缺血性脑卒中是一种由多种病理因素造成脑血管栓塞，进而因脑组织局部供血不足，造成脑组织坏死而引发的脑部疾病。目前，在全球范围内，脑卒中仍然是人类疾病导致死亡的第二大原因，其中缺血性脑卒中占脑卒中总数的65%以上［1-2］。缺血性脑卒中的病理机制较为复杂，目前研究认为神经炎症、兴奋毒性、氧化损伤、离子失衡、细胞凋亡、血管生成和神经保护等与缺血性脑卒中的病理机制均有关，其中神经炎性反应在缺血性脑卒中致病过程中尤为重要［3-4］。正常生理状况下，脑组织促炎症反应与抗炎症反应之间存在相对平衡，缺血性脑卒中发生后，平衡被打破，免疫激活继发的炎症级联反应造成神经血管单元（NVU）耦合功能障碍，血脑屏障破坏，促进炎性因子在脑缺血区域聚集，造成神经元死亡增加，进而导致梗死区增大和神经功能缺损加重［5-7］。肠道菌群具有调节宿主的免疫功能，改善肠屏障功能等作用，对人体生理功能和健康状态产生均具有较大影响［8-9］。最新研究表明肠道菌群与脑之间存在一条双向调节的信号通路，被称为微生物-肠-脑轴［10］。研究表明，缺血性脑卒中引起的菌群失调能够通过增强炎症反应加重脑卒中，而恢复肠道微生态的稳态能够改善机体炎性环境，对缺血性脑卒中产生积极的影响［11-13］。临床试验显示，通过改变肠道的优势菌群，提高菌群多样性和丰度可以调节脑卒中后炎症因子水平，有效改善缺血性脑卒中患者状态［14］。因此以肠道菌群作为药物靶点，可能会成为缺血性脑卒中治疗药物开发的新方向。作为CD4+T细胞主要成员，分泌促炎因子的辅助性T细胞17（Th17）与分泌抑炎因子的调节性T细胞（Treg）对于全身炎症的调节至关重要，而位于肠道固有层的Th17和Treg细胞更可以直接应对脑肠屏障的破坏发生的免疫应答，对于疾病的发展与恢复发挥重要调控作用［15-17］。此外，在缺血性脑卒中，白细胞介素（IL）-17A可以通过与血管内皮细胞作用产生活性氧，下调和重组紧密连接分子，进一步加重神经组织损伤及功能紊乱［18-19］。循环和局部的IL-6均可诱导血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、巨噬细胞集落刺激因子的产生［20-22］。IL-10可以通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和信号传导和转录激活因子3（STAT3）激活降低促炎细胞因子实现对脑卒中的保护作用［23-24］。益气解毒方由人参、黄连、栀子组成，基于“毒损脑络”病机，采用辨证施治、扶正祛邪治疗中医脑病的经验方［25］。本文中所用益气解毒方是在人参、黄连和栀子3味中药组成的治疗脑病的中药临床经验方剂基础上，由人参总皂苷、黄连素和栀子苷按照一定比例重新组合而成的中药配伍新药。本课题组前期研究已经证实该方中三者配伍作用较好，在动物水平上可显著改善局灶性脑缺血中脑动脉栓塞（MCAO）大鼠脑梗死体积，有效恢复脑缺血后减少的局部脑血流灌注量，对缺血性脑卒中具有直接显著的神经保护作用，其作用机制与线粒体保护和抑制胱天蛋白酶（Caspase）依赖的线粒体细胞死亡途径有关［26］。已有研究发现口服人参皂苷、黄连素对肠道菌群具有调控作用，而该调控作用与抑制促炎因子诱导的炎症反应有关［27］。故推测该方是否可能通过调节缺血性脑卒中后失调的肠道菌群，从而抑制机体炎症级联反应达到减轻脑损伤的作用。因此，本文拟从益气解毒方干预缺血性脑卒中急性期MCAO大鼠肠道菌群的改变角度开展研究，并对其可否通过微生物-肠-脑轴发挥保护作用及其相关机制进行了探讨。1 材料1.1　动物雄性Sprague-Dawley大鼠体质量（240±10） g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（北京）2021-0011。所有大鼠均单独饲养在22~24 ℃，相对湿度40%~60%，明暗交替12 h/12 h。动物可自由获取食物和水。实验程序由中国中医科学院中药研究所动物福利伦理委员会批准。所有动物实验均按照机构指南和伦理进行（伦理审批号2021B184）。1.2　仪器JT-12S型组织脱水机、JB-L5型组织包埋机、JJQ-P3016型组织病理切片机（武汉俊杰电子有限公司），Jk-7型生物组织铺展烘焙机（金华科迪仪器设备有限公司），TBA-120FR型全自动生化分析仪（日本东芝三光医疗公司），Nanodrop2000型超微量分光光度计、Sorvall Legend Micro 21R型高速冷冻离心机（美国Thermo公司），9700型聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ABI公司），MT-30K型电动匀浆仪（杭州米欧仪器有限公司），Quantus™型荧光计（美国Promega公司）。