皮肤作为人类外界环境的天然物理屏障，在温度调节、抵御微生物感染等环境因素方面发挥至关重要的作用［1］。然而，许多损伤，例如意外伤害、手术、烧伤或代谢功能障碍等，可导致皮肤损伤、组织丢失、结构和功能损害［2］。损伤后的伤口愈合遵循止血、炎症、增殖和重塑过程，但糖尿病、血管疾病和衰老等多种因素都会影响伤口愈合的各个阶段，导致伤口慢性不愈合［3］。慢性难愈性伤口会提高细菌入侵和感染的概率，引起败血症、多器官衰竭和死亡，并耗费大量医疗资源［4］。研究发现，炎症阶段始于受伤后数小时内，是延迟伤口愈合的最重要因素之一，过量产生的促炎细胞因子不利于伤口愈合，可导致慢性难愈性创面［5］。此外，成纤维细胞在伤口愈合的增殖阶段至关重要，在胶原沉积、肉芽组织形成和上皮化过程中发挥着主导作用，其中基质金属蛋白酶（MMP）的表达增强，会促进局部细胞外基质（ECM）降解，影响伤口中成纤维细胞的迁移［6］。目前，包括手术清创、抑菌剂、生物工程皮肤等多种治疗方法已被用于治疗慢性难愈性伤口，然而有限的疗效和众多的不良反应限制了他们的应用［2］。临床仍然非常需要能够快速闭合伤口、同时减轻炎症的新治疗方法。黄芪甲苷是黄芪的主要药理活性成分之一，具有免疫调节和代谢刺激功能，能够显著促进成纤维细胞增殖和血管生成［7］。近期YUE等［8］将黄芪甲苷应用于链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠创面治疗中，证明黄芪甲苷能够促进胶原沉积和细胞外基质相关基因的表达，并促进创面组织新生血管化和内皮细胞增殖。然而黄芪甲苷加速伤口愈合的作用机制尚有待探索。本研究旨在通过构建慢性难愈性创面大鼠模型，探究黄芪甲苷对难愈性创面愈合的影响及机制。1 材料1.1　动物60只清洁级雄性SD大鼠，8~10周龄，体质量240~260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号SCXK（京）2020-0004。置于光照/黑暗循环12 h的环境中饲养，室内温度约25 ℃，相对湿度约50%；自由饮食，适应1周后进行实验。实验动物使用经南京中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号202105A028）。1.2　药物与试剂黄芪甲苷（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号RS00161020）；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂LY294002和沉默调节蛋白1（SIRT1）抑制剂EX527（上海Aladdin生物科技有限公司，货号分别为L408398、E129892）；BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号CW0014，）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，货号G1120）；α-肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原α1（COL1A1）、免疫球蛋白（Ig）G-Alexa Fluor 488、IgG-Alexa Fluor 555、PI3K、磷酸化（p）-PI3K、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Abcam公司，货号分别为ab5694、ab7778、ab150077、ab150078、ab133595、ab207484、ab38449、ab133458、ab263962）；SIRT1和核转路因子（NF）-κB p65抗体（美国Proteintech公司，货号分别为13161-1-AP、10745-1-AP）；TRIzol试剂（美国赛默飞公司，货号15596026）；FastQuant RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq GC（北京百奥莱博科技有限公司，货号分别为TAG200、RR071A）。1.3　仪器Cytation3型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；041BR120387型电泳仪、水平和垂直电泳槽、转移槽、Chemi Doc XRS化学发光凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；160HR型高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；倒置式生物显微镜（日本Olympus公司），7300型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（美国ABI公司）。2 方法2.1　慢性难愈性创面大鼠模型构建参考徐杰男等［9］的实验方法，50只大鼠在无特定病原体（SPF）条件下适应性喂养1周后，用2.5%戊巴比妥钠麻醉。剃去背部造模区皮毛，无菌条件下，剪去直径10 mm的皮下组织至筋膜层，形成大鼠全层皮肤缺损开放性创面。之后，连续3 d肌注氢化可的松（80 mg·kg-1），制成难愈性创面模型。术前1 d起，连续4 d肌注青霉素（4 000 U/只）预防感染，记录大鼠创面愈合情况。伤口面积占比=术后第n天创面面积/初始创面面积×100%。2.2　动物分组和给药参考刘东波等［10］研究的用药剂量，将30只慢性难愈性创面大鼠随机分为模型组、黄芪甲苷低剂量（20 g·L-1）组、黄芪甲苷高剂量（100 g·L-1）组、黄芪甲苷+LY294002（PI3K抑制剂，0.5 g·L-1）组和黄芪甲苷+EX527（0.5 g·L-1）组。