疟疾是一个全球健康问题，预计2023年将有2.47亿病例和14.8万人死亡，大部分疟疾病例分布在非洲（2.34亿例，95%），其次是东南亚（0.05亿例，2%）［1］。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是毒性最强的病原体，约占疟疾病例的98%，已对许多抗疟药物产生耐药性。东南亚地区相继出现了对氯喹（1950年代）、磺胺多辛乙胺嘧啶（1960年代）和甲氟喹（1980年代）等抗药性疟原虫，并在该地区迅速传播，最终出现在撒哈拉以南非洲［2］。令人鼓舞的是，在过去20年中，疟疾负担已大幅减少，部分原因是基于青蒿素的联合疗法（ACTs）作为单纯性疟疾的一线治疗方法在全球疟疾流行国家的使用［3］。青蒿素是黄花蒿中的倍半萜内酯类天然产物，青蒿素及青蒿素类化合物对疟原虫各生长时期均有很强的抑制作用。具有起效快、不良反应低的优势，是目前全球抗疟的一线治疗药物。2008年，柬埔寨首次提出“青蒿素耐药性”的说法，当时青蒿琥酯单药治疗疟疾7 d后恶性疟原虫清除时间延长超过3 d，并且一些疟疾患者在第28天随访时仍有疟原虫存在，尽管此时大多数患者已痊愈［4］。世界卫生组织（WHO）将临床青蒿素耐药性定义为“采用基于青蒿素的单一疗法或基于青蒿素的联合疗法治疗后疟原虫清除时间延迟”［5］。但药理学中抗菌药物的耐药性通常被理解为细菌、病毒、病原体等逃避或降低治疗药物的杀伤力，并继续在宿主中生存和繁殖。所以WHO对“青蒿素耐药”的定义也被称为“青蒿素部分耐药”，当10%或更多的疟疾患者在第3天出现疟疾血症或疟原虫清除半衰期超过5 h就怀疑这种情况。疟原虫清除时间延长的病例目前主要集中在占全球2%疟疾病例的东南亚地区，虽然青蒿素类药物仍然是全球一线抗疟治疗药物，但为避免这一现象蔓延至占全球95%疟疾病例的非洲地区，疟原虫清除时间延长的本质内涵是亟待明确的科学问题。红细胞膜的柔韧性会影响红细胞的变形能力，有时又将红细胞的变形性称为红细胞柔韧性［6］。疟原虫的侵袭和发育显著改变红细胞的变形能力，可能会影响表面膜面积，疟原虫蛋白会修饰细胞骨架，疟原虫代谢会改变胞质黏度，同时变形能力的改变还影响抗疟治疗效果。疟原虫改变红细胞的变形能力是疟疾发病机制的重要决定因素，且配子体和滋养体期的体内循环主要取决于变形能力［7］。在是否存在青蒿素治疗的情况下，宿主防御机制在快速控制疟疾感染中起着重要作用，被感染的红细胞（pRBCs）变形能力降低，可能会导致其在脾脏内的滞留，例如通过脾脏或吞噬系统清除血液循环中的pRBCs［8-11］。脾脏是机体最大的血液过滤器，可通过检测和清除变形能力降低、免疫球蛋白G（IgG）致敏或被病原体感染的红细胞来维持正常的红细胞群，所有这些都是疟疾感染的特征［12-13］。有研究表明，脾脏通过特异性孔蚀的动力学过程截留疟疾患者体内的pRBCs，随后被脾脏免疫细胞识别并吞噬，在用青蒿素及其衍生物治疗的脾功能正常患者体内，这一清除机制显得尤为重要［14］。处于早期的染虫红细胞在通过脾脏内皮细胞间隙时，受到压力将疟原虫挤出红细胞滞留在脾脏中，剩余红细胞返回血液循环，回到血液循环的红细胞称为曾经染虫红细胞（O-pRBCs），O-pRBCs的存在会导致疟疾检测呈假阳性，造成青蒿素类药物治疗后疟原虫清除时间延长现象，同时染虫红细胞的柔韧性可能会影响脾脏的截留功能，从而影响O-pRBCs的产生［15-17］.因此研究红细胞变形能力对于探究脾脏功能、疟原虫清除速率与青蒿素“耐药”之间的关系至关重要，可以进一步了解疟原虫清除速率时间“延长”的本质内涵。本课题组前期实验研究发现，脾脏通过截留血液循环中的疟原虫控制疟疾感染［18］；C57BL/6小鼠同时感染伯氏疟原虫K173（PbK173）青蒿素敏感株（PbK173-S）、青蒿素抗性株（PbK173-R），在C57BL/6小鼠体内的双氢青蒿素（DHA）抗性指数为3.5［19］，经药物治疗后，PbK173-S小鼠中，阳性药物咯萘啶（MD）组及DHA高剂量组小鼠均痊愈；PbK173-R小鼠中，相同剂量的MD组均痊愈。在所有痊愈小鼠中发现，PbK173-S组的小鼠在停药至痊愈期间，脾脏会持续增大；而PbK173-R组痊愈鼠的脾脏无此情况，所以通过比较两种痊愈小鼠的血液参数、脏器指数及染虫红细胞柔韧性等相关指标，探究对青蒿素类药物敏感程度不同的疟原虫对红细胞柔韧性的影响，以期丰富青蒿素“耐药”的科学内涵。1 材料1.1　虫株PbK173青蒿素敏感株、抗性株（成都中医药大学基础医学院病理生理教研室，代勇老师馈赠；第50代）［20］。1.2　动物健康SPF级体质量18~22 g雄性C57BL/6小鼠，购于维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产合格证号SCXK（京）2022-0002。