辣木叶Moringa oleifera为辣木科Moringaceae辣木属Moringa热带落叶乔木辣木的干燥叶，原产于印度［1］。其营养丰富、包含多种化学物质群、具有明显的药理活性，如总黄酮［2］、总多糖［3］、总多酚［4］具有抗氧化活性，总有机酸［5］具有抑菌活性，总芥子碱［6］具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。我国云南省于20世纪60年代引种辣木，辣木叶在我国部分省市已有几十年的食用历史，于2012年被我国卫生部列为新资源食品，其食品行业现行标准［7］于2018年3月1日起正式实施。该行业标准对辣木叶鲜品、干品、粉末、辣木茶进行了感官分级，并明确了理化、污染物限量及农药残留限量指标的数值参考。此外，2021年5月19日正式实施了辣木叶粉的行业标准［8］。另检索到辣木叶企业标准相关条目1条（金庆辣木叶，发布于2018年1月12日，无标准号）。由此可知，辣木叶在食品行业中发展迅速，且已有可供参考的质量标准。鉴于辣木叶资源丰富、且已发现了多种化学成分类型（如黄酮类、苯丙素类、萜类、甾体类、生物碱类、异硫氰酸酯类等）及降血糖［9］、降血脂［10-11］、润肠通便［12-13］、降血压、抗肿瘤、保肝等广泛的药理活性，证实其药用前景广阔，为其以药材身份纳入我国中医药体系奠定了基础。中药标准汤剂是基于中医理论与临床应用，并经优化提取方法与制备工艺的水煎剂，保障临床用药的准确性和剂量的一致性，在标准化临床用药过程中发挥了重要作用，同时中药标准汤剂的研究也对药材的质量及安全性把控奠定了坚实的基础。目前尚未有辣木叶标准汤剂的研究报道，课题组前期已开展了辣木叶煎煮过程动力学研究［14］。根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术指导》中标准汤剂的相关研究要求［15-17］，本研究拟在单因素实验基础上，采用响应面法结合主成分分析，以多指标对辣木叶汤剂煎煮工艺参数进行优选，进而选用15批辣木叶制备标准汤剂，建立大类成分和指标成分含量测定方法，结合转移率、出膏率、比重和pH等指标，为建立基于中医临床应用的辣木叶标准汤剂质控标准奠定基础。1 材料LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司），XS105DU型十万分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），LD-T100A型高速万能粉碎机（上海顶帅电器有限公司），FX101-2型电热鼓风干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司），KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BSM-3200.2型百分之一电子天平（上海卓精电子科技有限公司），UV-1800型紫外-可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司），HH-61型数显恒温水浴锅（江苏杰瑞尔电器有限公司），C21-WT2112T型多功能电磁炉（广州美的生活电器制造有限公司），SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州赛美德仪器有限公司），N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），PHSJ-3F型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），14支组密度计（河北省青县燕河仪器仪表有限公司），LGJ-10型冷冻干燥机［四环福瑞科仪发展（北京）有限公司］。维采宁-2对照品（成都普思生物科技股份有限公司，批号PS000897），芦丁对照品（成都曼斯特生物科技股份有限公司，批号MUST-15010707），L-色氨酸、新绿原酸、隐绿原酸、异槲皮素、紫云英苷、绿原酸、D-（+）-葡萄糖（无水）、L-精氨酸、芥子碱硫氰酸盐对照品（成都克洛玛生物有限公司，批号分别是CHB190220、CHB190217、CHB170828、CHB160506、CHB181115、CHB160418、CHB180929、CHB190120、CHB-J-028，纯度均≥98%），水为娃哈哈纯净水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。15批PKM1型辣木叶药材购自云南天佑科技开发有限公司，经中国中医科学院李志勇研究员鉴定为辣木科辣木属辣木M. oleifera的干燥叶，样品具体信息见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T001表1辣木叶样品信息Table 1Sample information of Moringa oleifera leaves编号药材批号产地编号药材批号产地Y11005410424-1云南西双版纳Y91005410191-3云南省德宏州芒市Y21005410424-2云南西双版纳Y101005410191-4云南省德宏州芒市Y31005410424-3云南西双版纳Y111005410191-5云南省德宏州芒市Y41005410057-1云南西双版纳Y121005410191-6云南省德宏州芒市Y51005410057-2云南西双版纳Y131005410191-7云南省德宏州芒市Y61005410057-3云南西双版纳Y141005410191-8云南省德宏州芒市Y71005410191-1云南省德宏州芒市Y151005410191-9云南省德宏州芒市Y81005410191-2云南省德宏州芒市注：所有药材采收时间均为2018年12月2 方法与结果2.1　辣木叶标准汤剂供试品溶液的制备参考《医疗机构中药煎药室管理规范》研究辣木叶煎煮工艺，最终确定的工艺参数为称取辣木叶100.00 g，置于砂锅中，加水浸泡30 min。