2型糖尿病（T2DM）是一种以胰岛素抵抗（IR）或胰岛素分泌不足为特征的疾病，其中肥胖、IR、T2DM之间存在着复杂的关联机制［1］。临床流行病学数据显示，全球T2DM患者人数迅速增加，不仅严重威胁人民健康，还给社会经济造成极大负担［2］。IR是指胰岛素刺激的反应减弱，胰岛素靶器官组织对胰岛素的反应性和敏感性降低，最终导致糖耐量异常和糖尿病的发生［3］。而肝脏是胰岛素作用的重要靶器官之一，也是糖脂代谢的主要器官［4］。因此，有效改善肝脏的IR对于治疗T2DM至关重要。目前有研究表明肝脏IR与自噬、炎症、氧化应激等因素密切相关［5-7］。当自噬功能受损时，肝脏糖脂稳态失衡、炎症增多，最终导致IR及糖尿病的发生［8］。另一项研究发现某些调节IR的药物与自噬反应有直接或间接的关联，但其具体的机制尚不清楚［9］。而IR在中医上主要被认为是“中满内热”引起的代谢性疾病［10］。大黄、黄连是临床上治疗IR的常用药物，具有较好的降糖作用［10-11］。课题组基于此提出假说，基于大黄-黄连药对对腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/UNC-51样激酶1（ULK1）/自噬关键分子苄氯素1（Beclin1）通路的影响，探讨对肝脏IR的调控作用，期望在降低IR的同时，找出更好控制体质量、炎症并降低其不良反应的药物，以期了解对IR治疗作用的靶点及其机制，为该药提供实验数据支撑。1 材料1.1　动物60只6周龄SPF级db/db小鼠及12只SPF级db/m小鼠，购自常州卡文斯实验动物有限公司，合格证号SCXK（苏）2021-0013。小鼠在甘肃中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中饲养，许可证号SYXK（甘）2020-0009。本实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号2022-815）。1.2　药物盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝股份有限公司，批号AB24609，规格0.5 g/片）；大黄、黄连饮片购于甘肃中医药大学附属医院，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》使用规范，按传统水煎法煎煮药材，将大黄-黄连1∶1配比，先加入6倍量的冷水浸泡药材30 min，煮沸40 min，过滤水煎液；再次加入6倍量水于药渣中煎煮40 min，合并2次水煎液，将其水浴蒸发浓缩成生药质量浓度为2 g·mL-1。1.3　试剂AMPK抗体（美国ImmunoWay公司，批号B1601）；苄氯素1（Beclin1）、自噬相关蛋白5（Atg5）、p62、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G抗体（美国Genetex公司，批号分别为822100583、822204460、44538、RS0001）；微管相关蛋白1轻链3（LC3）抗体（美国CST公司，批号E5Q2K）；ULK1抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号BF8364）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体、苏木素-伊红（HE）染液套装（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号分别为AC220918001、G1003）；IR试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号H203-1-1）。实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）试剂盒、逆转录试剂盒（武汉翌圣生物科技有限公司，批号分别为H6201080、H8223930）。1.4　仪器Specra Max i3x型多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；PowerPac型电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；LX-165T2R型台式高速微量冷冻离心机（青岛海特生物医疗有限公司）；SH-Compact523型化学发光成像系统（杭州申花科技有限公司）；PUTTON P100/P100+型超微量分光光度计（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；CG-05型Real-time PCR仪（力康生物医疗科技控股有限公司）。2 方法2.1　分组及给药小鼠适应性喂养后，将12只SPF级雄性小鼠db/m作为空白组，60只SPF级雄性db/db小鼠随机分为5组，每组12只，分别为模型组、大黄-黄连高、中、低剂量组及二甲双胍组。各给药组剂量按照人与动物体质量系数折算［11］。大黄-黄连高、中、低组分别给予9、4.5、2.25 g·kg-1药液灌胃，二甲双胍组给予0.26 g·kg-1药液灌胃，空白组和模型组给予同体积生理盐水，共干预8周，整个过程小鼠均自由摄食、饮水。末次给药后12 h，取血清及相关组织。2.2　小鼠体质量、血糖、胰岛素及外周胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的测定干预后测定各组小鼠体质量、血糖及胰岛素抵抗指数；操作步骤严格按照酶联免疫吸附测定法说明书，检测小鼠血清空腹胰岛素（FINS）；计算HOMA-IR=空腹血糖（FBG，mmol·L-1）×空腹胰岛素（FINS，mIU·L-1）/22.5。2.3　HE染色观察小鼠肝组织病理形态学变化将肝脏组织用4%多聚甲醛浸泡固定，进行脱水、包埋、切片后依次染色，最后封片并使用显微镜拍照观察组织病理改变。2.4　免疫荧光法检测小鼠肝脏LC3和ULK1荧光蛋白表达制备肝脏组织石蜡切片，使用封闭液室温避光封闭30 min，PBS冲洗后加入一抗LC3、ULK1（1∶100），4 ℃孵育过夜。次日使用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5 min，轻甩干后加入相对应二抗覆盖，室温避光50 min。进行DAPI染色、封片，并放于荧光显微镜下采集图像，分析其荧光度的表达。2.5　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝脏组织中AMPK、Beclin1、Atg5及p62蛋白表达剪取肝脏组织0.1 g，加入RIPA蛋白裂解液和PMSF进行研磨。