1.3　药物与试剂人参总皂苷（Rg1+Re+Rd+Rb2+Rb1+Rb3+F1+F2+Rc+Rg3纯度82%，京泽朗医药科技有限公司，批号ZLSC2021061911）；黄连素、栀子苷（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为J25GS155970、S17O11Y127293，纯度分别为95%、98%）；二甲苯、中性胶（国药集团化学试剂有限公司，货号分别为10023418、10004160）；曙红染色液（珠海贝索生物科技有限公司，货号Ba4022）；苏木素染色液（武汉塞维利亚生物技术有限公司，货号G1004）；闭塞素抗体、紧密连接蛋白（Occludin）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）山羊抗鼠二抗（武汉三鹰生物科技有限公司，批号分别为66378-1-lg、66378-1-lg、SA00001-1）；闭锁小带蛋白-1（ZO-1）抗体（美国Thermo公司，批号14-9776-95）；HRP山羊抗鼠二抗（北京中山金桥生物科技有限公司，货号ZB2307）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司，货号分别为P0013E、P0012）；IL-6、IL-17A、IL-10大鼠酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（江苏酶免疫实业有限公司，货号分别为MM-0190R1、MM-0195R1、MM-70049R1）；DNA抽提试剂盒（杭州西顿生物科技有限公司，货号D3396-01）；Axygen试剂盒AP-GX-500（上海金畔生物科技有限公司，批号AP-GX-500）；DNA快速建库试剂盒（杭州沃森生物技术有限公司，批号NOVA-5144-08）。2 方法2.1　动物分组和给药［26］将42只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、益气解毒方低、中、高剂量组（给药剂量前期课题组研究基础，剂量分别为1、5、25 mg·kg-1），除假手术组外每组设置9只。由于研究复制MCAO模型属于急性炎症模型，在短时间内即可诱发炎症反应，为探究药物对MCAO大鼠急性期炎症反应抑制程度，给药组在造模前15 min按照0.008 mL·g-1灌胃给予生理盐水溶解的不同剂量的益气解毒方，其他组给予对应体积的生理盐水，造模完成后按神经行为学评分各组筛选6只大鼠入组，术后每天上午10点给药，造模72 h后处死各组大鼠，取材。2.2　大鼠MCAO模型建立大鼠称重后进行麻醉，将其仰卧位固定于鼠板上，使用线栓法进行造模，以行为学得分1~3分，体质量显著降低，炎症因子IL-6，IL-17A显著上升，IL-10显著降低者认为模型制备成功［28］。手术过程中及术后维持大鼠体温，并及时给予水分、能量补充。观察记录大鼠体质量变化，进行神经功能评分。2.3　神经行为学评分术后神经功能采用Longa五分评分法［28］：0分表示无神经功能缺损，1分（未能完全伸展左前爪）表示轻度局灶性神经功能损伤；2分（向左旋转）表示中度局灶性神经学损伤，3分（向左下降）表示严重局灶性损伤；4分为不能自发行走，意识水平低下。1分以上即为模型制备成功，可以随机入组。每组选择6只大鼠进行实验，每日给药前对大鼠进行称重。2.4　肠道微生物群分析根据DNA抽提试剂盒说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度；使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16S rDNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增，扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。PCR反应体系：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O补足至20 μL。每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™荧光计对回收产物进行检测定量。使用DNA快速建库试剂盒进行建库：①接头链接；②使用磁珠筛选去除接头自连片段；③利用PCR扩增进行文库模板的富集；④磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。2.5　ELISA检测IL-6、IL-10、IL-17A含量采用ELISA试剂盒检测血清中的炎症因子IL-6、IL-10、IL-17A含量，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度。