饲养温度（24±2）℃，湿度50%~60%，采用动物饮用水和SPF级小鼠饲料饲养。小鼠健康状况良好，无打架或撕咬行为。动物实验经中国中医科学院中药研究所实验动物伦理福利委员会审查通过［伦理审核编号T2017001-B2］。1.3　试剂DHA（中国中医科学院中药研究所杨岚研究员提供，批号C00220160402）；咯萘啶（重庆华方武陵山制药有限公司，批号C00220171106）；羧甲基纤维素钠（北京国药集团化学试剂有限公司，批号20200918）；磷酸盐缓冲液（PBS）、Percoll分离液、10×PBS缓冲液、Tris盐缓冲液（TBS）、聚山梨酯-20（Tween-20）、强效RIPA、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为20220220、G1010、P8370、G0001-2L、CR2209095、P1022、R0010）；渗透脆性试剂盒（上海尚宝生物科技有限公司，批号3021309）；皂素（德国Sigma公司，批号BCCH1928）；5×Loading Buffer（北京普利莱基因技术有限公司，批号2020SB1012）；蛋白酶磷酸酶混合抑制剂、超敏ECL发光剂、通用型抗体稀释液（苏州新赛美生物科技有限公司，批号分别为P002、P10100、WB10D）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美国Millipore公司，批号R0BB27120）；30%Acr/Bis（29∶1）制胶液、4×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）分离胶缓冲液（pH 8.8）、4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液（pH 6.8）（北京艾旗斯德科技有限公司，批号分别为Z200305A、Z200312L、Z200310A）；脱脂奶粉（美国BioRuler公司，批号r5071811）；聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，批号ZJ102）；Piezo1多克隆抗体、Band3多克隆抗体、β-肌动蛋白（β-actin）兔单克隆抗体、山羊抗兔IgG（武汉Proteintech公司，批号分别为15939-1-AP、28131-1-AP、20536-1-AP、SA00001-2）。1.4　仪器XN-1000V［B1］型全自动血液细胞分析仪（日本Sysmex公司）；Sorvall ST 8型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；BX43型光学显微镜（日本Olymus公司）；DW-FL439型超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）；BCD-321WDJ型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；TS-1型脱色摇床（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Mini-Protein型垂直电泳槽及转膜仪（美国Bio-Rad公司）；JY92-2D型超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Tanon 5200型全自动化学发光荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。2 方法2.1　建立鼠疟模型及给药剂量［18，21］C57BL/6小鼠根据体质量随机分为空白组、PbK173-S（PbK173-S组、MD-S组、DHA-S组）、PbK173-R（PbK173-R组、MD-R组），每组12只。除空白组外，各组小鼠分别同时腹腔接种1×107个PbK173-S/PbK173-R的pRBCs，鼠疟模型建立标准：小鼠血液涂片中染虫率≥20%（染虫率%=染虫红细胞数/总红细胞数×100%）。给药组在接种24 h后第1次给药，连续给药4 d，MD给药剂量为6 mg·kg-1，DHA给药剂量40 mg·kg-1。2.2　小鼠血液参数及各脏器指数计算给药期（给药结束第1天）和恢复期（给药结束第5天），小鼠称体质量，取小鼠外周血至乙二胺四乙酸盐（EDTA）抗凝管中，取脾脏、心脏、肝脏，称重并计算各脏器指数。脏器指数=脏器质量（g）/小鼠体质量（g）×100%。2.3　渗透脆性法检测染虫红细胞柔韧性建立PbK173-S、PbK173-R鼠疟模型，染虫率至20%时，取小鼠外周血液至抗凝管，60% Percoll分离液富集染虫红细胞（富集染虫红细胞，pRBCs），用PBS重悬红细胞至红细胞压积为20%。