头煎12倍量水，煎煮30 min，趁热过滤，二煎10倍量水，煎煮20 min，趁热过滤。合并2次滤液，60 ℃减压浓缩至500 mL，-50 ℃冷冻干燥，制成冻干粉备用。取冻干粉适量，精密称定，加水溶解制成相当于生药量0.2 g·mL-1的辣木叶标准汤剂溶液。编号S1~S15表示15批辣木叶药材所对应的标准汤剂。精密量取溶液2.5 mL加水稀释并定容到10 mL量瓶中，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜滤过即得0.05 g·mL-1的辣木叶标准汤剂供试品溶液。2.2　色谱条件依据前期建立的特征图谱方法进行分析，采用Phenomenex Luna C18（2）100A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），流动相为乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~20 min，5%~13%A，20~40 min，13%~18%A，40~50 min，18%~30%A，50~60 min，30%~60%A，60~70 min，60%~100%A，70~80 min，100%A，80~95 min，100%~5%A），流速0.8 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量5 µL，检测波长254 nm。2.3　基于响应面法优化辣木叶标准汤剂煎煮工艺2.3.1　响应面试验设计在单因素实验的基础上，以新绿原酸、L-色氨酸、隐绿原酸、维采宁-2、异槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷、紫云英苷、山柰酚-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷8个特征成分的相对峰面积及出膏率为评价指标，以头煎溶剂倍量（A）、二煎溶剂倍量（B）、头煎煎煮时间（C）、二煎煎煮时间（D）为影响因素，以-1、0、1编码各因素的低、中、高水平。采用Design-Expert 8.0.5软件设计四因素三水平的Box-Behnken响应面法进行实验，方案见表2。出膏率计算公式为出膏率=（M1×V2）/（M2×V1）×100%，式中M1表示实际称重的干膏质量平均值（g），M2为辣木叶质量（g），V1为出膏率测定时所用的体积，V2为标准溶液总体积。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T002表2辣木叶标准汤剂煎煮工艺优选的响应面试验分析Table 2Response surface test analysis for optimizing decoction process of M. oleifera leaf standard decoction编号溶剂倍量/倍煎煮时间/minYZ头煎二煎头煎二煎114123020-2.5980.27221284020-2.6900.261310102020-1.1940.4504121030202.6560.9395101030100.3910.6516101040200.5670.6747121230101.9260.846812122020-1.3700.42891283010-0.3300.5601014102020-1.1320.45811121020101.7300.821121483020-3.6820.13513121020300.9550.72314121030202.5610.92715121240201.5340.79616121030203.1401.0001712104030-0.6280.52218121030202.6910.94319121040102.3850.90420141030101.5780.80221101030300.7240.6942214104020-2.1110.334231083020-3.6700.1362414103030-4.7440.0002512820200.6420.6832610123020-0.3910.55227121230300.0770.611281283030-1.7820.37629121030202.7660.9532.3.2　主成分分析使用SPSS 26.0软件，原始数据进行标准化（Z-Score）处理，通过KOM检验法和Bartlett球体检验法进行适用性检验，KOM=0.8020.6，Bartlett球形度检验结果为378.345，Sig=0.0000.01，说明各个指标之间具有关联性，适用主成分分析。