合物的形式存在，前者参与自噬调节［28-29］。AMPK是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶复合体，由α、β和γ 3个亚基构成，是细胞代谢的关键能量传感器。AMPK是mTOR的上游分子，应激状态下，细胞内的ATP下降会激活AMPK，AMPK的活化可以促使TSC2蛋白磷酸化，抑制Rheb，最终抑制mTORC1活性，自噬上调。同时，活化的AMPK也可直接磷酸化Raptor亚基，抑制mTORC1活性，激活自噬［30-32］。有研究证明，激活AMPK/mTOR自噬通路，可缓解炎症损伤造成和加重的各种疾病，小檗碱通过AMPK/mTOR/ULK1途径促进自噬来抑制溶菌酶的表达从而发挥抗炎的作用，当归四逆汤可调节PI3K/Akt/mTOR通路促进自噬改善大鼠痛风性关节炎［33-34］。本研究结果显示，模型组小鼠促炎因子TNF-α、IL-6含量上升，p-AMPK/AMPK、LC3蛋白及mRNA水平下调、p-mTOR/mTOR、p62蛋白及mRNA水平显著上调，自噬程度明显降低，但芍药苷逆转了上述结果，推测芍药苷可能通过激活AMPK/mTOR通路促进自噬而改善DSS诱导的UC小鼠的炎症损伤。compound C是一种有效且可逆的AMPK抑制剂，选择性地与ATP竞争（在AMP缺失，Ki为109 nmol·L-1的情况下），逆转自噬和抗炎作用。为了进一步验证芍药苷对UC小鼠的保护作用是否有AMPK通路的参与，本研究采用AMPK抑制剂compound C进行干预。结果显示，抑制剂组UC小鼠症状更为严重，且逆转了芍药苷对UC小鼠的改善作用，芍药苷+抑制剂组与芍药苷低、中剂量组结果相似，效果相当，差异无统计学意义，进一步说明了芍药苷是通过激活AMPK/mTOR通路，促进自噬来减轻UC小鼠的炎症损伤，Real-time PCR的检测结果也验证了这一观点。综上所述，芍药苷可激活AMPK使其磷酸化，抑制mTOR的磷酸化，进而促进自噬，抑制炎症，改善DSS诱导的UC小鼠的肠道损伤，激活AMPK/mTOR通路是其作用机制之一。然而芍药苷改善DSS诱导的小鼠UC涉及的通路较多，有待后续深入研究。