2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收录的地骨皮（Lycii Cortex）为中医常用药材，具备清肺降火、凉血去热的功能。地骨皮作为一种多基原药材，为茄科下属枸杞（Lycium chinense）或者宁夏枸杞（L. barbarum）的干燥根皮［1］。1963年及以前出版的《中国药典》中地骨皮只收录枸杞的根皮，现今主要分布在山西、安徽、江苏、宁夏等地。1977年版《中国药典》开始，地骨皮的基原增加了宁夏枸杞，其现今主要生长在宁夏、河北、内蒙古等地［2-4］。还有部分地方采用了云南枸杞（L. yunnanense）、黑果枸杞（L. ruthenicum）等种类的根皮作为民族药材应用［5］。经典名方是中医药经过临床实践证明、疗效明确且被后世推广的方剂。对于药材基原的研究是经典名方研发的基础。《古代经典名方目录（第一批）》［6］中共有5首方剂涉及地骨皮，进行本草考证后认为其基原主要为枸杞的干燥根皮［4-5］。随着宁夏枸杞的大规模种植，使得市售地骨皮的基原容易发生混淆，且因枸杞和宁夏枸杞的根皮外观相似，从性状鉴定和显微鉴定上并不能很好地进行区分［7］。在理化鉴定上，采用超高效液相色谱法（UPLC），发现两者的化学轮廓相似，化学组成基本一致［8］。此前一项发明专利利用甲醇-乙酸混合溶液对地骨皮进行提取，并注入填充剂十八烷基硅烷键合硅胶，进行梯度洗脱后建立地骨皮药材的UPLC特征图谱；同时采用超高液相色谱-质谱串联法（UPLC-MS/MS）标定了2个特征峰，可以区分地骨皮的2个基原［9］，但该方法需要大型仪器，检测成本较高。因此，仍需要开发一个更加方便、快捷、高效的技术手段进行补充。特异性聚合酶链式反应（PCR）技术是基于单核苷酸多态性（SNP）位点的基因分型方法，已广泛应用于中药种子种苗、中药材和饮片、提取物、配方颗粒的鉴别，具有准确、高效的优势。本研究拟在获取枸杞和宁夏枸杞DNA特征性片段（DSS）的基础上，建立地骨皮多重位点特异性PCR的鉴别方法，为其基原鉴定和产品质量规范提供检测手段。1 材料1.1　样品来源收集来自27个地区共计30批次的地骨皮样品中，枸杞和宁夏枸杞各15批，样品于中国中医科学院中药资源中心保存，见表1和表2，由蒋超副研究员进行鉴定。以鉴定准确的7批枸杞和6批宁夏枸杞原植物进行方法学研究，另从市场上购买来自不同地区的地骨皮用于适用性考察。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.T001表1地骨皮原植物样品信息Table 1Information of Lycii CortexNo.物种名拉丁学名产地批次样品编号1枸杞Lycium chinense山东青岛1GQ-12枸杞L. chinense安徽来安1GQ-23枸杞L. chinense安徽3GQ-3/4/54枸杞L. chinense河北1GQ-65枸杞L. chinense湖南1GQ-76宁夏枸杞L. barbarum内蒙古1NX-17宁夏枸杞L. barbarum河北1NX-28宁夏枸杞L. barbarum甘肃平凉1NX-39宁夏枸杞L. barbarum宁夏银川3NX-4/5/610.13422/j.cnki.syfjx.20230816.T002表2市场购买的地骨皮样品信息Table 2Information of commercial materials of Lycii CortexNo.物种名拉丁学名采集地批次样品编号1枸杞L. chinense广东清远1GQ-82枸杞L. chinense重庆开州1GQ-93枸杞L. chinense广东惠州1GQ-104枸杞L. chinense上海青浦1GQ-115枸杞L. chinense广西柳州1GQ-126枸杞L. chinense广东梅州1GQ-137枸杞L. chinense福建漳州1GQ-148枸杞L. chinense江苏南通1GQ-159宁夏枸杞L. barbarum甘肃定西1NX-710宁夏枸杞L. barbarum甘肃兰州1NX-811宁夏枸杞L. barbarum安徽亳州1NX-912宁夏枸杞L. barbarum安徽霍山1NX-1013宁夏枸杞L. barbarum四川成都1NX-1114宁夏枸杞L. barbarum云南大理1NX-1215宁夏枸杞L. barbarum安徽亳州1NX-1316宁夏枸杞L. barbarum宁夏2NX-14/151.2　