2.6　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠和脑Occludin和ZO-1蛋白表达取出结肠和脑组织，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，裂解组织，于冰上操作。裂解后，4 ℃，12 000 r·min-1，离心10 min（离心半径8 cm），BCA法检测组织上清液中蛋白浓度。加样，经凝胶电泳（根据相对分子质量的大小选择合适的分离胶浓度）进行蛋白分离，转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗ZO-1（1∶1 000）、Occludin（1∶5 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入对应二抗（1∶1 000），室温摇床孵育1 h，然后用ECL发光法显影，采用Image J软件计算条带灰度值。2.7　结肠与脑组织的HE染色统一取结肠和脑皮层缺血半暗带区组织于固定液中常温保存，然后对其进行脱水、包埋、切片、染色处理。2.8　统计学和生物信息学分析采用SPSS 23.0统计软件进行分析，数据以x¯±s表示，组间差异分析采用单因素方差分析；细菌门及属水平的组间差异分析采取克氏秩和检验，并对检验结果进行错误发现率校正。结果P0.05表示为差异有统计学意义。16S rDNA序列数据使用fastp［29］（https：//github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH［30］（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）软件进行拼接；用UPARSE［31］软件（http：//drive5.com/uparse/，version 7.1），根据97%的相似度对序列行操作分类单元（OTU）聚类并剔除嵌合体［31-32］。利用RDP classifier［33］（http：//rdp.cme.msu.edu/，version 2.2）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rDNA数据库（version 138），设置比对阈值为70%。α多样性通常可以反映肠道菌群的结构，包括其多样性与丰富度的相关指标［34］：Shannon和Simpson指数可以反映群落的多样性，Sobs、Chao和Ace指数可以反映群落的多样性。β多样性分析可以通过对不同肠道菌群群落间的物种多样性进行组间比较分析，探索各组样本间群落组成的相似性或差异性［32，35］。本研究采用样本层级聚类分析、主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）多种分析方法比较异同。线性判别分析效应大小（LEfSe）分析一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的方法，采用非参数Kruskal-Wallis sum-rank test检测不同组间的物种丰度差异，获得显著差异物种；再使用Wilcoxon rank-sum test检验上一步的差异物种在不同组间子分组中的差异一致性，最后运用线性判别分析（LDA）估计这些差异物种对组间区别的影响大小。区分特征的对数LDA评分阈值为3.0。3 结果3.1　益气解毒方对大鼠神经功能的保护作用采用线栓法进行MCAO造模后，模型组大鼠表现出明显的神经行为学障碍，提尾时前肢内收、萎靡不振、站立不稳者偏多，且大多不能自由取食，导致术后72 h内体质量明显下降，评分多为2~3分，说明MCAO模型建立成功。给药72 h后观察，大鼠神经行为学评分明显降低，体质量有所上升且具备较好的量效关系，与实验室前期的研究结果相一致［36］。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.T001表1各组大鼠的术后日均体质量变化和72 h后的Zea-Longa's评分 （x¯±s，n=6）Table 1Postoperative daily weight changes and Zea-Longa's score 72 h after surgery in each group of rats （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1术后日均体质量变化/gZea-Longa's评分/分假手术组4.00±2.831）0.00±0.00模型组-21.82±2.771.84±0.45益气解毒方低剂量组1-20.87±0.841.61±0.55益气解毒方中剂量组5-17.25±2.771.23±0.45益气解毒方高剂量组25-13.61±3.442）0.84±0.452）注：与假手术比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.01（表2、表4-表5同）3.2　益气解毒方对肠道微生物群的α多样性的影响首先通过Sobs、Shannon、Ace、Chao 4种α多样性指数对各组样本的菌群的丰富度和均匀度进行初步对比，采用两两对照的组间差异性检验。