4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min（离心半径5 cm），取上清。随后采用BCA法测定蛋白浓度，保证蛋白上样量一致，加入适量蛋白上样缓冲液，变性10 min，电泳、转膜、封闭2 h，TBST洗膜3次后加入一抗（AMPK、Beclin1、Atg5、p62，1∶1 000）和β-actin一抗（1∶5 000）孵育后进行TBST清洗3次，加入二抗（1∶5 000），孵育清洗后，使用ECL进行发光。所得结果使用Image J软件分析。2.6　Real-time PCR检测肝组织AMPK、Beclin1、Atg5、ULK1、p62 mRNA表达剪取小鼠肝脏组织100 mg，采用RNA提取试剂盒提取总RNA，微量分光光度计测定其纯度及浓度，随后进行反转录，并进行扩增。扩增条件：95 ℃预变性5 min，3步循环法反应（95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s），45个循环，引物由上海百赛生物公司合成，序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列（5′-3′）长度/bpAMPK上游TGTGGGCTCTGACATGATGAA110下游AATCAGGTTACTCTGGGCAAACATAULk1上游ATTGCCACTGTGCTTGGTTGTA129下游CCAGTTGGCCACAAAGCAATABeclin1上游CCAATGTCTTCAATGCCACCTTC120下游AGGCAGCATTGATTTCATTCCACAtg5上游CAGATGGACAGCTGCACACAC126下游GGGTTTCCAGCATTGGCTCTAp62上游CCTTGCCCTACAGCTGAGTC133下游CATGTTCCACATCAATGTCAACCβ-actin上游CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC171下游ATGGAGCCACCGATCCACA2.7　统计学分析采用SPSS 26.0软件进行分析。实验数据以x¯±s表示。如符合正态分布，组间比较采用方差分析，方差齐时各组比较采用最小显著性差异法（LSD）检验，方差不齐时采用塔姆黑尼T2法进行检验，P0.05表示差异有统计学意义。3 结果3.1　对db/db小鼠血糖、体质量的影响给药干预结束后，与空白组比较，模型组小鼠体质量显著增加（P0.01），血糖显著升高（P0.01）；与模型组比较，大黄-黄连高、中剂量组小鼠体质量、血糖均显著降低（P0.01）。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T002表2大黄-黄连对db/db小鼠体质量和血糖的影响 （x¯±s，n=10）Table 2Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on body weight and blood glucose levels in db/db mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1体质量/gFBG/mmol·L-1空白组26.62±2.963.77±0.54模型组52.14±5.641）26.17±1.431）二甲双胍组0.2645.67±4.862）13.07±2.102）大黄-黄连低剂量组2.2547.85±3.9721.88±2.92大黄-黄连中剂量组4.546.81±5.892）19.90±2.602）大黄-黄连高剂量组944.22±5.672）18.00±2.972）注：与空白组比较1）P0.01；与模型组比较2）P0.05，3）P0.01（表3-表6同）3.2　对db/db小鼠FINS、HOMA-IR的影响与空白组比较，模型组小鼠FINS、HOMA-IR含量显著增加（P0.01），符合IR模型；与模型组比较，大黄-黄连中、高剂量及二甲双胍组小鼠FINS和HOMA-IR含量明显降低（P0.05），大黄-黄连低剂量组HOMA-IR明显降低（P0.05）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T003表3大黄-黄连对db/db小鼠FINS、HOMA-IR的影响 （x¯±s，n=10）Table 3Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on FINS and HOMA-IR in db/db mice （x¯±s，n=10）组别剂量/g·kg-1FINS/mIU·L-1HOMA-IR空白组7.87±1.021.31±0.16模型组26.26±2.581）30.43±2.021）二甲双胍组0.2612.06±2.683）6.83±0.883）大黄-黄连低剂量组2.2523.04±4.0121.10±1.413）大黄-黄连中剂量组4.519.13±3.333）16.62±1.063）大黄-黄连高剂量组916.57±3.753）12.85±0.883）3.3　对db/db小鼠肝脏组织病理结构的影响空白组小鼠肝脏组织结构完整，肝索排列整齐，未见明显病理结构改变；模型组小鼠可见大量空泡变性，肝索排列不齐且胞质内含透明圆形脂滴，出现肝窦瘀血等变化；与模型组比较，大黄-黄连中、低剂量组小鼠病变程度略有减轻，有较多肝细胞空泡变性、脂滴大小不一、肝窦轻微瘀血；二甲双胍组和大黄-黄连高剂量组肝细胞空泡变性及肝细胞脂肪变性明显减轻。见图1。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.F001图1大黄-黄连对db/db小鼠肝脏组织病理形态学变化的影响 （HE，×200）Fig.1Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on liver histopathological changes in db/db mice （HE，×200）注：A.空白组；B.模型组；C.二甲双胍组；D.大黄-黄连低剂量组；E.大黄-黄连中剂量组；F.大黄-黄连高剂量组（图2-图4同）3.4　对db/db小鼠肝脏LC3和ULK1表达的影响各组蛋白定位表达水平和平均荧光强度值均呈正比。与空白组比较，模型组小鼠肝组织LC3B、ULK1平均荧光强度显著增高（P0.01）；与模型组比较，各组给药组小鼠肝组织中LC3B、ULK1平均荧光强度均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P0.05，P0.01），证明大黄-黄连可以有效调控自噬。