利用生理盐水分别配制质量浓度20、100 g·L-1的黄芪甲苷溶液、0.5 g·L-1的LY294002和0.5 g·L-1的EX527溶液备用。黄芪甲苷低剂量组和高剂量组大鼠每日伤口处均匀涂抹黄芪甲苷溶液1 mL；黄芪甲苷+LY294002组伤口涂抹黄芪甲苷溶液（100 g·L-1，1 mL）和LY294002（0.5 g·L-1，1 mL）；黄芪甲苷+EX527组伤口涂抹黄芪甲苷溶液（100 g·L-1，1 mL）和EC527（0.5 g·L-1，1 mL）；均连续给药8 d。模型组仅构建模型并给予等量生理盐水涂抹，6只正常组仅造成创面而不肌注氢化可的松。2.3　免疫荧光检测大鼠创面组织COL1A1和α-SMA表达将各组大鼠背部皮肤切片进行常规石蜡包埋，切片置于10 mmol·L-1的枸橼酸钠缓冲液中孵育15 min，修复抗原。然后将切片与兔抗α-SMA（1∶60）或兔抗COL1A1抗体（1∶60）在4 ℃孵育10 h。孵育后，切片用0.1 mol·L-1 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并与山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 488（1∶1 000）或山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 555（1∶1 000）在室温下孵育1 h。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，并在共聚焦显微镜下观察。使用Image J软件测量创面周围（460 μm×460 μm）视野下荧光强度。2.4　HE染色检测大鼠创面组织病理结构取小鼠背部创面皮肤，4 ℃下4%多聚甲醛中固定48 h，常规石蜡包埋，行5 μm切片。利用HE染色试剂盒，并按照说明书步骤，行HE染色。光镜下评估创面组织形态学变化。2.5　实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测大鼠创面组织炎症因子mRNA表达TRIzol一步法提取皮肤样本总RNA，通过分光光度计测定总RNA浓度。利用FastQuant RT试剂盒从总RNA 1 μg中提取cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq GC在7300 Real-time PCR系统中进行测定。反应条件：95 °C预变性5 min；95 °C变性15 s，60 °C退火延伸1 min（40个循环）。RNA水平使用GAPDH作为内参进行标准化，以2-ΔΔCt法计算相对表达量，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。基因引物序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列（5'-3'）长度/bpIL-1β上游TCGCTCAGGGTCACAAGAAA118下游CATCAGAGGCAAGGAGGAAAACIL-6上游ACAAGTCGGAGGCTTAATTACACAT150下游TTGCCATTGCACAACTCTTTTiNOS上游CCCGTCCACAGTATGTGAGGAT160下游CATTACCTAGAGCCGCCAGTGATNF-α上游TGAACTTCGGGGTGATCGGTC118下游AGCCTTGTCCCTTGAAGAGGACGAPDH上游AGTGGCAAAGTGGAGATT112下游GTGGAGTCATACTGGAACA注：IL-1β.白细胞介素-1β；IL-6.白细胞介素-6；iNOS.诱导型一氧化氮合酶；TNF-α.肿瘤坏死因子-α2.6　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测大鼠创面SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt通路相关蛋白表达RIPA裂解液提取各组大鼠创面组织总蛋白，并利用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。采用SDS-PAGE电泳分离蛋白40 μg，湿转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h；分别加入SIRT1抗体（1∶300）、NF-κB p65抗体（1∶300）、p-PI3K抗体（1∶200）、PI3K抗体（1∶500）、p-Akt抗体（1∶200），Akt抗体（1∶500），GAPDH（1∶10 000）。用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（1∶5 000）作为二抗，以GAPDH为内参，采用Image J软件进行定量分析。2.7　统计学分析采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD）检验。P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1　各组大鼠创面形态学比较3组大鼠术后伤口愈合情况存在时间效应，伤口面积占比随时间（第2、4、6、8天）均逐渐降低，第8天伤口面积占比最低。与正常组比较，模型组大鼠伤口面积占比显著升高（P0.01）。