经典名方是历代医家从大量临床实践中形成的中医药精华，其研发受到国家大力支持。开发与研究经典名方既有利于传承中医文化，也有利于现代中医药的发展。二冬汤出自清代《医学心悟》［1］，收录于《古代经典名方目录（第一批）》［2］，由天冬二钱（去心）、麦冬三钱（去心）、花粉一钱、黄芩一钱、知母一钱、甘草五分、人参五分、荷叶一钱组成，具有益气养阴、生津止渴之功，主治上消、口渴多饮。现代临床上对其进行加减或联合西药用于治疗上消、糖尿病前期、2型糖尿病（T2DM）、糖尿病并发症等［3-11］，疗效显著，具有较大的开发价值。目前对二冬汤的研究多集中在临床使用及疗效观察方面，对其有效成分的含量测定较少。本课题组前期曾建立二冬汤的高效液相色谱法（HPLC）含量测定方法［12］，对其组成药味黄芩、知母、甘草、天冬中的黄芩苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、甘草酸、原薯蓣皂苷+原新薯蓣皂苷进行了含量测定，而其余4味中药的有效成分由于含量低或者分离度低而无法进行定量分析。本课题组前期对二冬汤体外成分进行了定性分析［13］，共鉴定123个化合物，主要为甾体皂苷类、三萜皂苷类、黄酮类及生物碱类。从中挑选相对含量较高的成分并结合相关药理文献报道确认，黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素具有调节糖脂代谢作用［14］，知母皂苷BⅡ、芒果苷、新芒果苷具有促进胰岛素分泌作用［15］，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、芦丁、荷叶碱、金丝桃苷具有降脂、抗炎作用［16］，甘草酸、甘草苷、甘草素具有降脂、抗炎、抗肥胖作用［17］，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re具有降血糖、增加胰岛素与受体结合能力的作用［18］，甲基麦冬黄烷酮A和麦冬皂苷D具有降血糖、增加胰岛素敏感性作用［19］。上述成分均为二冬汤功能主治相关成分，对其进行含量测定有助于为二冬汤复方制剂质量标准的制定提供参考。因此，本研究拟采用超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱法（UHPLC-QqQ-MS）同时测定二冬汤中知母皂苷BⅡ、芒果苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷等20个成分的含量，并利用网络药理学方法对这些成分进行抗胰岛素抵抗作用靶点和通路的预测，初步揭示二冬汤抗胰岛素抵抗的分子作用机制。1 材料ME204/02型十万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，HC-3018型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。麦冬皂苷D、伪原薯蓣皂苷、金丝桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、甘草酸、甘草素对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为CHB180119、CHB180408、CHB190107、CHB190124、CHB201104、CHB201103，纯度均98%），原薯蓣皂苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、天然辣椒素对照品（成都植标化纯生物技术有限公司，批号分别为PCS0227、PCS0759、PCS0762、PCS0770、PCS0369，纯度均98%），芒果苷、知母皂苷BⅡ、黄芩苷、荷叶碱、甘草苷、黄芩素对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为7ZL9-4NJO、OP5R-LQP9、7109-BTVQ、V53E-4PCB、31SE-779C、C9WB-5L8D，纯度均98%），汉黄芩素、甲基麦冬黄烷酮A对照品（ChemFaces，批号分别为CFN97089、CFN98595，纯度均98%），新芒果苷对照品（北京世纪奥科生物技术有限公司，批号为BWB50645，纯度98%），芦丁对照品（成都德思特生物技术有限公司，批号为DST190608-016，纯度98%），水为屈臣氏饮用水，乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯。15批二冬汤冻干粉样品（编号S1~S15）为实验室自制［12］，饮片来源信息见增强出版附加材料，均经中国中医科学院中药研究所代云桃研究员鉴定，饮片的基原分别为百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis的干燥块根、百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus的干燥块根、葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii的干燥根、唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis的干燥根、百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides的干燥根茎、睡莲科植物莲Nelumbo nucifera的干燥叶、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎、五加科植物人参Panax ginseng的干燥根和根茎。