配制Parpart NaCl工作液（浓度分别为1.0、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0 g·L-1）。分别吸取pRBCs悬液10 μL，加入上述稀释液中，混匀，室温静置30 min。离心沉淀5 min，取上清液。用酶标仪检测540 nm波长下的吸光度，以含1 g·L-1 NaCl的一管作为100%溶血管，计算溶血百分率（溶血百分率=各管吸光度/溶血管吸光度×100%）。2.4　蛋白免疫印迹法检测染虫红细胞膜Piezo1及Band3蛋白水平正常红细胞中加入0.1%的皂素溶液（含蛋白酶磷酸酶抑制剂），置于4 ℃裂解30 min，10 000 r·min-1，4 ℃ 离心20 min（离心半径8 cm，下同），弃上清，加入PBS（含蛋白酶磷酸酶抑制剂），10 000 r·min-1，4 ℃离心10 min清洗直至沉淀为白色，即为纯化的红细胞膜。富集的染虫红细胞中加入0.1%的皂素溶液（含蛋白酶磷酸酶抑制剂），置于4 ℃裂解30 min，4 000 r·min-1离心10 min，吸取白色条带，余下操作与正常红细胞操作一致，所得沉淀为白色即为纯化的染虫红细胞膜。加入强效RIPA蛋白裂解液及磷酸酶抑制剂提取膜蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配置7%~10%SDS-PAGE，根据所测浓度每孔上样蛋白30 μg，电泳结束后将蛋白转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入一抗（Piezo1 1∶300；Band3 1∶600；β-actin 1∶5 000）室温孵育2 h，TBST（TBS-Tween-20 1 L∶1 mL ）洗膜6次，每次清洗时长5 min；加入二抗（1∶20 000），室温反应2 h，TBST洗膜6次，每次清洗时长5 min，ECL法显色，β-actin为内参。用Iamge Lab软件对蛋白条带灰度值进行分析以β-actin为内参计算。2.5　统计学处理采用IBM SPSS Statistics 23.0 软件进行统计分析，实验数据以x¯±s表示，组间比较采用单因素方差分析，统计检验采用双侧检验，每组数据均重复3次及以上，以P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果3.1　DHA对染虫小鼠给药期及恢复期的血液参数比较PbK173-S和PbK173-S连续给DHA（40 mg·kg-1）、MD（6 mg·kg-1）4 d后，在给药期、恢复期分别检测各组的血液参数。给药期比较各组血液参数，与DHA-S组比较，MD-S组小鼠的血液参数差异均无统计学意义；与MD-S组比较，MD-R组血液学参数差异均无统计学意义。见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T001表1DHA、MD对染虫小鼠给药期的血液参数 （x¯±s，n=6）Table 1Blood parameters during administration in infected mice （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1红细胞计数（×1012）/L血红蛋白浓度/g·L-1红细胞压积/%有核红细胞占比/%DHA-S组407.27±0.7195.33±10.1833.63±3.150.70±0.43MD-S组66.48±0.3594.17±4.3730.38±1.660.82±0.45MD-R组66.39±0.3292.17±4.3430.13±1.080.90±0.76组别剂量/mg·kg-1白细胞计数（×109）/L血小板压积/%淋巴细胞占比/%中性粒细胞占比/%DHA-S组406.90±0.710.17±0.0257.77±1.8414.22±2.11MD-S组67.16±1.170.16±0.0354.58±2.9314.80±1.08MD-R组66.32±0.930.16±0.0758.87±6.1614.62±1.81比较恢复期各组血液学参数，与DHA-S组比较，MD-S组的血液参数差异均无统计学意义。