将特征值1的因子作为提取标准，前2个主成分解释了全部方差的86.253%（特征值分别为6.599及1.164，比例分别为73.324%及12.928%），进一步计算主成分的分数及规范化综合得分，以规范化综合得分值为响应面值做响应面分析，综合得分（Y）和规范化得分（Z）见表2。F=(FAC1×x1×W1+⋯+FAC2×x2 ×W2)×W1+2 （1）Y=(F1×W1+F2×W2)/(W1+W2) （2）Z=(Y-Ymin)/(Ymax-Ymin) （3）公式（1）为主成分得分（F）计算公式：FAC表示主成分SPSS生成值，x表示主成分对应的特征值，W表示主成分对应的占比；公式（2）为综合评分值（Y）计算公式；公式（3）为综合评分规范化值（Z）计算公式。2.3.3　回归方程方差分析将Z值录入Design-Expert 8.0.5软件，根据fifth模型进行分析，以Z为效应值，对各因素编码值进行拟合，得回归方程Z=0.95-0.097A+0.11B-0.006C-0.14D-0.07AB-0.087AC-0.21AD+0.20BC-0.013BD-0.071CD-0.36A2-0.30B2-0.12C2-0.064D2根据回归模型方差分析得出，方差模型P0.01，差异具有统计学意义，失拟项不明显，表明该回归模型与实际试验具有较高的拟合度，因此可用该回归方程预测辣木的煎煮工艺最佳工艺参数。该回归模型决定系数R2=0.9750.9，调整决定系数R2Adj=0.950.9，说明该模型可以解释95%响应值的变化，回归模型较为可靠，可用于辣木叶煎煮工艺优化的理论推测。在该模型中，一次项A、B、D具有显著影响，C不明显；二次项A2、B2、C2均呈显著影响，D2具有明显影响；交互项中，AD、BC具有显著性差异，AB、AC、CD具有明显差异，BD无明显差异。各因素的影响大小为二煎煎煮时间（D）二煎溶剂倍量（B）头煎溶剂倍量（A）头煎煎煮时间（C）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T003表3辣木叶标准汤剂煎煮工艺优选的回归方程系数检验Table 3Coefficient test of regression equation for optimizing decoction process of M. oleifera leaf standard decoction方差来源平方和自由度均方F模型2.10140.1539.062）A0.1110.1129.382）B0.1510.1539.832）C0.000 43210.000 4320.11D0.2310.2360.222）AB0.01910.0195.071）AC0.03010.0307.891）AD0.1810.1845.762）BC0.1610.1640.672）BD0.000 650 310.000 650 30.17CD0.02010.0205.261）A20.8310.83216.682）B20.5710.57148.752）C20.09610.09625.112）D20.02710.0276.921）残差0.054140.003 836-失拟项0.050100.005 0025.43纯误差0.003 68540.000 921 2-总和2.1528--注：1）P0.05，2）P0.012.3.4　两因素间交互分析两因素间的交互作用见增强出版附加材料，结果显示，头煎溶剂倍量与头煎煎煮时间、二煎煎煮时间的交互作用显著（P0.01），而AB、AC、CD交互作用明显（P0.05）。根据模拟拟合结果，辣木叶的预测最佳煎煮工艺为头煎及二煎溶剂倍量分别为12.30、10.73倍，头煎及二煎煎煮时间分别为30.87、15.16 min。2.3.5　煎煮工艺的验证根据以上结果，选择以头煎倍量及二煎倍量分别为12、10倍，头煎及二煎煎煮时间分别为30、20 min，平行煎煮3批实验样品。按照2.1项下步骤进行供试品溶液制备，按照2.2项下步骤进行检测，结果显示，3批水煎液的8个特征峰相对峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.2%~3.6%，出膏率RSD为2.3%，表明选择的工艺稳定性较好。见表4。最终确定辣木叶最优煎煮工艺为头煎及二煎的溶剂倍量分别为12倍和10倍，头煎及二煎的煎煮时间分别为30、20 min。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T004表4辣木叶标准汤剂煎煮工艺的验证试验Table 4Validation test of decoction process of M. oleifera leaf standard decoctionNo.