与假手术组比较，模型组MCAO大鼠的Sobs指数、Shannon指数、Ace指数、Chao指数均明显下降（P0.05，P0.01），说明模型组大鼠的肠道菌群的丰富度与均匀度均出现明显下降；与模型组肠道菌群比较，益气解毒方各指数均有所上升，其中低剂量组肠道菌群的Sobs指数、Ace指数、Chao指数均得到显著上升（P0.01）、中剂量组肠道菌群的Chao指数得到明显上升（P0.05）、高剂量组的Shannon指数得到明显上升（P0.05），说明经过益气解毒方给药后MCAO大鼠肠道菌群的多样性得到部分恢复。见增强出版附加材料。3.3　益气解毒方影响肠道微生物群的β多样性利用β多样性矩阵热图、PCoA、NMDS进一步分析5组大鼠结肠菌群样本结构上的差异。常规情况，两组样本间的差异越大，在用以上各指标进行分析时越能区分，反之则说明两组样本结构相似。假手术组与MCAO模型组的肠道菌群的权重unifrac距离值分布在0.2~0.6，这表明由于缺血性脑卒中的发生，使得该两组样本肠道菌群的β多样性和组成发生显著改变；假手术组与MCAO模型组在PCoA分析中可以在PC2的水平上区分开来，在NMDS分析中也可在NMDS2的方向上将两组进行区分。而在PCoA分析中，益气解毒方高剂量组在PC2的水平上可以与模型组明显区分，并且接近假手术组，中剂量组也显示出回调趋势。见增强出版附加材料。3.4　益气解毒方通过富集有益的内源性细菌重塑了肠道微生物群3.4.1　物种组成分析OTU序列的聚类分析发现，假手术组、MCAO模型组及益气解毒方各组样本检测到的肠道菌群分别归属于12个菌门（Phylum）、18个菌纲（Class）、42个菌目（Order）、73个菌科（Family）、173个菌属（Genus）。由门水平上来看，12个菌门中主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）5个主体菌门组成，除益气解毒方高剂量组外，其余各组5种菌门均占据主要菌门组成的99%以上；在这5种菌门之中，又以厚壁菌门为其中最优势菌种，在各组别中均占据50%以上；但是各组的第二优势菌门稍有不同，模型组的第二优势菌门为变形菌门，其他各组的第二优势菌门均为拟杆菌门，并且单因素方差分析结果也显示MCAO大鼠体内的变形菌门丰度显著上升（P0.01），给予益气解毒方后，低剂量组和中剂量组变形菌门丰度明显下降（P0.05）。厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F/B）可能与多种疾病存在关联关系［37］，模型组大鼠的F/B有所上升，在给药后这一趋势得到逆转，见表2。属水平上分析，各组肠道菌群主要分布在32个属中。其中，假手术组的优势属种分别为埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）、布劳特氏菌属（Blautia）、Lachnoclostridium、拟杆菌属（Bacteroides）、肠球菌属（Enterococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus），这些菌属的占比均在5%以上。在模型组中，占比超过5%的优势菌属仅埃希氏-志贺氏菌属、布劳特氏菌属和Lachnoclostridium 3种，其中埃希氏-志贺氏菌属的占比达到30.24%，显著高于假手术组中7.05%的占比（P0.01）。在益气解毒方的给药组中，中高剂量组的埃希氏-志贺氏菌属占比均为7.98%，中剂量组该菌属丰度变化与模型组比较，差异具有统计学意义（P0.05），提示埃希氏-志贺氏菌属有可能是益气解毒方发挥作用的靶标菌属。各给药组中占比超过5%的优势菌属还有罗姆布茨菌属（Romboutsia）、Parabacteroides、UCG-005、norank_f__Muribaculaceae、Marvinbryantia、unclassified _f__Lachnospiraceae，这些未曾在假手术组中占比达到5%的菌属可能与该方作用相关。