MD-R组的红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积均明显高于MD-S组（P0.05），有核红细胞占比显著高于MD-S组（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T002表2DHA、MD对染虫小鼠恢复期的血液参数 （x¯±s，n=6）Table 2Blood parameters during convalescent phase of infected mice （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1红细胞计数（×1012）/L血红蛋白浓度/g·L-1红细胞压积/%有核红细胞占比/%DHA-S组407.53±0.49107.5±5.7437.32±2.0112.02±3.53MD-S组67.09±0.59100.5±6.8736.18±2.7212.52±1.65MD-R组68.44±0.701）118.67±9.361）41.70±2.701）6.52±3.692）组别剂量/mg·kg-1白细胞计数（×109）/L血小板压积/%淋巴细胞占比/%中性粒细胞占比/%DHA-S组406.32±1.391.01±0.0866.23±2.6115.73±4.4MD-S组66.04±1.091.01±0.0666.45±2.5814.27±2.09MD-R组65.97±0.501.06±0.0568.57±3.0215.45±1.97注：与PbK173-S MD组比较1）P0.05，2）P0.013.2　DHA对染虫鼠给药期及恢复期的脏器指数比较给药期比较各组脏器指数，与DHA-S组比较，MD-S给药组小鼠的脏器指数差异均无统计学意义；与MD-S组染虫相比，MD-R组染虫小鼠的脏器指数差异均无统计学意义，见表3。恢复期，与DHA-S组比较，MD-S给药组小鼠的脏器指数差异均无统计学意义；MD-R组的脾脏指数较MD-S组低，且差异具有统计学意义（P0.05），见表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T003表3DHA、MD对染虫小鼠给药期的的脏器指数 （x¯±s，n=6）Table 3Organ coefficients during administration in infected mice （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1脾脏指数心脏指数肝脏指数DHA-S组401.20±0.070.64±0.057.278±0.42MD-S组61.17±0.050.66±0.097.08±0.50MD-R组61.18±0.040.63±0.036.84±0.42%10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T004表4DHA、MD对染虫小鼠恢复期的脏器指数 （x¯±s，n=6）Table 4Organ coefficients during convalescent phase of infected mice （x¯±s，n=6）组别剂量/mg·kg-1脾脏指数心脏指数肝脏指数DHA-S组401.57±0.150.60±0.036.76±0.24MD-S组61.63±0.220.60±0.036.97±0.22MD-R组61.16±0.301）0.64±0.056.76±0.21注：与PbK173-S MD组比较1）P0.05%3.3　对染虫小鼠富集pRBCs及渗透脆性的比较建立鼠疟模型，待小鼠体内染虫率达20%左右时，取小鼠外周血至EDTA抗凝管中，3 000 ×g，4 ℃，离心5 min，弃上清和中间白膜层，60% Percoll溶液富集滋养体时期的pRBCs。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.F001图1染虫血液涂片Fig.1Blood smear infected with Plasmodium注：A.虫率20%血液涂片；B.富集后的血液涂片将各组血液样本与不同浓度NaCl溶液充分混合，检测在540 nm波长下的吸光度，计算溶血百分率。与正常组比较，PbK173-S组与PbK173-R组pRBCs渗透脆性较高，且差异具有统计学意义（P0.01）；与PbK173-S组比较，PbK173-R组pRBCs渗透脆性较低，且差异具有显著统计学意义（P0.01）。正常小鼠、PbK173-R组、PbK173-S组红细胞的渗透脆性依次增大（柔韧性依次降低）。见表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T005表5染虫小鼠pRBCs的50%溶血率 （x¯±s，n=6）Table 550% hemolysis rate of pRBCs （x¯±s，n=6）组别NaCl浓度/g·L-1正常组5.34±0.12PbK173-S组6.36±0.081）PbK173-R组6.15±0.131，2）注：与正常组比较1）P0.01；与PbK173-S组比较2）P0.01（表6同）3.4　MD对染虫鼠给药期及恢复期红细胞渗透脆性给药期，与正常小鼠比较，PbK173-S组与PbK173-R组红细胞的渗透脆性较高，且差异具有显著统计学意义（P0.01）；与PbK173-S组比较，PbK173-R组红细胞的渗透脆性较低，且差异具有显著统计学意义（P0.01）。