试剂Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，批号DP305］；2×M5 Super Fast Taq PCR Master Mix（2×M5，北京聚合美生物技术有限公司，批号MF164-01）；TaKaRa TaqTM［rTaq，宝日医生物技术（北京）有限公司，批号P019-01］；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ （2×Taq）、2×Rapid Taq Master Mix（2×rTaq）（诺唯赞生物科技股份有限公司，批号分别为P222-01、P213-01）；10 000×CelRed in water核酸染料（北京兰博利德生物技术有限公司，批号CR001）；Trans2K DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号BM101）。1.3　仪器VeritiTM型PCR仪、GeneAmp®9700型PCR仪（美国Applied Biosystem公司）；PTC-100型PCR仪（美国Gene公司）；TC-512型PCR仪（上海Techne公司）；Universal Hood Ⅲ型凝胶成像仪、核酸电泳仪（美国Bio-Rad公司）。2 方法2.1　引物设计利用CGIR数据库中收录的枸杞和宁夏枸杞的叶绿体基因组数据，结合IdenDSS软件获得枸杞和宁夏枸杞特有的DSS序列，引物相关信息见表3。将DSS序列与两基原扩增产物序列进行比对得到SNP位点［10］。利用Primer 5.0软件分别设计鉴别枸杞的引物GQ-上游/下游、鉴别宁夏枸杞的引物NX-上游/下游，2个物种的特异性鉴别引物，见表4。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.T003表3DSS及引物信息Table 3DSS and primers information物种DSS序列引物序列（5′-3′）叶绿体基因组序列编号枸杞ATCCATACCGGCCCAAACTTGGATTCCTGACCCA ATCCAAGQ-dss上游CCTCTCGATGATCTTGAATCGGNC_042204.1下游AGGCCCAATCGACGAAAGAA宁夏枸杞CACGTGGAAACGCTCTTTAATGGAACTTTAACC TTAGCTGNX-dss上游TGGAGTAGTCGGTCTAGCCCNC_041110.1下游CTGGTACGAAATGGGCCACT10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.T004表4枸杞、宁夏枸杞特异性鉴别引物Table 4Specific primer of L. chinense and L. barbarum物种引物序列（5′-3′）长度/bp枸杞GQ上游AGTTCTTTTATCCATACCCG183下游TGTAACTATGTGACCACTGGA宁夏枸杞NX上游GCGATAACTCGGTATATGC295下游TCTTAGAAACCAATCGCG注：C、G为引入的错配碱基2.2　基因组DNA提取取样品100 mg经液氮速冻后研磨成粉，使用植物基因组DNA提取试剂盒进行枸杞和宁夏枸杞的基因组DNA提取，后放入-20 ℃冰箱中备存使用。2.3　多重位点特异性PCR扩增条件的确定使用特异性鉴别引物对枸杞和宁夏枸杞的基因组DNA进行扩增，考察条件如下：①枸杞和宁夏枸杞的特异性鉴别引物浓度比（宁夏枸杞的上下游引物用量固定为0.2 μL）为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1；②退火温度为57、59、61、63 ℃；③PCR循环次数为28、30、32、34个循环；④Taq酶种类为2×M5 Super Fast Taq PCR Master Mix；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ；2×Rapid Taq Master Mix；TaKaRa TaqTM；⑤PCR仪型号分别为GeneAmp®9700型、TC-512型、Verti Pro型、Verti 96型。3 结果与分析3.1　枸杞和宁夏枸杞DSS分子标记的验证使用枸杞和宁夏枸杞的DSS分子标记扩增引物GQ-dss-F/R、NX-dss-F/R分别对来自表1的6批样品（GQ-1/2/3，NX-1/2/3）进行PCR扩增后送生物公司测序。