与模型组比较，黄芪甲苷低剂量组和高剂量组大鼠术后第8天伤口面积占比显著降低（P0.01）；且与黄芪甲苷低剂量组比较，黄芪甲苷高剂量组疗效更佳（P0.05）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T002表2黄芪甲苷对大鼠各时间点伤口面积占比的影响 （x¯±s，n=6）Table 2Effect of astragaloside on percentage of wound area at each time point in rats （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1第2天第4天第6天第8天正常组78.76±4.8265.23±6.2352.78±5.2340.23±4.21模型组84.37±3.541）73.93±3.671）57.89±2.311）50.32±2.131）黄芪甲苷低剂量组2068.76±4.872）52.34±4.762）45.31±4.132）31.34±3.452）黄芪甲苷高剂量组10060.21±2.432，3）43.34±4.322，3）37.65±4.762，3）22.76±1.762，3）注：设各组第0天伤口面积占比为100%；与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01；与黄芪甲苷低剂量组比较3）P0.05%3.2　黄芪甲苷对各组大鼠创面COL1A1和α-SMA表达的影响免疫荧光结果显示，与正常组比较，模型组COL1A1荧光强度降低而α-SMA表达显著升高（P0.01）；与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组COL1A1和α-SMA荧光强度均显著增高（P0.01），而黄芪甲苷低剂量组仅α-SMA表达显著增多（P0.01），模型组和黄芪甲苷低剂量组两间COL1A1表达差异无统计学意义。见图1、表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.F001图1黄芪甲苷对各组大鼠创面COL1A1和α-SMA表达的影响（免疫荧光，×1 000）Fig.1Effect of astragaloside on expression of COL1A1 and α-SMA in rat wounds of all groups （immunofluorescence，×1 000）注：A.正常组；B.模型组；C.黄芪甲苷低剂量组；D.黄芪甲苷高剂量组（图2、图3同）10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T003表3黄芪甲苷对各组大鼠创面COL1A1和α-SMA表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 3Effect of astragaloside on expression of COL1A1 and α-SMA in rat wounds of each group （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1COL1A1α-SMA正常组7.23±0.7619.23±2.34模型组5.02±0.651）21.87±4.671）黄芪甲苷低剂量组205.05±0.9740.45±4.782）黄芪甲苷高剂量组1008.13±0.672）45.65±5.762）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01（表4-表6同）3.3　黄芪甲苷对各组大鼠创面病理结构的影响HE染色结果显示，正常组皮肤组织完整，无炎性细胞浸润，皮肤内细胞排列整齐无间隙；模型组大鼠上皮组织破损严重，厚度增加，可见大量炎性细胞浸润；黄芪甲苷高剂量组上皮细胞数量增多，厚度降低，炎性细胞减少，胶原数量增多，细胞排列规律；黄芪甲苷低剂量组上皮组织恢复较慢，仍有炎性细胞浸润和组织间隙。见图2、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.F002图2黄芪甲苷对各组大鼠创面病理结构的影响 （HE，×400）Fig.2Effect of astragaloside on pathologic structure of rat wounds in each group （HE，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T004表4黄芪甲苷对各组大鼠上皮组织厚度的影响 （x¯±s，n=6）Table 4Effect of astragaloside on thickness of epithelial tissue in rats of all groups （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1上皮组织厚度/µm正常组0.00±0.00模型组573.76±44.651）黄芪甲苷低剂量组20367.55±32.372）黄芪甲苷高剂量组100287.46±33.672）3.4　黄芪甲苷对各组大鼠创面炎症因子mRNA表达的影响Real-time PCR结果显示，正常组大鼠创面组织TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达处于较低水平；与正常组比较，模型组大鼠创面TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达均显著升高（P0.01）；与模型组比较，黄芪甲苷低剂量组和高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达均显著降低（P0.01）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T005表5黄芪甲苷对各组大鼠创面组织TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 