慢性阻塞性肺病（COPD）是一种以不可逆呼吸道气流限制与持续性呼吸道症状为特征的进行性疾病。COPD患者呼吸受限是由于气道和肺组织受有害颗粒物或气体刺激所诱发慢性炎症引起。支气管炎，慢性阻塞性细支气管炎和肺气肿是COPD患者最常见的3种病理状态［1］。越来越多的证据表明COPD是一种全身性疾病，其病理表现并不局限于肺部炎症和气道重塑［2-4］。研究发现，肠消化管与肺呼吸道的上皮及实质大多来自于原始消化管的内胚层，在胚胎时期属于同一器官，在胚胎发育的过程中才逐渐分化为消化系统和呼吸系统，这提示呼吸道与消化道存在着多种相似性与内在联系［5］。全身性炎症是COPD公认的典型临床症状，机体在各种应激状态下，肠道微生态紊乱导致肠道有害菌种及内毒素分泌增加，引发大量炎症介质的生成，从而促使肠道黏膜损伤，炎症介质透过受损的肠道黏膜破坏性地侵入肠壁浆膜、肠系膜淋巴结、门静脉等肠道以外的组织，诱发内毒素血症，造成全身性炎症反应［6-7］。肺肠同治是中医药治疗肺系疾病的常用方法，尤其在COPD的治疗中，肺肠同治不但有助于促进肺功能的恢复，还能抑制全身炎症性反应，充分体现了中医学的整体观念。清肺化痰逐瘀汤是陕西省名中医高洁教授临床治疗COPD的常用方，该方以中医“肺与大肠相表里”理论为指导，针对COPD痰瘀交阻，肺热腑实证，方中鱼腥草、桑白皮、瓜蒌、黄芩、杏仁、浙贝母合用以清肺化痰、止咳平喘；丹参、水蛭、当归合用活血逐瘀通络；大黄与厚朴合用以行气消胀，通腑泄浊；反佐干姜，防止苦寒伤脾。全方在清肺热、化痰浊，逐瘀通络的同时通肠降气，使腑气通则肺气降，体现了中医肺肠合治法。前期临床研究结果提示清肺化痰逐瘀汤联合西药可提高COPD急性加重期患者的临床疗效，其机制与降低炎症因子白细胞介素-6（IL-6）水平和提高机体抗氧化能力有关［8-9］，为进一步揭示该方“肺肠同治”治疗COPD的作用机制，本研究将从肺组织炎症和肠屏障功能探讨清肺化痰逐瘀汤肺肠合治的深层及机制。1 材料1.1　动物成年雄性Wistar大鼠60只，体质量（200±30） g，购于成都达硕实验动物有限公司。合格证号SCXK（川）2022-013。动物实验经过陕西中医药大学伦理委员会批准，批准编号（202201039）。1.2　药材清肺化痰逐瘀汤组方：鱼腥草40 g、黄芩20 g、桑白皮15 g、全瓜蒌15 g、浙贝母15 g、杏仁10 g、丹参10 g、水蛭5 g、当归15 g、大黄10 g、厚朴20 g、干姜5 g。上述所有中药材购于陕西兴盛德药业有限责任公司，经陕西中医药大学中药学教研室高峰教授鉴定合格。将中药置于温水中浸泡0.5 h，水沸后煎煮3 h，用纱布过滤取药汁；以同样方法再重复煎煮过滤取汁1次，合并药液后，用蒸发仪浓缩至1 g·mL-1。高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱鉴定清肺化痰逐瘀汤中最有代表性的功效成分大黄素（大黄的主要成分）和月桂醛（鱼腥草的主要成分）以控制水煎剂质量，药液存于4 °C冰箱备用。1.3　试剂脂多糖（LPS，美国Sigma-Aldrich公司，批号065M7310V）；香烟（好猫）购于陕西烟草公司；急支糖浆（太极集团重庆涪陵制药有限公司，国药准字Z50020615）；IL-6、肿瘤坏死因子（TNF-α）、大鼠肠黏膜免疫球蛋白A（IgA）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技公司，批号分别为E-EL-R8700、E-EL-R4300、E-EL-R7500c）；D-乳酸检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20210945）；血清二胺氧化酶（DAO）检测试剂盒［上海晶抗生物工程有限公司，批号JK-（a）-2923］；丙二醛（MDA）测定试剂盒（上海梵态生物科技公司，批号FT-P31800R）；荧光（FITC）标记羊抗大鼠、荧光（Cy3）标记羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G DAB染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BA1107、BA1084、11G11B22）；BCA蛋白质分析试剂盒（中国Beyotime公司，批号p0010）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、紧密连接蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白-1（ZO-1）抗体（美国Affinity Biosciences公司，批号分别为AF3258、AF4180、AF5430）；核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、磷酸化（p）-NF-κB p65、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）抗体（美国CST公司，批号分别为4767、3039、4511）；p38 MAPK抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗大鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为14064-1-AP、SA00001-1）；显色液（美国Proteintech公司，批号132202820）；苏木素、阿尔新蓝8GX（美国Sigma公司，批号分别为H9627、A5268）；伊红（国药集团药业股份有限公司，批号71014544）；马松（Masson）染色试剂盒（武汉博尔夫生物科技有限公司，批号BH0002）。