占比小于1%的菌属中，差异有统计学意义的菌属有安德克氏菌属（Adlercreutzia）、摩根氏菌属（Morganella）2个（P0.05）。见增强出版附加材料。10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.T002表2各组肠道菌群的F/B和各组肠道菌群的变形菌门比例 （x¯±s，n=6）Table 2F/B ratio of gut microbiota in each group and Proteobacteria ratio of gut microbiota in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1F/BProteobacteria/%假手术组8.43±6.431）8.44±7.361）模型组17.64±12.3731.22±10.14益气解毒方低剂量组14.57±2.142）11.85±8.46益气解毒方中剂量组53.91±1.552）7.12±11.782）益气解毒方高剂量组253.05±0.972）14.94±6.323.4.2　物种差异分析通过假手术组、MCAO模型组及益气解毒方低、中、高剂量组细菌属水平上分析可以发现，模型组中的致病菌或者条件致病菌相对较多，如埃希氏-志贺氏菌属、安德克氏菌属、unclassified_k_norank_d_Bacteria、Eubacterium brachy group和摩根氏菌属，而在MCAO大鼠给予益气解毒方后，高、中剂量组中多为有益菌属，如norank_f_norank_o_Gastranaerophilales、Colidextribacter、Paludicola、肠球菌属、Lachnospiraceae_NK4A136_group、乳杆菌属、Monoglobus、Eubacterium siraeum group等。说明即便是在缺血性脑卒中发生后72 h内，机体内肠道菌群结构已经发生明显变化，有害菌与机会致病菌成为优势菌，而益气解毒方给药后，肠道内转变为有益菌群占据优势，提示该方可能重塑了失调的肠道菌群。见增强出版附加材料。3.4.3　益气解毒方对MCAO大鼠血脑屏障和肠道屏障的影响Western blot结果显示血脑屏障紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在MCAO大鼠脑皮层中表达显著降低（P0.01），提示缺血性脑卒中发生后血脑屏障通透性增加，见表3。HE染色结果显示，模型组大鼠脑皮层细胞间的紧密连接破坏，残存的神经元细胞核发生固缩，脑微血管内皮细胞出现炎性浸润、嵌塞，提示血脑屏障出现破坏，见图1。而在给予大鼠中、高剂量的益气解毒方后，脑组织病变有所改善，大鼠脑组织的ZO-1和Occludin蛋白表达量明显增加（P0.05），提示益气解毒方可能改善了MCAO大鼠血脑屏障的通透性增加。见图2。10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.T003表3各组大鼠大脑ZO-1和Occludin的表达水平 （x¯±s，n=6）Table 3Expression levels of ZO-1 and Occludin in brains of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1ZO-1/β-actinOccludin/β-actin假手术组0.41±0.111）2.44±0.211）模型组0.06±0.040.47±0.03益气解毒方低剂量组10.17±0.090.62±0.02益气解毒方中剂量组50.19±0.072）1.34±0.322）益气解毒方高剂量组250.18±0.082）2.27±0.532）注：与假手术比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.0510.13422/j.cnki.syfjx.20231817.F001图1各组大鼠脑组织病理形态比较 （HE，×200）Fig.1Comparison of pathological morphology of brain tissue in each group of rats （HE，×200）注：A.假手术组；B.模型组；C.益气解毒方中剂量组（图3同）10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.F002图2各组大鼠大脑ZO-1和Occludin的蛋白表达电泳Fig.2Protein expression electrophoresis of ZO-1 and Occludin in brains of rats in each group注：A.