5Effect of astragaloside on mRNA expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and iNOS in rat traumatic tissues of each group组别质量浓度/g·L-1TNF-αIL-1βIL-6iNOS正常组1.02±0.050.99±0.021.02±0.071.01±0.12模型组26.54±3.431）73.21±8.651）39.87±5.451）10.67±0.891）黄芪甲苷低剂量组2013.76±2.982）32.43±5.762）28.76±6.492）4.21±1.022）黄芪甲苷高剂量组1005.45±1.872）17.36±4.342）12.54±5.212）3.67±1.452）x¯±s，n=63.5　黄芪甲苷对各组大鼠创面组织SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达Western blot结果显示，与正常组比较，模型组大鼠创面组织NF-κB p65、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达升高，而SIRT1表达显著降低（P0.01）；与模型组比较，黄芪甲苷低剂量组和高剂量组NF-κB p65、p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达显著降低，SIRT1显著升高（P0.01）。见表6、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T006表6黄芪甲苷对各组大鼠创面组织SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响 （x¯±s，n=6）Table 6Effect of astragaloside on expression of SIRT1/NF-κB and PI3K/Akt pathway-related proteins in rat wound tissues of each group （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1SIRT1/GAPDHNF-κB/GAPDHp-PI3K/PI3Kp-Akt/Akt正常组1.03±0.121.01±0.160.67±0.080.34±0.05模型组0.15±0.021）3.67±0.561）3.84±0.541）4.21±0.431）黄芪甲苷低剂量组200.67±0.152）2.59±0.212）2.53±0.522）2.41±0.252）黄芪甲苷高剂量组1000.83±0.212）1.24±0.322）1.68±0.722）1.65±0.322）10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.F003图3各组大鼠创面组织SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt通路相关蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of SIRT1/NF-κB and PI3K/Akt pathway-related protein expression in rat wound tissues of each group3.6　黄芪甲苷对抑制SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt信号通路疗效的影响与黄芪甲苷高剂量组比较，黄芪甲苷+LY294002处理可显著降低大鼠创面COL1A1和α-SMA表达并增加上皮组织厚度（P0.01），而两组间TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平差异无统计学意义。此外，黄芪甲苷+EX527组大鼠创面组织TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的mRNA水平较黄芪甲苷高剂量组显著升高（P0.01），而两组间COL1A1和α-SMA表达及上皮组织厚度比较差异无统计学意义。见图4、表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.F004图4抑制SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt信号通路对黄芪甲苷疗效的表达 （HE，×400）Fig.4Expression of inhibiting SIRT1/NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways on efficacy of astragaloside （HE，×400）注：A.正常组；B.模型组；C.黄芪甲苷高剂量组；D.黄芪甲苷+LY294002组；E.