1.4　仪器RM 2016型病理切片机、FLEXACAM C1型显微镜（德国Leica公司）；JK-6型组织摊烤片机、JT-12J型脱水机（武汉俊杰公司）；HI650型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；C2500-R-230V型微型高速离心机（美国Labnet公司）；ICV-450型电热恒温培养箱（日本Asone公司）；JY300型水平电泳仪、JYTB-B型转膜仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；FlexStation 3型多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技公司）；FM动物用力肺功能检测系统（英国EMMS公司）；BX53型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。2 方法2.1　动物COPD模型建立及分组给药参考文献报道方法［10-11］采用LPS气管滴注复合烟雾吸入法建立大鼠COPD模型，以大鼠出现流鼻涕、打喷嚏、咳嗽、眼角有血样分泌物、呼吸有啰音、点头运动，甚者张口呼吸，肺功能检测以用力肺活量，动脉血氧分压和动脉血氧饱和度显著降低为模型复制成功。60只大鼠随机数字法分为正常组、模型组、清肺化痰逐瘀汤低、中、高剂量组（10、15、20 g·kg-1），急支糖浆组（10 g·kg-1），动物给药剂量按成人和大鼠体质量换算，成人按60 kg体质量计算确定大鼠清肺化痰逐瘀汤等效剂量为10 g·kg-1/次，每组10只。于第1、14天，造模组大鼠气管滴注LPS（2 g·L-1，给药量0.1 mL），正常组滴注0.1 mL生理盐水。此外，第2~13天，15~25天，造模组大鼠放入自制吸烟箱中，每次燃烧15支香烟，每次0.5 h，2次/d，每次间隔8 h，造模26 d结束。清肺化痰逐瘀汤组与急支糖浆组于造模开始后第15天按剂量给药灌胃，持续给药20 d（正常、模型组采用生理盐水对照），给药结束后监测大鼠肺功能和血气指标。2.2　苏木素-伊红（HE）、阿利新蓝-过碘酸-雪夫（AB-PAS）、Masson染色观察大鼠肺、肠组织病理学变化用4%多聚甲醛固定肺、肠组织，裁剪放入包埋盒中，脱水机脱水后采取石蜡包埋。最后选取4 μm切片根据染色试剂盒说明书进行染色，封片后于镜下观察并对病理切片进行组织学评分。HE染色根据支气管周围炎症的严重程度从0~5分进行量化评分［12］：0分，无细胞；1分，少数细胞；2分，1层细胞；3分，2层细胞；4分，3至4层细胞；5分，4层细胞。AB-PAS染色根据中央和外周气道的杯状细胞分化，评价每个气道中AB-PAS阳性分级的程度［12］：0级，无AB-PAS染色；1级，25%或更少的气道上皮与AB-PAS染色；2级，26%~50%的气道上皮与AB-PAS染色；3级，51%~75%的气道上皮与AB-PAS染色；4级，75%的气道上皮与AB-PAS染色。2.3　ELISA检测各组血清IL-6、TNF-α与结肠IgA含量取血清和制备组织匀浆，按照试剂盒说明书步骤检测血清IL-6、TNF-α和结肠IgA含量。2.4　生化指标检测各组大鼠于末次给药后，禁食不禁水24 h，腹主动脉取血，3 500 r·min -1离心15 min，离心半径8 cm，取上清，按照试剂盒说明书分别测定大鼠血清DAO、D-乳酸、MDA水平。2.5　免疫组化检测大鼠结肠Occludin蛋白表达将结肠组织切片（4 μm）脱腊复水，双氧水封闭与抗原修复，加入一抗Occludin（1∶100）工作液，DAB显色后用苏木素复染，每组切片随机选取5个高倍镜下视野，成片以棕黄色染色为阳性表达依据。2.6　免疫荧光检测大鼠肺组织F4/80阳性巨噬细胞、α-SMA和结肠ZO-1蛋白表达取肺、结肠组织石蜡切片（4 μm），脱蜡复水。使用修复液（枸橼酸缓冲液，pH 6.0）进行抗原修复。切片用F4/80（1∶200）、ZO-1（1∶100）、α-SMA（1∶100）一抗于4 ℃湿盒中避光孵育15 h，加荧光二抗染色（1∶100）（红色），复染核，荧光淬灭剂封片，于显微镜下观察并采集图像。2.7　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK和结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达结肠组织样品加入裂解液机械研磨，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解30 min。