2 方法与结果2.1　二冬汤活性成分的UHPLC-QqQ-MS分析2.1.1　色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相选择0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0~3 min，90%~87%A；3~6 min，87%~86%A；6~9 min，86%~83%A；9~11 min，83%~75%A；11~18 min，75%~70%A；18~19 min，70%~52%A；19~22 min，52%A；22~25 min，52%~5%A；25~27 min，5%~90%A；27~30 min，90%A），流速0.4 mL·min-1，柱温40 ℃，进样量2 μL。2.1.2　质谱条件电喷雾离子源（ESI），多反应监测（MRM）模式，正、负离子模式检测，离子喷雾电压4.5 kV，离子源温度500 ℃，气帘气压力35 psi（1 psi≈6 895 Pa），气体1（喷雾器）压力50 psi，气体2（加热器）压力50 psi，碰撞气体压力9 psi。在上述仪器条件下测定，化合物的分子式、定量离子对、去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231146.T001表1二冬汤中20个待测成分的离子对检测条件Table 1Detection conditions of 20 components in Erdongtang归属成分分子式母离子m/z子离子m/zDP/VCE/V荷叶荷叶碱C19H21NO2296.8266.231.3022.15槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷C21H18O13477.0301.1-55.98-29.99金丝桃苷C21H20O12463.2300.0-100.04-36.55芦丁C27H30O16609.2300.1-80.00-50.35知母芒果苷C19H18O11421.2331.0-54.01-30.09新芒果苷C25H28O16582.9463.2-73.98-38.26知母皂苷BⅡC45H76O19919.3757.4-246.71-60.43人参人参皂苷Rb1C54H92O231 107.6945.4-230.89-61.36人参皂苷Rg1C42H72O14799.5637.3-211.99-35.55人参皂苷ReC48H82O18945.5637.4-149.06-51.05黄芩黄芩素C15H10O5269.1195.2-48.90-33.69黄芩苷C21H18O11445.0269.2-26.57-36.14汉黄芩素C16H12O5283.1268.0-85.80-25.89甘草甘草酸C42H62O16821.3351.2-70.00-57.10甘草苷C21H22O9417.0255.0-80.00-30.48甘草素C15H12O4255.0119.1-80.08-28.99麦冬麦冬皂苷DC44H70O16287.330.038.0024.42甲基麦冬黄烷酮AC19H18O6341.1178.0-110.00-46.00天冬原薯蓣皂苷C51H84O221 047.5901.5-214.21-61.81伪原薯蓣皂苷C51H82O211 029.4883.3-168.82-62.13内标天然辣椒素C18H27NO3304.0168.1-44.84-17.412.1.3　供试品溶液的制备分别取15批二冬汤冻干粉约1.0 g，精密称定，分别加入不同体积水，使质量浓度为冻干之前的二冬汤标准汤剂质量浓度，用70%甲醇稀释100倍，加入天然辣椒素使之质量浓度为800 μg·L-1，于12 000 r·min-1离心5 min（离心半径5.79 cm），取上清过0.22 µm微孔滤膜，即得。2.1.4　混合对照品溶液的制备取知母皂苷BⅡ、芒果苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、黄芩苷、原薯蓣皂苷、甘草酸、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、甲基麦冬黄烷酮A、金丝桃苷、新芒果苷、伪原薯蓣皂苷、芦丁、人参皂苷Re、甘草素、汉黄芩素、天然辣椒素、荷叶碱、麦冬皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度均为20 mg·L-1的溶液，作为对照品储备液。取各对照品储备液适量，加甲醇制成各成分质量浓度均为500 μg·L-1的混合对照品溶液。