黄芪甲苷+EX527组10.13422/j.cnki.syfjx.20240116.T007表7抑制SIRT1/NF-κB和PI3K/Akt信号通路对黄芪甲苷疗效的影响 （x¯±s，n=6）Table 7Effect of inhibiting SIRT1/NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways on efficacy of astragaloside （x¯±s，n=6）组别质量浓度/g·L-1COL1A1荧光强度α-SMA荧光强度上皮组织厚度/µmTNF-α正常组7.34±0.9728.78±5.3401.07±0.12模型组4.12±1.031）26.32±3.371）734.57±46.781）29.76±3.781）黄芪甲苷高剂量组1009.34±1.672）49.76±3.762）368.97±32.342）9.76±3.342）黄芪甲苷+LY294002组100+0.55.78±0.893）30.34±2.353）754.98±42.313）7.35±2.76黄芪甲苷+EX527组100+0.57.65±1.4338.45±5.87432.45±37.8624.34±4.573）组别质量浓度/g·L-1IL-1βIL-6iNOS正常组1.03±0.080.99±0.141.05±0.18模型组86.78±9.871）38.98±3.651）11.87±2.111）黄芪甲苷高剂量组10017.35±5.762）6.76±1.762）2.34±0.872）黄芪甲苷+LY294002组100+0.519.34±4.8710.34±3.463.67±1.03黄芪甲苷+EX527组100+0.568.54±11.763）36.89±6.313）10.76±2.873）注：与正常组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01；与黄芪甲苷高剂量组比较3）P0.014 讨论慢性难愈性创面是指在4周内无法有序修复达到结构和功能完整状态的病理性伤口。该病病因复杂、临床治疗困难，给患者和医疗系统均造成了严重的社会和经济负担。随着其发病率的不断上升，有效治疗慢性难愈性创面的创新方法越来越受到关注［11］。目前临床上常用的多种抗感染药物、敷料、凝胶和促进愈合生长因子制剂等治疗手段的效果并不令人满意［12］。因此，寻找并开发促进慢性难愈性创面患者受损皮肤愈合的药物成为当前研究的热点。近年来大量文献指出，中医药在治疗难愈性创面的研究中具有良好的效果，且价廉效优，值得探索和应用［4］。黄芪作为临床治疗皮肤溃疡的主要中药材，在传统中医学中已有数百年的应用历史。据报道，含有黄芪的中药方能够显著抑制成纤维细胞增殖和血管生成，并具有明显的抗炎活性［13-14］。黄芪含有多种生物活性成分，其中促进伤口愈合的主要药理成分是皂苷，具有免疫调节功能，能够刺激细胞新陈代谢［15］。黄芪甲苷是黄芪的主要水提取物，具有降低血糖、促进成纤维细胞增殖和细胞生长因子表达等药理作用［16］，可用于难愈性创面的治疗。LUO等［17］将黄芪甲苷Ⅳ应用于链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠伤口治疗，结果表明黄芪甲苷能够促进胶原沉积和ECM相关基因的表达，并能促进伤口组织新生血管和内皮细胞增殖。但黄芪甲苷对慢性难愈性伤口的作用尚无报道。本研究基于激素诱导的慢性难愈性创面模型大鼠，进行黄芪甲苷溶液涂抹，结果显示，不同剂量的黄芪甲苷均可明显减小各时间点的伤口面积，且伴有上皮细胞数量增多和胶原增多，其中高剂量黄芪甲苷效果最为明显，提示黄芪甲苷可有效加速慢性难愈性创面伤口愈合，但具体作用机制仍有待于进一步探索。伤口愈合是一个动态而复杂的过程，需要经历止血、炎症、增殖和组织重塑及疤痕形成4个典型阶段［18］。组织损伤导致的急性炎症反应是损伤修复的首要阶段，通过分泌多种与伤口愈合相关的细胞因子，并激活常驻和浸润的免疫细胞（包括单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等），以清除微生物和坏死组织恢复组织平衡［19］。TNF-α和IL-1β等介导的过度炎症反应可损伤血管内皮细胞，导致创面愈合延迟，阻断或沉默TNF-α和IL-1β可抑制巨噬细胞浸润并诱导其分化为与愈合相关的表型［20］。笔者的研究显示，黄芪甲苷低剂量组和高剂量组大鼠创面组织TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的mRNA表达水平明显降低，且高剂量黄芪加高效果更佳。研究显示，伤口愈合过程中SIRT1的异常表达破坏了其下游NF-κB信号通路，进一步导致炎症调节失调。壳聚糖/海藻酸钠/鹿茸血肽水凝胶或新型小檗碱纳米胶体外用均可通过抑制SIRT1/NF-κB通路，改善创面炎症反应，促进创面愈合［21］。与以上结果类似，笔者的数据中发现，黄芪甲苷处理，尤其是高剂量组黄芪甲苷，可上调创面组织SIRT1表达并下调NF-κB蛋白水平。提示黄芪甲苷通过调控SIRT1/NF-κB通路发挥有效的创面促愈合作用。伤口愈合受多种警报信号肽刺激的复杂信号通路网络调控［22］。Akt家族是参与表皮屏障形成的蛋白激酶互联网络中心［23］。在健康皮肤中，PI3K/Akt通路控制多个细胞过程并维持表皮的平衡，在细胞凋亡、存活、增殖及组织创面修复过程中发挥关键生物学作用，其调控失调可导致多种病例状况。PI3K/Akt信号通路过度表达可能会导致皮肤癌、银屑病和特应性皮炎等皮肤疾病的增殖失控，而此通路活性不足则能引起严重的表皮缺陷，包括破坏角质细胞的完整性和延迟伤口愈合［24］。有研究发现，活化的PI3K/Akt信号通路能够发挥抑制细胞凋亡，促进细胞存活的功能，加速压疮小鼠模型创面恢复［25］。HUANG等［26］的近期研究显示，Zyxin蛋白可通过整合素激活PI3K/Akt通路促进皮肤纤维化。本研究显示，黄芪甲苷能有效升高创面COL1A1和α-SMA表达，促进伤口愈合。同时能够升高p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt水平，提示黄芪甲苷的促伤口纤维化作用可能与PI3K/Akt信号通路相关。综上所述，笔者的结果表明黄芪甲苷可能通过激活PI3K/Akt通路和SIRT1/NF-κB通路促进创面愈合，黄芪甲苷是一种有前景的治疗慢性伤口愈合的药物。