使用BCA蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，蛋白上样量40 μg，依次进行电泳、转膜、封闭。NF-κB p65（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶5 000）、p-p38 MAPK（1∶5 000）、Occludin（1∶1 000），ZO-1（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜。次日用PBST洗涤后，在室温下用HRP结合的二抗（1∶5 000），培养1 h，TBST充分洗涤PVDF膜，将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗并扫描胶片，用Image J分析软件定量条带灰度值。2.8　统计学处理采用SPSS 19.0进行统计分析，所有定量数据均以x¯±s表示，实验组之间的比较采用单因素方差分析与t检验结合，而多重比较采用最小显著性差异法（LSD），P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对COPD大鼠肺组织病理形态的影响正常组大鼠肺泡结构完整，管壁无炎性细胞浸润，黏膜层平整，上皮细胞排列整齐。与正常组比较，模型组大鼠支气管周围可见肺泡空洞，管壁大量炎性细胞浸润，黏液层腺体增生，杯状细胞增多，黏液分泌增加，管腔内有渗出物，局部呈现肺间质增厚与肺不张，炎症评分和AB-PAS分级显著升高（P0.01）；与模型组比较，急支糖浆组支气管黏膜层相对完整，肺泡空洞减少，炎性细胞浸润改善明显，仍可见杯状细胞增多，黏液分泌增加，清肺化痰逐瘀汤低、中、高剂量组支气管黏膜层破坏较轻，肺泡空洞减少，炎性细胞浸润改善明显，杯状细胞减少，黏液分泌和支气管内渗出物减少，炎症评分和AB-PAS分级降低（P0.05，P0.01）。见图1、图2、表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F001图 1清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织病理形态影响 （HE，×200）Fig.1Effect of Qingfei Huatan Zhuyu decoction （QHZ） on pathological morphology of lung tissue in COPD rats （HE，×200）注：A.正常组；B.模型组；C.急支糖浆组；D~F.清肺化痰逐瘀汤低、中、高剂量组（图2-图10同）10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F002图 2清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织黏液分泌的影响 （AB-PAS，×400）Fig.2Effect of QHZ on Mucus secretion in lung tissue of COPD rats （AB-PAS，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T001表 1清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织炎症评分和AB-PAS分级的影响 （x¯±s，n=5）Table 1Effect of QHZ on pulmonary tissue inflammation score and AB-PAS grading in COPD rats （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1炎症评分/分AB-PAS分级/级正常组0.00±0.320.40±0.24模型组4.00±0.322）3.40±0.372）急支糖浆组102.60±0.243）2.00±0.453）清肺化痰逐瘀汤低剂量组103.00±0.203）2.20±0.353）清肺化痰逐瘀汤中剂量组152.40±0.263）1.40±0.284）清肺化痰逐瘀汤高剂量组201.50±0.224）1.20±0.204）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与模型组比较3）P0.05，4）P0.01（表2-表6同）3.2　对COPD大鼠肺组织胶原纤维沉积的的影响正常组大鼠肺组织气道周围可见少量胶原纤维沉积；模型组大鼠肺组织中胶原纤维显著增多，除气道周围外，增厚的肺泡间质内充满胶原纤维；急支糖浆组和清肺化痰逐瘀汤各组大鼠肺组织中胶原纤维沉积明显减少，其中以清肺化痰逐瘀汤高剂量组最为显著。