使用DNAMAN软件将DSS标记分别与两基原扩增产物的测序结果进行比对，见图1。结果显示，枸杞的扩增产物序列信息中均存在枸杞的DSS标记，但与宁夏枸杞扩增产物的测序结果比对发现与DSS存在SNP位点；宁夏枸杞的的扩增产物序列信息中均存在宁夏枸杞的DSS标记，但与枸杞扩增产物的测序结果比对发现与DSS存在SNP位点。结果表明2个基原的DSS标记可用于枸杞和宁夏枸杞的基原鉴定。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F001图1枸杞和宁夏枸杞DSS与扩增产物序列比对Fig.1Comparison of DSS and amplified product sequences注：A.枸杞；B.宁夏枸杞3.2　PCR鉴别条件的确定3.2.1　引物浓度比枸杞GQ和宁夏枸杞NX特异性引物浓度比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1时，枸杞和宁夏枸杞可分别获得183、295 bp的特异性条带，见图2。加大枸杞鉴别引物用量可以增加条带亮度，但在引物浓度比为3∶1和4∶1时出现非特异性条带。因此，PCR反应体系中枸杞和宁夏枸杞的引物比确定为2∶1。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F002图2引物比对地骨皮多重位点特异性PCR鉴别的影响Fig.2Influence of primers ratio on Lycii Cortex of specific identification注：M.Trans 2K DNA Marker；1~3.枸杞；4~6.宁夏枸杞；7.H2O（无菌双蒸水）（图3-图7同）3.2.2　退火温度考察退火温度分别为57、59、61、63 ℃时对PCR反应的影响，结果发现，退火温度在57 ℃时，可见非特异性条带，在61、63 ℃时温度越高条带越暗，直至63 ℃时特异性条带未出现。在退火温度为59 ℃时，枸杞和宁夏枸杞样本可获得183、295 bp的特异性条带，见图3，因此确定最适PCR退火温度为59 ℃。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F003图3退火温度对地骨皮多重位点特异性PCR鉴别的影响Fig.3Influence of annealing temperature on Lycii Cortex of specific identification3.2.3　循环次数考察PCR反应循环为28、30、32、34个循环时对PCR反应的影响，结果发现，当循环数为28、30个时，枸杞和宁夏枸杞样本可分别获得183、295 bp的特异性条带，但28个循环时条带显示较暗。32、34个循环以上时，样本出现非特异性条带，见图4，因此确定最适PCR循环次数为30个循环。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F004图4循环次数对地骨皮多重位点特异性PCR鉴别的影响Fig.4Influence of thermo cycles number on Lycii Cortex of specific identification3.2.4　Taq酶种类考察为了筛选最适的DNA聚合酶，分别使用2×M5、2×Taq、2×rTaq、rTaq进行PCR扩增，结果表明上述DNA聚合酶可获得相应条带，且使用2×M5时特异性条带最亮，见图5。使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ、2×Rapid Taq Master Mix进行地骨皮鉴别时可适当增加模板量来提高特异性条带亮度。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F005图5Taq酶种类对地骨皮多重位点特异性PCR鉴别的影响Fig.5Influence of different kinds of Taq polymerases on Lycii Cortex of specific identification3.2.5　PCR仪考察分别使用Verti Pro型、Verti 96型、GeneAmp®9700型、TC-512型PCR仪进行PCR扩增，除了GeneAmp®9700型出现非特异性条带外，其余PCR仪均可获得相应所需条带。