假手术组；B.模型组；C-E.益气解毒方低、中、高剂量组（图4同）肠道环境中生存着的大量微生物对于维持肠道屏障和肠道免疫平衡具有重要作用，而MCAO大鼠由于脑缺血引发炎症级联反应，炎症因子的过量表达，导致肠黏膜的通透性发生改变［38］。MCAO术后72 h，结肠组织的通透性发生明显变化，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的表达显著降低（P0.01），见表4。病理结果显示结肠腺体损伤，部分肠壁破损，腺体增生且排列杂乱，见图3。给予益气解毒方后，大鼠结肠组织紧密连接蛋白表达量则显著增加（P0.01）。病理结果可以看出结肠腺体损伤得到缓解，肠壁破损情况明显减轻，表明益气解毒方可能缓解了MCAO大鼠结肠黏膜的通透性增加。见图4。10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.T004表4各组大鼠结肠ZO-1和Occludin的表达水平 （x¯±s，n=6）Table 4Expression levels of ZO-1 and Occludin in colon of rats in each group （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1ZO-1/β-actinOccludin/β-actin假手术组0.77±0.111）0.39±0.091）模型组0.18±0.030.17±0.04益气解毒方低剂量组10.27±0.120.19±0.07益气解毒方中剂量组50.56±0.072）0.43±0.052）益气解毒方高剂量组250.58±0.042）0.74±0.132）10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.F003图3各组大鼠结肠组织病理形态比较 （HE，×200）Fig.3Comparison of pathological morphology of colon tissue in rats of different groups （HE，×200）10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.F004图4各组大鼠结肠ZO-1和Occludin的蛋白表达电泳Fig.4Protein expression electrophoresis of ZO-1 and Occludin in colon of rats in each group3.4.4　益气解毒方对MCAO大鼠血清中炎症因子的抑制作用与假手术组比较，模型组大鼠血清中的炎症因子IL-6与IL-17A的水平显著上升，抑炎因子IL-10水平显著降低（P0.01），见表5。说明在缺血性脑卒中发生后，大鼠出现了全身的炎症反应。而益气解毒方各给药组相较于模型组，血清中IL-6与IL-17A显著降低，IL-10的水平显著升高（P0.01），提示益气解毒方对缺血性脑卒中发生后全身炎症反应具有一定抑制作用。10.13422/j.cnki.syfjx.20231817.T005表5给药后对各组大鼠的炎症因子IL-6、IL-17A与抑炎因子IL-10的影响 （x¯±s，n=6）Table 5Effect of administration on inflammatory factors IL-6， IL-17A， and anti-inflammatory factor IL-10 in each group of rats（x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1IL-6IL-17AIL-10假手术组106.96±4.9614.30±0.3026.77±0.47模型组131.41±7.391）18.20±1.501）16.76±1.911）益气解毒方低剂量组1120.62±3.702）16.84±0.4221.16±0.772）益气解毒方中剂量组5116.41±4.032）16.10±0.952）23.02±0.622）益气解毒方高剂量组25113.92±4.142）15.33±0.712）24.92±0.932）ng·L-14 讨论本研究探讨了益气解毒方治疗缺血性脑卒中的可能机制，首先采用16S rDNA测序方式对假手术组，模型组和益气解毒方给药组的肠道菌群进行测序，尝试挖掘出给药前后发生显著变化的关键菌群；对关键菌群进行生物信息学分析，然后通过HE染色和蛋白质免疫印迹考察了MCAO大鼠血脑屏障与肠黏膜通透性的改变，最后通过检测了血清中炎症因子IL-6、IL-17A，抑炎因子IL-10水平，对益气解毒方调节肠道菌群，通过微生物-脑-肠轴干预全身炎症反应，发挥免疫炎症调节作用进行评价。