见图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F003图 3清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织胶原纤维沉积的影响 （Masson，×200）Fig. 3Effect of QHZ on Collagen fiber deposition in lung tissue of COPD rats （Masson，×200）3.3　对COPD大鼠肺组织α-SMA表达的影响正常组大鼠仅在气道周围有少量α-SMA表达；模型组大鼠肺组织中α-SMA表达的表达显著增多，尤其以气道周围最为明显；急支糖浆组和清肺化痰逐瘀汤各组大鼠肺组织中α-SMA表达明显减少，其中以清肺化痰逐瘀汤高剂量组最为显著。见图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F004图 4清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织α-SMA表达的影响 （免疫荧光，×400）Fig.4Effect of QHZ on α-SMA expression in lung tissue of COPD rats （IF，×400）3.4　对COPD大鼠肺组织巨噬细胞活化的影响正常组大鼠肺组织偶见红色标记的F4/80阳性巨噬细胞；与正常组比较，模型组大鼠F4/80阳性巨噬细胞表达增多，分布于整个肺间质和支气管周围。急支糖浆和清肺化痰逐瘀汤各组大鼠F4/80阳性巨噬细胞表达减少，且随着清肺化痰逐瘀汤给药剂量的升高，肺泡巨噬细胞表达逐渐减少。见图5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F005图 5清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织F4/80标记巨噬细胞表达的影响 （免疫荧光，×400）Fig.5Effect of QHZ on expression of F4/80 labeled alveolar macrophages in lung tissue of COPD rats（IF，×400）3.5　对COPD大鼠肺功能和血气指标的影响与正常组比较，模型组大鼠用力肺活量（FVC）、动脉血氧分压（PaO2）、动脉血氧饱和度（SaO2）、肺动态顺应性（Cdyn）显著降低（P0.01）；与模型组比较，清肺化痰逐瘀汤和急支糖浆明显升高COPD大鼠的肺功能FVC、PaO2、SaO2、Cdyn水平（P0.05，P0.01），其中清肺化痰逐瘀汤各剂量组对COPD大鼠肺功能的改善更显著（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T002表 2清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺功能的影响 （x¯±s，n=8）Table 2Effect of QHZ on pulmonary function in COPD rats （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1FVC/mLPaO2/mmHgSaO2/%Cdyn/mL·（cmH2O）-1正常组12.32±3.81107.11±6.5293.18±5.610.46±0.03模型组5.11±2.222）65.22±5.312）72.32±6.242）0.21±0.022）急支糖浆组109.26±3.063）74.32±6.213）82.11±5.323）0.34±0.024）清肺化痰逐瘀汤低剂量组109.43±2.374）82.06±6.084）83.53±4.434）0.32±0.044）清肺化痰逐瘀汤中剂量组1510.72±2.324）91.13±6.444）85.15±4.114）0.38±0.024）清肺化痰逐瘀汤高剂量组2011.30±2.524）99.39±6.254）91.02±5.184）0.43±0.044）3.6　对COPD大鼠血清IL-6、TNF-α含量的影响与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量显著升高（P0.01）；与模型组比较，急支糖浆和清肺化痰逐瘀汤低剂量组大鼠血清IL-6、TNF-α含量降低（P0.05），清肺化痰逐瘀汤中、高剂量组IL-6、TNF-α含量显著降低（P0.01）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T003表 3清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影响Table 3Effect of QHZ on serum IL-6， TNF-α level in COPD rats （x¯±s，n=8）组别剂量/g·kg-1IL-6TNF-α正常组36.19±7.2149.81±7.24模型组112.01±8.922）190.09±15.032）急支糖浆组1089.32±10.823）158.79±13.213）清肺化痰逐瘀汤低剂量组1091.61±8.473）161.00±11.703）清肺化痰逐瘀汤中剂量组1573.93±4.944）139.58±13.484）清肺化痰逐瘀汤高剂量组2065.90±5.724）110.07±12.924）x¯±s，n=8ng·L-13.7　