正常小鼠、PbK173-R组、PbK173-S组红细胞的渗透脆性依次增大（柔韧性依次降低）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T006表6MD对染虫小鼠给药期各组50%溶血率 （x¯±s，n=6）Table 650% hemolysis rate during administration in infected mice （x¯±s，n=6）组别NaCl浓度/g·L-1正常组5.38±0.05PbK173-S组5.64±0.081）PbK173-R组5.54±0.051，2）恢复期，与正常小鼠比较，PbK173-S与PbK173-R组红细胞的渗透脆性较高，且差异具有明显统计学意义（P0.05）；与PbK173-S组比较，PbK173-R组红细胞的渗透脆性较高，且差异具有明显统计学意义（P0.05）。正常小鼠、PbK173-S组、PbK173-R组红细胞的渗透脆性依次增大（柔韧性依次降低）。这与给药期时的结果正好相反。见表7。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T007表7MD对染虫小鼠恢复期各组50%溶血率 （x¯±s，n=6）Table 750% hemolysis rate during convalescent phase of infected mice （x¯±s，n=6）组别NaCl浓度/g·L-1正常组5.18±0.05PbK173-S组5.23±0.031）PbK173-R组5.40±0.031，2）注：与正常小鼠比较 1）P0.05；与PbK173-S组比较2）P0.053.5　对染虫红细胞膜Piezo1及Band3蛋白水平的影响与正常组比较，PbK173-S组与PbK173-R组的Piezo1蛋白和Band3蛋白表达水平明显降低（P0.05，P0.01）；与PbK173-R组比较，PbK173-S组Piezo1蛋白和Band3蛋白表达水平明显降低（P0.05），从图2可知正常组、PbK173-R组、PbK173-S组红细胞膜上Piezo1蛋白和Band3蛋白表达水平依次下降。见图2、表8。10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.F002图2PbK173-S与PbK173-R染虫红细胞膜Piezo1及Band3蛋白水平Fig.2Levels of Piezo1 and Band3 proteins in the erythrocyte membrane of PbK173-S and PbK173-R infects注：A.PbK173-S；B.PbK173-R；C.正常组10.13422/j.cnki.syfjx.20240113.T008表8感染不同敏感性虫株对红细胞Piezo1蛋白和Band3蛋白表达水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 8Effect of xpression levels of Piezo1 protein and Band3 protein （x¯±s，n=3）组别Piezo1/β-actinBand3/β-actin正常组1.49±0.301.80±0.27PbK173-S组0.45±0.17 2）0.64±0.072）PbK173-R组0.89±0.081，3）1.04±0.062，3）注：与正常组比较1）P0.05，2）P0.01；与PbK173-S组比较3）P0.054 总结与讨论本课题组实验研究中，同时建立PbK173-S与PbK173-R鼠疟模型，经药物治疗以后，PbK173-S组，阳性药物MD-S与DHA-S高剂量组小鼠均痊愈；PbK173-R中仅有MD-R组痊愈，比较这3组痊愈小鼠给药期及恢复期的血液参数发现：在停药以后的恢复期，PbK173-S组有核红细胞占比较PbK173-R组高。有核红细胞是未成熟的红细胞，通常在身体中所占比例相对较小，当体内有核红细胞的比例较高时，通常是由增殖性贫血或恶性贫血引起。所以在恢复期PbK173-S组的有核红细胞占比较PbK173-R组高可能由贫血引发，PbK173-R组红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积均显著高于PbK173-S组可以进一步说明上述观点。那么在同样痊愈的情况下，为什么PbK173-R组血液循环中的红细胞计数高于PbK173-S组？