2.1.5　线性关系和定量限考察分别精密量取各对照品储备液适量，用甲醇稀释制得系列对照品溶液，各加入内标使之质量浓度为800 μg·L-1，按2.1.1和2.1.2项下条件测定，以对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标，对照品质量浓度与内标质量浓度之比为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归计算，以信噪比（S/N）=10作为定量限（LOQ），结果表明各成分质量浓度在一定范围内与峰面积呈良好线性关系，见表2，其他数据见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20231146.T002表2二冬汤中20个待测成分的回归方程和线性范围Table 2Regression equations and linear ranges of 20 components in Erdongtang成分回归方程线性范围/μg·L-1知母皂苷BⅡY=0.211 8X+0.039 00.234 3~15芒果苷Y =4.181 4X+0.059 70.156 2~10槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷Y =3.843 7X+1.142 90.312 5~20黄芩素Y =0.035 6X-0.004 81.25~80黄芩苷Y =3.204 6X+1.931 21.25~80原薯蓣皂苷Y =0.114 0X+0.026 40.25~16甘草酸Y =1.262 3X-0.014 40.037 5~2.4甘草苷Y =1.179 7X+0.011 00.025~1.6人参皂苷Rb1Y =0.079 3X-0.000 10.012 5~0.8人参皂苷Rg1Y =0.073 6X-0.000 30.012 5~0.8甲基麦冬黄烷酮AY =2.863 0X-0.000 70.001 25~0.04金丝桃苷Y =3.447 5X-0.020 80.012 5~0.8新芒果苷Y =1.043 7X-0.046 50.062 5~4伪原薯蓣皂苷Y =0.082 7X-0.000 80.012 5~0.8芦丁Y =0.090 3X+0.002 70.05~3.2人参皂苷ReY =0.032 6X+0.000 050.012 5~0.8甘草素Y =1.989 6X+0.019 70.025~1.6汉黄芩素Y =0.508 6X-0.000 80.012 5~0.8荷叶碱Y =53.110 0X+2.059 80.012 5~0.8麦冬皂苷DY =1.565 3X+0.001 60.001 25~0.042.1.6　精密度试验按2.1.3项下方法制备供试品溶液，加入内标使之质量浓度为800 μg·L-1，日内精密度按2.1.1和2.1.2项下条件连续进样6次，计算各成分峰面积与内标峰面积比值的相对标准偏差（RSD）在3.5%~8.6%。连续3 d内重复进样6次，计算日间精密度的RSD在4.2%~8.9%，表明仪器精密度良好。详细数据见增强出版附加材料。2.1.7　稳定性试验按2.1.3项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、12、24 h按2.1.1和2.1.2项下条件进样分析，计算各成分峰面积与内标峰面积比值的RSD在1.6%~8.9%，数据见增强出版附加材料，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。2.1.8　重复性试验取同批样品按2.1.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，按2.1.1和2.1.2项下条件测定，计算20个待测成分平均质量分数的RSD在3.4%~8.1%，详细数据见增强出版附加材料，表明该方法重复性良好。2.1.9　加样回收率试验取已知各成分含量的同批二冬汤冻干粉6份，精密称定，加入一定量各对照品溶液，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，按2.1.1和2.1.2项下条件进样分析，计算知母皂苷BⅡ、芒果苷、黄芩素等20个成分的平均加样回收率处于92.62%~109.28%，RSD 1.9%~7.9%，详细数据见增强出版附加材料，结果表明该方法准确度良好。2.2　样品测定分别取15批二冬汤冻干粉样品适量，按2.1.3项下方法制备供试品溶液，平行3份，按2.1.1和2.1.2项下条件测定，计算各成分含量，结果见表3。提取离子流色谱图见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20231146.T003表3二冬汤中20个成分的质量浓度Table 3Contents of twenty components in Erdongtang编号黄芩素黄芩苷汉黄芩素知母皂苷BⅡ芒果苷新芒果苷槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷芦丁荷叶碱金丝桃苷S11 599.801 298.1120.74448.16190.0645.55145.5248.7957.08136.78S21 515.251 254.0211.28604.89166.6282.31123.5746.9163.4888.83S31 587.201 322.288.91314.56198.22127.03297.6561.9212.078.56S41 552.701 