新绿原酸L-色氨酸隐绿原酸维采宁-2异槲皮素槲皮素-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷紫云英苷山柰酚-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷出膏率/%1753 605514 335634 126362 9882 554 1531 914 5681 119 689876 12439.542737 122536 719665 140356 1422 742 0461 891 9961 187 165917 34738.123767 320533 895674 629355 2692 644 1561 963 1801 196 068921 89537.912.4　辣木叶标准汤剂的质量标准研究2.4.1　对照品溶液的制备精密称定新绿原酸、L-色氨酸、隐绿原酸、维采宁-2、异槲皮素、紫云英苷6个对照品各适量，分别置于10 mL量瓶中，加50%甲醇水使溶解并定容至刻度，吸取适量母液，配制成质量浓度分别为79.20、88.80、38.00、15.47、39.68、86.10 mg·L-1混合对照品溶液。精密称定芦丁、绿原酸、D-（+）-葡萄糖（无水）、L-精氨酸、芥子碱硫氰酸盐对照品适量，分别配制成质量浓度分别为0.082、0.170、0.350、0.117、0.360 g∙L-1的对照品溶液。2.4.2　供试品溶液的制备取辣木叶粉末（过四号筛）0.2 g，精密称定，置25 mL圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇溶液10 mL，称定质量，加热回流提取60 min，取出，放冷。再称定质量，用50%甲醇水补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得辣木叶药材供试品溶液。按2.1项下方法制备含生药量为0.05 g·mL-1的辣木叶标准汤剂供试品溶液。供特征图谱及特征成分检测分析。取辣木叶药材样品粉末（过四号筛）50.00 mg，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min（300 W，40 kHz），放冷，用甲醇补足损失质量，滤过，得总黄酮供试品溶液。取辣木叶样品粉末50.00 mg，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用75%甲醇补足损失质量，滤过，得总有机酸/总芥子碱供试品溶液。取辣木叶样品粉末20.00 mg，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，精密加水20 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，用水补足减失质量，滤过，得总多糖/总α-氨基酸供试品溶液。按2.1项下方法制备含生药量0.2 g·mL-1的辣木叶标准汤剂供试品溶液。供大类成分检测分析。2.4.3　特征图谱的建立按2.4.2项下方法制备药材供试品溶液及含生药量0.05 g·mL-1的辣木叶标准汤剂供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样检测。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版），对15批标准汤剂的特征图谱进行分析，采用中位数法，时间窗设为0.1 min，进行多点校正，手动标定8个Mark峰，进行Mark峰匹配，将相似度结果及匹配峰数据导出。15批标准汤剂的相似度均0.95。以峰5（异槲皮素）为参照峰（S），15批标准汤剂相对保留时间的RSD均3.0%，峰面积RSD在4.0%~18.9%之间（峰2、峰7、峰8峰面积的RSD分别为17.5%、17.6%、18.9%），这可能与不同批次药材的产地不同有关。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.F001图1辣木叶药材及其标准汤剂的色谱叠加Fig. 1Chromatographic superposition of M. oleifera leaf medicinal materials and standard decoction注：A.辣木叶药材及标准汤剂的色谱叠加；B.15批标准汤剂特征谱叠加；1.新绿原酸；2.L-色氨酸；3.隐绿原酸；4.维采宁-2；5（S）.异槲皮素；6.槲皮素-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷；7.紫云英苷；8.山柰酚-3-O-β-D-（6ʺ-O-丙二酰）葡萄糖苷2.4.4　特征成分含量测定按2.4.2项下方法制备药材供试品溶液及含生药量0.05 g·mL-1的辣木叶标准汤剂供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样检测。结果显示，15批辣木叶药材中6个单体成分新绿原酸、L-色氨酸、隐绿原酸、维采宁-2、异槲皮素、紫云英苷的平均质量分数分别为5.81、1.91、2.23、0.94、6.59、2.91 mg·g-1，RSD分别为9.2%、19.7%、10.9%、7.6%、9.4%、12.0%，以异槲皮素含量最高，新绿原酸含量次之，维采宁-2的含量最低，6个成分的质量分数总和为18.36~22.24 mg·g-1。15批辣木叶标准汤剂中6个成分新绿原酸、L-色氨酸、隐绿原酸、维采宁-2、异槲皮素、紫云英苷按投药量计算的平均质量分数分别为2.84、1.71、2.05、0.76、3.50、1.74 mg·g-1，RSD分别为11.1%、21.9%、11.9%、11.1%、13.8%、21.5%，高低排序与药材基本一致。