对COPD大鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65和p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达的影响与正常组比较，模型组大鼠肺组织p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38 MAPK/p38 MAPK显著升高（P0.01）；与模型组比较，急支糖浆和清肺化痰逐瘀汤各组大鼠肺组织p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38 MAPK/p38 MAPK显著降低（P0.01）。见图6、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F006图 6各组大鼠肺组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达电泳Fig. 6Electrophoresis of protein expression of NF-κB p65， p-NF-κB p65， p38 MAPK and p-p38 MAPK in lung tissue of rats in each group10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T004表 4清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠肺组织NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达水平的影响 （x¯±s，n=5）Table 4Effect of QHZ on expression levels of NF-κB p65 and p38 MAPK proteins in lung tissues of COPD rats （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1p-NF-κB p65/NF-κB p65p-p38 MAPK/p38 MAPK正常组0.07±0.010.04±0.01模型组0.56±0.032）0.72±0.032）急支糖浆组100.35±0.034）0.48±0.024）清肺化痰逐瘀汤低剂量组100.39±0.024）0.40±0.024）清肺化痰逐瘀汤中剂量组150.34±0.044）0.23±0.044）清肺化痰逐瘀汤高剂量组200.21±0.024）0.13±0.034）3.8　对COPD大鼠结肠组织病理形态的影响正常组上皮结构完整，黏膜层表面光滑，黏膜下层无充血水肿；模型组绒毛尖端出现细胞脱落与空泡，绒毛结构破坏较明显，中央乳糜管形变，腺体增多，毛细血管充血；急支糖浆和清肺化痰逐瘀汤低剂量组大鼠结肠病理无改变；清肺化痰逐瘀汤中剂量组大鼠结肠绒毛尖端细胞脱落减少，结构相对完整；清肺化痰逐瘀汤高剂量组大鼠肠绒毛和基底层较为完整，未见绒毛尖端脱落与空泡形成。见图7。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F007图 7清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠结肠组织病理形态的影响 （HE，×400）Fig.7Effect of QHZ on pathological morphology of colon in COPD rats （HE，×400）3.9　对COPD大鼠血清DAO、D-乳酸、MDA及肠黏膜IgA水平影响与正常组比较，模型组大鼠血清DAO、D-乳酸、MDA表达升高（P0.05，P0.01），肠黏膜IgA表达降低（P0.01）；与模型组比较，急支糖浆组DAO表达降低（P0.05），IgA表达升高（P0.01），清肺化痰逐瘀汤随剂量浓度增高，DAO、D-乳酸、MDA表达降低（P0.05，P0.01），IgA表达升高，其中清肺化痰逐瘀汤低剂量组MDA差异无统计学意义，各指标皆以清肺化痰逐瘀汤高剂量组效果最明显（P0.01）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T005表 5清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠血清DAO、D-乳酸、MDA及肠黏膜IgA水平的影响 （x¯±s，n=5）Table 5Effect of QHZ on serum DAO， D-lactate， MDA and intestinal mucosal IgA levels in COPD rats （x¯±s，n=5）组别剂量/g·kg-1DAO/U·L-1D-乳酸/mg·L-1MDA/μmol·L-1IgA/mg·L-1正常组17.94±1.817.11±0.9129.14±10.2325.41±2.20模型组39.41±3.222）15.88±1.152）49.80±16.011）12.09±2.032）急支糖浆组1030.85±2.033）14.37±0.9849.71±19.2622.53±1.654）清肺化痰逐瘀汤低剂量组1031.45±2.373）12.39±1.073）43.67±17.3116.81±1.743）清肺化痰逐瘀汤中剂量组1526.70±1.974）11.98±1.423）39.15±12.043）20.58±1.923）清肺化痰逐瘀汤高剂量组2024.30±1.524）9.36±1.064）35.44±13.763）23.07±2.154）3.10　对COPD大鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达影响与正常组比较，模型组Occludin、ZO-1蛋白相对表达显著降低表达（P0.01）；与模型组比较，急支糖浆组结肠组织Occludin和ZO-1蛋白表达部位和强度虽然均有增加，但仅免疫组化Occludin蛋白表达（P0.01），清肺化痰逐瘀汤低、中、高剂量组Occludin、ZO-1蛋白表达明显升高（P0.05，P0.01）。见表6、图8-图10。10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.T006表 6清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠结肠黏膜Occludin、ZO-1蛋白表达水平影响 （x¯±s，n=3）Table 6Effect of QHZ on Occludin， ZO-1 protein levels in colon mucosa of COPD rats （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1ZO-1/β-actinOccludin/β-actinZO-1荧光强度Occludin阳性占比/%正常组0.63±0.030.56±0.02100.32±3.4185.32±5.02模型组0.18±0.050.11±0.042）6.54±2.152）26.14±6.872）急支糖浆组100.25±0.040.28±0.0311.36±5.2546.28±7.034）清肺化痰逐瘀汤低剂量组100.49±0.034）0.31±0.033）16.18±5.823）38.59±8.174）清肺化痰逐瘀汤中剂量组150.41±0.053）0.43±0.054）26.54±7.284）43.87±6.464）清肺化痰逐瘀汤高剂量组200.61±0.044）0.68±0.034）48.34±6.244）66.92±9.214）10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F008图 8清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠结肠组织Occludin蛋白表达影响 （免疫组化，×400）Fig. 8Effect of QHZ on expression of Occludin protein in colon tissue of COPD rats （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F009图 9清肺化痰逐瘀汤对COPD大鼠结肠组织ZO-1蛋白表达的影响 （免疫荧光，×400）Fig. 9Effect of QHZ on expression of ZO-1 protein in colon tissue of COPD rats （IF，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20231107.F010图 10各组大鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达电泳Fig.10Electrophoresis of Occludin， ZO-1 protein expression in rat colon tissue4 讨论中医学中对肺病及肠、肠病及肺的生理，病理关系有着丰富的理论基础。依据COPD患者其咳喘，咳痰等临床症状，可以将其归为“咳嗽”“肺胀”“喘症”等范畴，其病机以肺气虚损为主，外加痰瘀交阻于胸。大肠传导功能依赖于肺气“肃降”功能，若肺失宣降，会导致大肠糟粕传导受制，致使积聚之毒耗伤津液，破坏肠道功能；COPD患者长期受有害烟雾或颗粒物刺激，久病入络，如清·叶天士在《临证指南医案·胃院痛》中言：“初病在经，久痛入络”，络脉生理上输布气血津液，发挥着濡养脏腑之用，而病理上则是邪毒侵袭的通道；肠道受邪日久，大肠邪毒内结化热，上蒸于肺，也会加重肺中痰气交阻之证［13］。