356.9211.51356.72210.1987.86310.61625.3910.8811.64S51 539.141 350.7518.22512.88189.6259.0289.301 553.6160.23111.05S61 479.801 281.5414.50602.63185.2183.06299.11158.7412.7214.38S71 259.391 169.149.38442.71178.3754.87285.42403.849.916.96S81 389.281 216.507.16358.31152.9568.07337.84108.6514.719.78S91 635.781 411.5213.87440.58176.8470.23336.7562.3612.608.32S101 551.751 341.0916.07474.04197.3775.15423.26165.9628.4649.90S111 290.521 078.377.74379.44167.07101.35280.6366.4611.258.77S121 412.291 284.679.92423.11179.9095.64390.14157.430.898.66S131 442.581 244.5712.67444.49217.0455.54307.2193.6519.4110.16S141 489.531 258.7513.80501.94169.0637.45270.27203.1616.517.98S151 420.451 228.8014.82245.10148.5947.91194.56709.7214.649.83编号甘草酸甘草苷甘草素原薯蓣皂苷伪原薯蓣皂苷人参皂苷Rb1人参皂苷Rg1人参皂苷Re麦冬皂苷D甲基麦冬黄烷酮AS1270.5582.8368.2065.5913.1812.5213.8712.254.181.52S2147.9433.7628.9958.576.687.3111.467.783.191.09S364.2044.4238.2088.876.7711.4213.758.714.051.19S4117.4763.9855.8787.598.2919.2322.1615.372.100.74S572.3646.8640.4883.455.4911.4715.917.942.211.07S655.9730.8926.64284.2617.1414.6213.4613.212.871.00S7130.4683.2071.4775.276.3512.3816.5910.133.011.08S8263.73100.1387.43281.3117.8110.3812.958.342.570.99S9349.85120.12108.50234.3315.189.9410.7812.652.501.15S10391.47122.78110.6771.486.7119.1328.3312.763.241.34S11263.05105.9894.67211.8212.9412.6816.8111.683.741.40S12193.5088.0376.78196.4814.2915.6116.4313.053.741.66S1383.6937.6334.2266.4022.9619.2117.8015.354.291.58S14125.9956.2654.35105.9218.4014.7516.7618.573.411.67S15114.4361.4156.19135.5617.8723.8722.0824.762.081.19mg·L-12.3　二冬汤活性成分的作用靶点及机制预测2.3.1　“药材-成分-靶点”网络的构建将二冬汤中20个成分的名称导入PubChem数据库，获取各化合物的isomeric SMILES结构式，将其分别导入SwissTargetPrediction数据库和SEA数据库获取化学成分靶点，合并后导入UniProt以规范靶点名称，进行靶点的整合与去除重复值，结果得到887个潜在作用靶点。以“type 2 diabetes mellitus”为关键词在人类基因数据库（GeneCards）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）和药物靶标数据库（TTD）中检索疾病靶点，导入UniProt，规范靶点名称，整合后去除重复基因得到2 057个疾病靶点。最后，将化学成分的靶点和T2DM疾病靶点取交集，得到110个交集靶点，即二冬汤发挥抗胰岛素抵抗作用的靶点。基于交集靶点，利用Cytoscape 3.7.1建立“药材-成分-靶点”网络，见增强出版附加材料。2.3.2　蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析将二冬汤潜在活性成分的作用靶点与疾病靶点相交，选择重叠的靶点并将其导入STRING 11.5，以获得PPI关系。将结果导入到Cytoscape 3.7.1，构建并分析交互网络，采以度值中位数值为标准筛选关键蛋白，PPI网络见图1，网络中的节点表示中药成分或靶点，边表示二者之间的相互联系。结果共涉及43个节点，186条边，其中节点的颜色和大小表示度值的大小，颜色越深、节点越大说明度值越大；边表示功能相关性，边的粗细代表combined score的大小。