参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术指导》中标准汤剂的相关研究要求［15］，以x¯±30%限定标准汤剂的质量分数及转移率范围来反映辣木叶从药材-标准汤剂的转移情况。标准汤剂中新绿原酸、L-色氨酸、隐绿原酸、维采宁-2、异槲皮素、紫云英苷的x¯±30%质量分数范围分别为1.99~3.69、1.20~2.22、1.44~2.67、0.53~0.99、2.45~4.55、1.22~2.26 mg·g-1；6个成分的平均转移率分别为49.10%、89.18%、92.36%、81.40%、53.51%、59.72%，RSD分别为9.8%、12.6%、15.2%、13.1%、14.9%、20.5%；6个成分的x¯±30%转移率范围分别为34.37%~63.83%、62.43%~115.94%、64.65%~120.06%、56.98%~105.82%、37.46%~69.57%、41.81%~77.64%。个别批次的某些指标的含量略低于下限，如L-色氨酸（S4、S5、S6）、紫云英苷（S4、S5、S6），Y8-S8的隐绿原酸（120.25%）转移率略高于x¯±30%。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T005表5辣木叶标准汤剂中特征成分质量分数及转移率Table 5Contents and transfer rates of of characteristic compounds in M. oleifera leaf standard decoctionNo.新绿原酸L-色氨酸隐绿原酸维采宁-2异槲皮素紫云英苷YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%15.483.1557.552.322.0186.772.692.1680.311.000.7676.427.003.7052.923.471.9656.4325.352.9955.822.281.8983.152.472.0683.430.970.7072.326.493.4953.713.311.7954.0435.572.9653.162.341.9784.302.602.2586.480.990.7677.196.443.6156.073.221.8958.6945.242.2943.791.310.9875.162.171.5772.390.880.6168.666.762.7841.202.611.0038.4855.102.3145.341.260.9978.962.151.6978.870.870.6170.546.502.7943.002.491.0140.7465.162.4246.811.321.0277.252.101.6679.020.880.6472.427.152.9841.692.591.0741.3775.622.7849.491.921.8194.501.882.05108.690.890.8494.595.673.5963.342.921.9366.2485.582.9051.971.841.95106.461.842.22120.250.890.8696.185.523.3260.262.942.0068.1595.642.9552.271.961.99101.311.972.23113.170.860.86100.185.493.6666.622.722.0173.59106.612.7641.762.291.8681.202.351.9583.201.090.8173.826.593.2248.903.321.8856.71116.282.6442.032.261.7979.252.201.9186.871.010.7574.846.733.2147.743.281.8857.17126.212.8646.022.131.7381.202.152.0796.271.030.7775.016.803.4951.293.142.0464.92136.193.2452.291.751.85105.352.262.27100.380.890.8291.996.874.362.682.431.8475.58146.613.2649.301.851.86100.232.372.3699.480.930.8086.077.314.0455.342.671.8870.26156.463.1648.951.831.87102.652.312.2396.550.890.8190.747.544.3757.952.611.9273.52注：Y.药材，S.标准汤剂（表6同）mg·g-12.4.5　大类成分含量测定按2.4.2项下方法制备辣木叶药材供试品溶液及含生药量0.2 g·mL-1辣木叶标准汤剂溶液，按照2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）通则0401紫外-可见分光光度法，精密量取25 μL标准汤剂，分别在420、328、388 nm波长下测定辣木叶药材及标准汤剂中总黄酮、总有机酸、总芥子碱含量，精密量取10 μL和5 μL标准汤剂，分别在490、568 nm波长下测定总多糖、总α-氨基酸含量。