现代医学研究表明，COPD病人由于长期处于缺氧状态而影响其肠道功能，肠道损害应被视为COPD这一多系统疾病新的组成部分［14］，有统计COPD患者患炎性肠病（IBD）的风险比健康对照组高出2.72倍［15］。研究证实肺、肠上皮表面的黏膜层与黏膜下层均含有大量的淋巴细胞，其主要负责调控黏膜宿主防御功能［16］，肠道外周淋巴组织中的免疫细胞通过调节共同黏膜免疫系统从而调节远端脏器，如肺脏的免疫应答［17］，这些现象说明肺肠之间在免疫层面存在密切联系。清肺化痰逐瘀汤对肠道多种革兰阳性及阴性杆菌均有抑制作用，能一定程度减少细菌对肠道屏障侵害［18］，研究还证实厚朴能拮抗支气管平滑肌M受体从而扩张气道，改善呼吸功能［19］。丹参水蛭合用具有活血逐瘀通络功效，研究显示丹参多酚能降低人基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达，从而抑制气道炎症；而水蛭具有抗凝、清除氧自由基作用［18］。清肺化痰逐瘀汤诸药合用具有清肺祛痰、化瘀通络、通腑泄浊的功效。急支糖浆由鱼腥草、金荞麦、麻黄、四季青、前胡、紫菀、枳壳、甘草组成，诸药合用，共凑清肺化痰，宣肺止咳的功效，该方符合COPD病机，在临床中对COPD患者有较好的治疗效果［20］，该方药物主要以麻黄、枳壳宣降肺气，鱼腥草、金荞麦、四季青清热解毒，前胡、紫菀润肺化痰止咳为主，重在清肺热，化痰排脓，以治肺为核心；清肺化痰逐瘀汤在清肺热化痰浊方面有所侧重，同时增加大黄、厚朴以通肠腑、利肺气，以肺肠同治为主。为了更好的观察肺肠同治与单纯治肺对COPD的影响，因此本研究选用急支糖浆作为阳性对照药，一项关于分析急支糖浆治疗咳嗽的作用机制的网络药理学和实验验证研究证实，该方的作用机制主要是通过调控炎症过程、调节免疫功能、降低肺损伤等综合作用实现的，其药物作用靶点主要在肺［21］。在本次研究中，笔者首先观察到清肺化痰逐瘀汤与急支糖浆可以有效缓解COPD大鼠呼吸困难等症状，显著改善大鼠肺功能障碍。炎症反应是COPD患者气道重塑的关键机制，炎症因子高表达可激活肺血管巨噬细胞、单核细胞，以及T淋巴细胞等各种炎症细胞，释放大量的细胞因子如内皮素-1、血管内皮生长因子等，促进血管内皮细胞，血管平滑肌细胞增殖分裂，造成血管管壁重塑和肺动脉高压［22-23］，首先检测与气道重塑密切相关的胶原纤维的变化，发现清肺化痰逐瘀汤显著了减少了COPD大鼠肺组织胶原纤维的沉积，进一步的机制表明清肺化痰逐瘀汤降低了α-SMA的表达，抑制了气道周围成纤维细胞的活化；通过检测大鼠血清炎症因子发现，清肺化痰逐瘀汤有效降低了COPD大鼠全身性炎症表达，同时该方还抑制了在炎症信号传导中发挥关键作用的NF-κB p65和p38 MAPK信号通路的激活。当COPD患者出现全身性缺氧与炎症反应时，胃肠道细胞能量代谢将会出现障碍从而引起消化道症状，胃肠道功能破坏，尤其是胃肠道黏膜屏障受损，大量细菌与内毒素进入周身血循环同样也会加重COPD临床症状［24］。Occludin与ZO-1蛋白是控制物质穿过内皮和上皮细胞间连接的关键部件，对阻止有害物质渗入黏膜下层有重要意义［25］，通常肠屏障功能与黏膜损伤会抑制Occludin、ZO-1蛋白表达，通过免疫组化、免疫荧光和Western blot多层次观察到清肺化痰逐瘀汤可以增高大鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达，其表达恢复不仅有助于修复肠黏膜上皮屏障，阻止病原微生物与内毒素入侵，同时有利于细胞内外物质交换。人体内的D-乳酸主要由胃肠道优势菌群-厌氧菌产生，当肠道发生缺氧缺血时肠道黏膜破坏，导致肠黏膜屏障功能下降，同时局部细菌大量繁殖从而产生过量的D-乳酸，并通过受损的肠黏膜进入血液循环，使得外周血D-乳酸水平提高，所以检测血清D-乳酸水平可以判断肠道屏障功能是否减退［26］。DAO是小肠黏膜层绒毛中的细胞酶，小肠黏膜受损时DAO会进入血液，是反映小肠黏膜屏障功能的重要指标［27］。血清MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，肠黏膜细胞受损坏死后可释放入血，是反映肠黏膜上皮细胞完整性和损伤程度的生化指标。IgA是肠黏膜免疫的主要效应因子，能有效抑制病原体等有害物质的入侵，发挥调节吞噬和溶解作用，其表达水平可反映免疫屏障功能变化［28］。研究发现清肺化痰逐瘀汤可有效减少COPD大鼠血清中DAO、D-乳酸、MDA含量，并恢复IgA表达，而单纯治肺组的急支糖浆对DAO、D-乳酸、MDA含量并无明显影响，仅升高IgA表达，这可能与呼吸道源性免疫恢复有关。综上所述，清肺化痰逐瘀汤可以有效改善COPD大鼠肺功能障碍，减少胶原纤维的沉积并抑制成纤维细胞的活化，下调IL-6、TNF-α等炎症因子减少全身性炎症反应，这可能与清肺化痰逐瘀汤修复肠道黏膜屏障，减少细菌与内毒素进入血循环有关；而急支糖浆在改善肺功能障碍，抑制炎症方面有着明显的作用，但其对COPD肠道黏膜屏障损伤没有明显的改善作用，这为中医肺肠合治法临床治疗COPD的优势和作用机制提供了实验依据。但本文没有证据证明清肺化痰逐瘀汤基于修复肠黏膜屏障治疗COPD的具体机制，存在不足，更准确的机制探索还需后续深入研究。