最终筛选的关键蛋白包括信号转导与转录激活因子3（STAT3）、类固醇受体共激活因子（SRC）、转录激活因子JUN等，提示这些靶点是整个网络中的枢纽蛋白，起较为关键的作用，可能是二冬汤发挥药效的关键靶点。10.13422/j.cnki.syfjx.20231146.F001图1二冬汤中20个成分治疗T2DM的潜在靶点的PPI网络Fig. 1PPI network of potential targets for treatment of T2DM with 20 components in Erdongtang2.3.3　基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析将交集靶点上传至DAVID 2021数据库，进行GO的细胞组成（CC）、生物过程（BP）、分子功能（MF）富集分析；利用KEGG进行信号通路分析，根据通路富集结果获得相应P，选择P0.01条件下排序前10的通路，通过在线作图平台微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）对富集分析结果进行可视化处理，综合预测二冬汤中20个成分治疗T2DM的分子作用机制。结果共得到GO条目568个，其中与BP有关的条目共400个，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞增殖的正调控、药物反应等；与CC相关条目56个，主要涉及质膜、胞质溶胶、质膜的组成部分等方面；与MF有关的条目共112个，主要涉及蛋白结合、相同的蛋白质结合、蛋白质异二聚化活性等方面。BP、CC、MF中排序前10的条目见增强出版附加材料。KEGG通路富集筛选得到108条信号通路（P0.05），其中磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路是较为显著且对胰岛素信号传导影响较大的通路。KEGG排序前10的通路见增强出版附加材料。3 讨论本文采用UHPLC-QqQ-MS对二冬汤中20个活性成分进行含量测定，所检测的化学成分基本覆盖了二冬汤中的7味组成药材，所建方法样品处理简便、专属性强、灵敏度高、测定结果准确性高，可为二冬汤质量标准的提升和完善奠定基础。在优化分析条件时，发现ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）对中等极性成分有很好的保留和分离效果；生物碱类成分荷叶碱和皂苷类成分麦冬皂苷D在正离子模式下的响应优于负离子模式，黄酮类成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、芦丁、芒果苷、新芒果苷、黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、甘草苷、甘草素和皂苷类成分甘草酸、知母皂苷BⅡ、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、甲基麦冬黄烷酮A、人参皂苷Re、原薯蓣皂苷、伪原薯蓣皂苷在负离子模式下的响应优于正离子模式；最后在MRM模式下确定了所有对照品的离子对条件，以保证定量分析相对准确。在前期优化条件时，曾尝试对天花粉中的雪胆素甲和葫芦素类成分进行测定，但并未检测到相关成分，故只对二冬汤中另外7味组成药材的主要成分进行了UHPLC-QqQ-MS含量测定，弥补了本课题组前期建立的HPLC的不足，对分离度不好的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，以及含量较低的甲基麦冬黄烷酮A、麦冬皂苷D和人参皂苷类成分进行了定量，进一步提升了二冬汤的质量评价方法。15批样品含量检测结果显示，20个成分中含量较高的是黄芩素和黄芩苷，汉黄芩素、人参皂苷Rb1、伪原薯蓣皂苷、人参皂苷Rg1等的含量较低。黄芩中黄芩素、黄芩苷和汉黄芩素的含量以山西产地含量为最高，河北产地含量最低；知母中知母皂苷BⅡ在各批次间含量相差较大，河北产地含量最高，内蒙古产地含量最低；荷叶中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、芦丁和金丝桃苷在各批次间含量相差较大，湖南产地含量最高，江西产地含量最低；天冬中原薯蓣皂苷和伪原薯蓣皂苷在各批次间含量相差较大，贵州产地含量最高，四川产地含量最低；甘草中甘草酸、甘草素和甘草苷在各批次间含量相差较大，山西产地含量最高，内蒙古产地含量最低。该测定结果可为二冬汤复方制剂的开发和深入研究奠定基础，后续需进一步对20个成分的含量测定结果进行相关性分析，根据成分间的相关性，从20个成分中挑选出部分代表性强的成分，使用HPLC对其进行含量测定，以简化检测条件。为了进一步研究二冬汤的分子作用机制，笔者采用网络药理学方法对其定量分析成分进行靶点预测及通路富集，结果发现其主要涉及STAT3、SRC和JUN等43个靶点，富集的通路主要包括PI3K/Akt信号通路等108条信号通路，说明二冬汤通过多靶点、多通路发挥抗胰岛素抵抗的功效。据报道，PI3K/Akt信号通路与调节糖脂代谢［20］、促进胰岛素分泌［21］、降脂［22］、抗炎［23］、抗肥胖［24］、降血糖［25］和增加胰岛素敏感性［26-27］等药理活性相关，与二冬汤组成药味中指标成分的药理作用相符，提示本研究选择的20个定量分析成分较为合理，但后续仍需通过药理实验进行验证。