结果显示，辣木叶药材中5个大类成分总黄酮、总有机酸、总多糖、总α-氨基酸、总芥子碱的平均质量分数分别为39.67、28.34、145.83、100.69、27.39 mg·g-1，RSD分别为8.2%、6.7%、19.4%、11.5%、7.2%，以总多糖含量最高，总α-氨基酸、总黄酮次之，总有机酸和总芥子碱最低，5个大类成分的质量分数总和为301.95~409.56 mg·g-1，辣木叶药材中可测成分超过30%，但15批药材质量存在一定的差异性。辣木叶标准汤剂中5个大类成分平均质量分数按投药量计算分别为14.55、16.89、134.39、60.98、13.64 mg·g-1，RSD分别为16.4%、11.2%、16.3%、19.2%、9.4%，以总多糖含量最高，总α-氨基酸次之，总有机酸、总黄酮、总芥子碱含量最低且三者相差不大。辣木叶煎煮过程对各成分的影响不尽一致，药材中的成分均可转移至标准汤剂中，标准汤剂中可检测成分25%。标准汤剂中总黄酮、总有机酸、总多糖、总α-氨基酸、总芥子碱的x¯±30%质量分数范围分别为10.19~18.92、11.82~21.96、94.07~174.71、42.69~79.27、9.55~17.73 mg·g-1；5大类成分的平均转移率分别为36.75%、59.68%、92.72%、60.43%、49.99%，RSD分别为13.4%、10.6%、6.5%、14.3%、10.6%；5大类成分的x¯±30%转移率范围分别为25.72%~47.77%、41.78%~77.59%、64.90%~120.54%、42.30%~78.57%、34.99%~64.99%。其中S3总α-氨基酸略高于x¯±30%上限。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T006表6辣木叶标准汤剂中大类成分质量分数及转移率Table 6Contents and transfer rates of of active parts in M. oleifera leaf standard decoctionNo.总黄酮总有机酸总多糖总α-氨基酸总芥子碱YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%YS转移率/%138.0216.8044.1730.0318.3160.98134.66132.1498.13119.8176.3063.6928.5014.3050.18238.1615.8041.4029.4418.6563.34130.84121.7493.04118.4473.5662.1027.9813.9950.00338.9515.3139.3029.9017.4358.29131.61126.1395.84126.6880.8863.8527.5513.5349.11438.1011.1429.2325.5913.3852.28143.56143.71100.1194.9441.4943.7025.4511.4845.10538.3110.4327.2427.5014.2151.67154.89142.5892.0597.2145.1146.4126.8411.5142.89639.3611.2828.6527.2114.7554.21151.87132.5787.2989.9644.6649.6526.3212.4547.30738.2714.0936.8225.9616.2962.74126.37116.0991.8691.3568.3574.8325.7514.6056.70837.3615.4241.2625.4317.5368.95124.11108.9487.78100.3765.2064.9624.0214.3259.63939.0415.2839.1326.1316.9965.04127.68110.8286.8096.7669.7172.0423.8813.5356.651037.2912.7936.4230.4115.8151.99130.99124.2894.8896.2153.8956.0130.1512.8142.481138.0713.5836.4230.2415.5151.30122.72126.79103.3190.6758.9765.0429.0912.7043.661236.7213.8736.5429.6516.9957.33118.68115.3397.1789.2957.1263.9727.6113.5148.951344.6316.7337.4829.9119.7966.15205.47163.2779.46100.0457.3557.3329.5114.8550.301446.2218.3139.6229.8718.3861.54188.45176.2393.51101.9062.4661.2928.8015.9555.361546.5017.4537.5227.8319.3269.42195.61175.1789.5596.7959.6761.6529.3415.1351.57mg·g-12.4.6　一般理化指标检测按文献［18］方法测定水分，结果显示15批辣木叶药材的含水量均14%。参照2020年版《中国药典》通则2201热浸法及《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，精密称定15批标准汤剂冻干粉各2.0 g，置100 mL锥形瓶中，加乙醇50 mL，密塞，称定质量，静置1 h后，回流加热，微沸1 h。