肠黏膜屏障包括机械屏障、生物屏障、免疫屏障、化学屏障，其中机械屏障是肠黏膜屏障的重要组成。机械屏障由肠上皮细胞及其称为“紧密连接”（TJ）的特定结构组成，控制离子、分子和细胞通过细胞旁空间［39-43］。其中Claudins、Occludin和JAMs作为TJ上主要整合膜蛋白［44］，Occludin是一种跨膜紧连接蛋白，在TJ组装和上皮屏障功能调节中起重要作用［45］。TJ相关膜蛋白通过与支架蛋白ZO家族相互作用充当TJ和肌动蛋白细胞骨架之间的链接，因此ZO-1在TJ形成中同样起着关键作用［44］。通过调节跨上皮通透性，不断重塑的紧密连接对于维持肠道屏障功能，防止小分子和细菌扩散到宿主全身循环至关重要［46］。Western blot结果可以看出，在MCAO大鼠中，作为骨架蛋白的ZO-1与参与细胞间连接的Occludin这两种紧密连接蛋白的表达量显著下降，表明MCAO造模后3 d内，大鼠的血脑屏障可能出现破坏；进一步探究结肠组织的两种相关的紧密连接蛋白的表达时发现了相似的趋势，表明在脑组织缺血后，肠道屏障与血脑屏障类似，也遭到了一定程度的破坏。通过病理切片HE染色发现，MCAO大鼠脑组织出现了明显的损伤：其皮质缺血区部分结构疏松，大量炎症细胞浸润；而结肠组织的HE染色可以观察到结肠腺体损伤，部分肠壁破损，进一步验证了脑缺血发生后，MCAO大鼠的血脑屏障与肠道屏障的破坏。而大鼠给予益气解毒方后，血脑屏障与肠黏膜病理状态改善，紧密连接蛋白的表达增加，表明益气解毒方对血脑屏障与肠道屏障的保护作用。通过对各组样品属水平肠道菌群差异分析，发现多个差异变化明显的菌属［47-50］。第一是摩根氏菌属，该菌属在相关报道中常与感染性疾病联系起来，是一种临床上导致多种并发症的机会致病菌［50］，有研究发现摩根氏菌属在模型小鼠中与腹泻指数呈正相关［51］，在本研究中同样发现该菌属在MCAO模型组大鼠体内显著升高，分析摩根氏菌属可能是导致MCAO大鼠肠黏膜破坏与机体炎症反应的致病菌属之一，而给予大鼠益气解毒方后，该菌属的丰度显著下降，考虑缓解由于微生物失衡所引起的肠道屏障的破坏可能与该菌属变化有关。第二是埃希氏-志贺氏菌属，有报道该菌属与肠道炎症及全身性的炎症反应密切相关，有研究发现在炎症性肠病中存在该菌属过度生长的情况，抑制该菌群的过度生长可发挥一定治疗作用，此外，在阿尔兹海默症、自闭症等神经系统疾病研究中也存在与此菌属相关联的报道［52-54］。因此埃希氏-志贺氏菌属极有可能也是导致MCAO大鼠肠道屏障破坏的致病菌之一，是造成全身性炎症反应从而恶化缺血性脑卒中后果的主要菌群，益气解毒方亦可降低此菌属丰度。第三是Adlercreutzia，有报道在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征合并脑梗死的患者中，炎症因子水平增加伴随着该菌群丰度的提高［55］，而益气解毒方同样可以降低该菌属的丰度。再进一步通过LDA评分表进行各组生物标志物菌属的筛选时发现，益气解毒方对MCAO模型组大鼠体内的有害菌属丰度与整体菌群多样性的调节，对失调的肠道菌群具有一定的改善作用。肠道中存在的致病类菌群可以产生内毒素引起炎症反应，导致免疫细胞大量进入脑内，加重的炎症反应使得大脑损伤更加恶化［10，56］，即在血脑屏障被破坏的情况下，肠道菌群引发的全身炎症导致继发性神经元损伤［57-58］。通过ELISA检测各组大鼠血清中的IL-17A、IL-6、IL-10的水平，结果发现MCAO大鼠血清中的促炎因子IL-17A与IL-6的水平显著上升，而IL-10的水平显著下降，而相较于模型组，益气解毒方中、高剂量组大鼠的血清促炎因子表达均明显下降，抑炎因子明显上调。本研究中对于血清中细胞因子检测提示缺血性脑卒中发生后，Th17/Treg平衡发生了破坏，大鼠体内出现了全身性炎症反应，而这种全身性的炎症反应有可能由微生物及其代谢产物透过肠黏膜屏障或激活肠黏膜免疫细胞导致的，而益气解毒方可以有效降低全身性炎症反应。结合肠屏障紧密连接蛋白表达及病理结果，提示益气解毒方可能通过恢复肠道免疫平衡，间接调节炎症相关通路，发挥脑、肠屏障保护和脑、肠组织修复作用。综上所述，缺血性脑卒中导致血脑屏障的破坏与神经炎症反应，同时引起肠道菌群的微生态失调，破坏肠道屏障，增加了肠道黏膜的通透性，激活全身免疫炎症级联反应，并通过微生物-肠-脑轴相关炎症通路，加剧脑内炎症反应和血脑屏障的破坏，进一步加重脑损伤。本研究通过对假手术组、MCAO模型组及益气解毒方不同剂量组大鼠肠道菌群变化、脑肠屏障及外周炎症因子等多指标的检测，证明益气解毒方可以通过调节大脑缺血后引起的肠道菌群失调、改善肠道-血脑屏障的破坏和抑制全身炎症反应即通过微生物-脑-肠轴这一间接途径发挥抗缺血性脑卒中保护作用的新机制。