正常时，各脏器与体质量的比值较恒定，当动物脏器受损后，受损脏器重量随之发生改变。脏器充血、水肿或增生等，脏器指数会增大；脏器萎缩或其他退行性改变，脏器指数会减小［22］。脾脏作为人体重要的淋巴器官和血液过滤器官，可以特异性识别并清除衰老、受损或被病原体感染的红细胞，可通过孔蚀的动力学过程清除疟原虫，染虫红被挤出红细胞滞留在脾脏中，返回血液循环的O-pRBCs是一种受损的状态，胞内的营养物质会外漏，但仍可继续参与血液循环并生存一定时间，待其受损严重柔韧性进一步降低时，可被脾脏截留［1，23-24］。返回血液循环的O-pRBCs发生率与3个因素相关：疟原虫的生长时期、脾静脉窦功能、红细胞的柔韧性［25-26］。在小鼠来源相同、血液涂片中没有明显虫体存在的背景下，恢复期的PbK173-S组脾脏持续增大且贫血现象要比PbK173-R组严重，这可能与pRBCs的柔韧性相关。所以采用渗透脆性法检测了2种染虫红细胞的柔韧性。红细胞的渗透脆性是指红细胞对不同浓度NaCl溶液的抵抗力，这种抵抗力主要取决于红细胞表面积和体积之比（又称相对表面积），相对表面积大的红细胞对低渗NaCl溶液抵抗力较大（脆性减低）；反之，则抵抗力较小（脆性增加）［27］。正常红细胞具有较大的相对表面积，这使得红细胞在受到外力时易于发生变形。红细胞的变形性取决于红细胞的几何形状、红细胞内的黏度和红细胞膜的柔韧性。因此红细胞膜柔韧性降低会导致红细胞变形能力的下降，渗透脆性增强。渗透脆性法检测基础一般由溶血曲线定性，通常用50%溶血的NaCl溶液进行比较，该方法对离子和水穿过红细胞膜的运动敏感［28］。即使是同一个体单个红细胞之间的柔韧性仍存在差异，因此采用渗透脆性法对红细胞群进行检测得到平均渗透脆性，操作简便快捷，耗时短，更易于重复实验。用渗透脆性法检测红细胞群中部分异常细胞的变形性需要对样本进行处理，因此检测染虫红细胞时需进行富集处理除去未感染的红细胞，再进行检测。检测发现，2种鼠疟模型及给药期时，正常小鼠、PbK173-R组、PbK173-S组柔韧性依次降低。在恢复至痊愈期间，PbK173-S组的脾脏不断增大且血液中的红细胞柔韧性较PbK173-R组高，判断是在停药初期，PbK173-R/PbK173-S两组血液循环中均存在O-pRBCs，因为PbK173-S组红细胞的柔韧性较低，在再次经过脾静脉窦时，O-pRBCs截留的概率较PbK173-R组的高。所以PbK173-S小鼠的脾脏在停药以后会持续增大，而因为O-pRBCs被截留，血液循环中的正常红细胞数占比高，所以在恢复期，PbK173-S小鼠红细胞的柔韧性较PbK173-R小鼠增高。为了验证这一猜想，笔者比较了PbK173-R/PbK173-S 2种染虫红细胞膜表面的柔韧性相关蛋白。红细胞稳态受红细胞膜内各种主动、被动转运机制的调节，红细胞膜中变形性相关蛋白的表达水平与红细胞变形性之间具有相关性［29］。膜内的蛋白质是不对称的，且在成熟过程中存在部分膜蛋白丢失，如胰岛素受体、转铁蛋白等［30］。膜蛋白可以改变外膜小叶相对于内膜小叶的面积的关系，导致细胞的整体形状的变化。这意味着通过蛋白质的构象变化施加到膜上的力能够改变两个膜小叶内的张力。因此，膜蛋白的构象可以影响两个膜小叶内的张力，反之亦然［31］。变形性相关蛋白包括Piezo1蛋白、带3蛋白、非肌球蛋白-ⅡA等，Piezo1蛋白是巨噬细胞吞噬活性和随后红细胞更新的关键调节因子［32］。Piezo1与红细胞的体积有关，Piezo1等位基因的缺失导致红细胞脱水，细胞感受到机械压力从而Piezo1被激活，Ca2+离子内流，从而激活K+-Ca2+ 3.1离子通道使得K+离子外流，同时伴随脱水皱缩，形状体积发生改变，红细胞的柔韧性发生变化［33-35］。Band3蛋白是贯穿膜脂双层的内在糖蛋白，通常以二聚体和四聚体的形式存在于红细胞膜中，具有阴离子（Cl-，HCO3-）转运功能，还有助于维护红细胞结合细胞膜骨架的完整性［36］。Band3蛋白的表达水平与红细胞变形呈明显的正相关，其细胞外部分的构象变化将导致细胞内环境发生变化，会直接影响细胞骨架动力学，导致红细胞清除［28］。Piezo1蛋白、Band3蛋白这2个蛋白能够稳定检测，因此本实验选取这2个蛋白进行检测，并采取不同的膜蛋白上样量来保证目的蛋白条带清晰。检测发现，疟原虫感染红细胞能够明显降低红细胞膜上的Piezo1蛋白、Band3蛋白水平；且PbK173-S小鼠染虫红细胞的Piezo1、Band3蛋白含量较PbK173-R小鼠更低，这可验证渗透脆性法检测红细胞柔韧性时的结果，正常小鼠、PbK173-R染虫鼠、PbK173-S染虫鼠柔韧性依次降低。由此可猜想，对青蒿素类药物敏感性不同的疟原虫株，其染虫红细胞的柔韧性可能会有差异，而引起此差异的原理及机制还需进一步探究。