放冷补足质量，摇匀滤过。精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于烘箱105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，称定质量，计算冻干粉及相应生药量下醇溶性浸出物平均含量为11.80%。测定标准汤剂的平均出膏率为33.0%，RSD分别为9.9%及3.3%，表明15批标准汤剂样品存在一定的差异。分别使用密度计、pH计测定0.2 g·mL-1标准汤剂溶液的比重及pH。15批标准汤剂平均比重为1.031、pH均值为5.51，RSD分别为0.2%和1.6%，说明不同批次样品的比重及pH区别较小。15批次标准汤剂比重、pH、出膏率、醇溶性浸出物均在其x¯±30%的范围内，分别为0.722~1.340、3.86~7.16、23.1%~42.9%、8.26%~15.34%，所有批次各指标均在范围内，说明该质量标准的范围设置在整体上可行。见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20231162.T007表715批辣木叶标准汤剂的其他指标测定Table 7Determination of other indexes of 15 batches of M. oleifera leaf standard decoction编号每克冻干粉相当生药量/g比重pH出膏率/%醇溶性浸出物/%S12.5641.0305.5537.111.48S22.7681.0295.5636.411.24S32.5161.0325.4937.011.98S42.3461.0335.5031.112.13S52.5081.0335.5331.511.17S62.8571.0355.4833.711.41S72.8371.0325.6036.611.41S82.7211.0295.6435.511.93S92.8451.0285.6834.311.89S102.9631.0285.4228.211.77S112.7211.0305.5029.111.76S122.6861.0305.4226.912.14S132.5941.0325.4932.212.58S142.5521.0305.4633.211.96S152.4911.0315.3432.412.113 讨论本研究基于响应面结合主成分分析法，以8个特征峰的相对峰面积及出膏率作为评价指标，优化并经验证得到辣木叶的最佳煎煮工艺。在此基础上制备15批标准汤剂，以特征图谱、多成分含量测定、大类成分含量测定，结合其出膏率、比重、pH等理化指标开展其质量评价研究。在响应面实验中，辣木叶标准汤剂影响因素的主次顺序为二煎煎煮时间二煎溶剂倍量头煎溶剂倍量头煎煎煮时间。推测二煎影响因素高于头煎的原因可能是在头煎所设的因素水平下，成分已达到最大溶出水平，药材内外的成分含量达到动态平衡。但在滤出头煎煎液后，重新加水二煎时，药材内外的成分含量受浓度差影响较大，同时，二煎是头煎的延伸，煎煮时间的延长，导致成分分解更为显著。因此，二煎影响因素较大。目前，针对煎煮工艺的研究大多表明，煎煮次数的增加能有效提高成分的溶出率，但针对二煎、三煎等煎煮工艺的研究较少，其煎煮时间及溶剂倍量多与头煎保持一致［19］。有研究发现，黄连解毒汤中小檗碱煎煮两次的溶出量为煎煮一次的226.13%，表明了二煎能有效增加小檗碱的溶出率，且溶出量高于头煎［20］。这也进一步佐证了本研究结果具备参考性，可为中药煎煮工艺的优化提供一定的借鉴。从转移率均值来看，总多糖、隐绿原酸、L-色氨酸、维采宁-2的转移率均80%，总多糖在水煎过程中转移率最高，本方法以无水葡萄糖为测定指标，推测煎煮过程可能促使多糖分解为单糖，因而总多糖转移率较高。有研究表明在酸性条件下，新绿原酸、隐绿原酸较为稳定［21］，绿原酸受热会异构化为新绿原酸和隐绿原酸［22］，而辣木叶水煎液pH呈酸性，新绿原酸和隐绿原酸较为稳定，其转移率相对较高，总有机酸的转移率与新绿原酸、隐绿原酸的转移率基本相符。总α-氨基酸平均转移率约为60.43%，可能是水煎过程导致含有结合型α-氨基酸成分被破坏分解为相应的氨基酸所致，如辣木叶中含有1-β-D-吡喃葡萄糖基-L-色氨酸（本课题组鉴定），水煎过程中促使分解生成L-色氨酸，而L-色氨酸的转移率较高证实上述结构转化过程。维采宁-2的含量最低，但平均转移率达81.40%，与该成分为双碳链苷类成分、结构较为稳定，水煎煮可促使其溶出所致［23］；而总黄酮的平均转移率仅为36.75%，判断为异槲皮素、紫云英苷等黄酮苷类成分，受热不稳定易分解，导致从药材-标准汤剂的转移率存在不同程度的降低［24］。此外，辣木叶从药材-标准汤剂的主要成分及大类成分的整体转移率分别为43.26%~80.33%、49.26%~91.48%，说明水煎能较好地保留其主要成分。综上，辣木叶标准汤剂的制备工艺稳定、重复性好；以多成分和大类成分相结合对辣木叶标准汤剂进行了较为全面质量评价研究，据此提出了建议标准符合配方颗粒的相关技术要求，可用于辣木叶标准汤剂的初步质量控制。本研究为辣木叶引入我国中医药体系提供参考，为建立基于中医临床应用的辣木叶标准汤剂的质控标准奠定基础。