表明以Verti Pro型、Verti 96型、TC-512型PCR仪均能进行鉴别，GeneAmp®9700型鉴别时应调整扩增温度，并重新进行PCR扩增条件的确定，见图6。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F006图6不同PCR仪对地骨皮多重位点特异性PCR鉴别的影响Fig.6Influence of different PCR instruments on Lycii Cortex of specific identification3.2.6　地骨皮两基原特异性PCR鉴别方法的确定本实验最终确定25 μL的PCR反应体系及条件，见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.T005表5PCR扩增的反应体系及条件Table 5Reaction system and conditions of PCR amplification体系条件PCR反应体系（25 μL）2×M5 Super Fast Taq PCR MasterMix加12.5 μL，枸杞特异性鉴别引物上下游各0.4 μL，宁夏枸杞特异性引物上下游各0.2 μL，DNA模板1.5 μL，双蒸灭菌水9.8 μLPCR扩增条件95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最终72 ℃延伸5 min电泳条件取PCR产物6 μL点样在已加入CelRed核酸染料染色的1.5%琼脂糖凝胶上，200 V电压条件下电泳25 min3.3　适用性考察按照表5所示PCR反应条件和体系，对30份枸杞和宁夏枸杞样品进行扩增，利用1.5%琼脂糖凝胶通过电泳观察条带位置。结果枸杞均出现183 bp的特异性条带，宁夏枸杞均出现约295 bp的特异性条带，表明上述条件和体系能够正确鉴定枸杞和宁夏枸杞，见图7。10.13422/j.cnki.syfjx.20230816.F007图7地骨皮的多重位点特异性PCR鉴别Fig.7Multiplex allele-specific PCR identification results of Lycii Cortex4 讨论精准鉴定中药材基原一直是中药鉴定的难点问题，其中DNA分子鉴定不受植物组织器官和发育阶段的限制而被众多学者广泛使用。2010年版《中国药典》已将特异性PCR技术鉴定蕲蛇和乌梢蛇的方法进行收录，该方法与传统的分子鉴定方法相比操作简单、重复性好；采用特异性引物可以避免假阳性结果；鉴定需要的DNA量不多且对质量要求不高；电泳后的条带单一，无需后续鉴定实验［11］。因叶绿体基因组序列具有相对较高的保守性而常被用于药材正伪品鉴别方法的研究。在此基础上发展的多重位点特异性PCR，可以使多个引物在一个反应体系中同时进行，通过电泳检测，即可完成多个鉴别位点的检测。目前，海龙、地龙、鹿茸等动物类药材［12-14］、石斛、人参、三七、西洋参、当归等植物类药材［15-16，20］、金银花、牛膝及川牛膝、参环毛蚓等配方颗粒［17-19］均可使用位点特异性PCR鉴定其基原或真伪。CGIR基于人工审编整合的已公开发表的数据和自测数据，共11 946个物种（涉及573科，3 285属），保证了叶绿体基因组数据的数量和质量，使其成为最大的综合性叶绿体资料库［26］。通过CGIR数据库开发的IdenDSS软件可快速得到正品基原物种的DSS分子标记。DSS作为一种DNA分子标记，通过判断存在/不存在多态性（PAV），可鉴定被检测样本是否有特定分类单元。作为一种新的DNA标记方法，DSS不依赖序列相似度，不仅兼具通用性和专属性，因其仅有40 bp大小，可有效应对因中药类型复杂、加工易导致DNA降解等导致难以鉴别的问题［10］。截至目前，该技术在多基原药材（如九里香）［21］、冷背药材（如木槿皮）［22］、外来药材（如中亚苦蒿）［23］、配方颗粒（如五倍子）［24］、干浸膏粉（如紫河车）［25］基原鉴定中应用，具有广泛前景和发展空间。本文利用Idendss软件分析CGIR数据库中枸杞和宁夏枸杞的叶绿体基因组数据，通过对枸杞和宁夏枸杞的叶绿体基因组进行比对分析，筛选出SNP位点后进行PCR条件考察，结果显示枸杞和宁夏枸杞样本可获得183、295 bp的特异性条带。本文建立的地骨皮多重位点特异性PCR的鉴别方法，为枸杞和宁夏枸杞的基原鉴定提供新的技术手段，以保证用药安全。