见图2、图3、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.F002图2大黄-黄连对db/db小鼠肝脏组织中ULK1荧光含量的影响 （免疫荧光，×400）Fig.2Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on fluorescence content of ULK1 in liver tissue of db/db mice （IF，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.F003图3大黄-黄连对db/db小鼠肝脏组织中LC3荧光含量的影响 （免疫荧光，×400）Fig.3Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on fluorescence content of LC3 in liver tissue of db/db mice （IF，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T004表4大黄-黄连对db/db小鼠肝脏组织中LC3B、ULK1表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 4Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on LC3B and ULK1 in liver tissue of db/db mice （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1LC3BULK1空白组13.16±0.4722.98±1.53模型组2.23±0.241）1.16±0.121）二甲双胍组0.2611.59±1.113）15.35±1.023）大黄-黄连低剂量组2.254.07±0.392）6.17±0.253）大黄-黄连中剂量组4.56.75±0.733）10.69±0.713）大黄-黄连高剂量组910.21±0.813）13.97±1.053）%3.5　对db/db小鼠肝脏AMPK、Beclin1、Atg5、p62蛋白表达的影响与空白组比较，模型组小鼠肝脏组织中AMPK、Beclin1、Atg5蛋白表达水平显著下降（P0.01）；p62蛋白表达水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，大黄-黄连低、中、高剂量组肝脏组织AMPK、Beclin1、Atg5蛋白表达水平均明显升高（P0.05，P0.01）；p62蛋白表达水平明显降低（P0.05）。见图4、表5。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.F004图4db/db小鼠肝脏组织中AMPK、Beclin1、Atg5、p62蛋白表达电泳Fig.4Electrophoresis of AMPK， Beclin1， Atg5， p62 protein expression in liver tissue of db/db mice10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T005表5大黄-黄连对db/db小鼠肝脏组织AMPK、Beclin1、Atg5、p62蛋白表达水平的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on expression levels of AMPK， Beclin1， Atg5 and p62 in liver tissue of db/db mice （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1AMPK/β-actinBeclin1/β-actinAtg5/β-actinp62/β-actin空白组0.97±0.041.02±0.161.04±0.100.11±0.07模型组0.11±0.021）0.20±0.081）0.37±0.051）0.94±0.151）二甲双胍组0.260.60±0.063）0.50±0.102）0.86±0.093）0.26±0.052）大黄-黄连低剂量组2.250.25±0.043）0.31±0.080.51±0.112）0.67±0.212）大黄-黄连中剂量组4.50.42±0.093）0.40±0.120.68±0.053）0.51±0.112）大黄-黄连高剂量组90.55±0.083）0.49±0.132）0.85±0.063）0.48±0.102）3.6　对db/db小鼠肝脏AMPK、Beclin1、Atg5、ULK1、p62 mRNA表达的影响与空白组比较，模型组小鼠肝组织中AMPK、Beclin1、Atg5、ULK1 mRNA表达水平显著降低（P0.01），p62表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P0.01）；与模型组比较，各用药组AMPK、Beclin1、Atg5 mRNA表达水平均有不同程度升高（P0.05，P0.01），ULK1 mRNA高剂量组明显升高（P0.05），p62表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P0.01）。见表6。10.13422/j.cnki.syfjx.20232240.T006表6大黄-黄连对db/db小鼠肝脏中AMPK、Beclin1、Atg5、ULK1、p62 mRNA表达的影响 （x¯±s，n=4）Table 6Effect of Rhei Radix et Rhizoma-Coptidis Rhizoma on mRNA expression levels of AMPK， Beclin1， Atg5， ULK1 and p62 in liver of db/db mice组别剂量/g·kg-1AMPKBeclin1Atg5ULK1p62空白组1.00±0.051.00±0.021.01±0.163.77±0.941.00±0.05模型组0.42±0.021）0.27±0.031）0.32±0.021）1.33±0.131）8.72±1.011）二甲双胍组0.260.89±0.053）0.91±0.093）0.71±0.082）3.01±0.422）1.35±0.423）大黄-黄连低剂量组2.250.53±0.022）0.45±0.042）0.57±0.112）2.83±0.235.42±0.853）大黄-黄连中剂量组4.50.57±0.032）0.69±0.033）0.59±0.092）2.79±0.084.99±0.423）大黄-黄连高剂量组90.73±0.063）0.82±0.073）0.64±0.092）3.77±0.942）2.16±0.603）x¯±s，n=44 讨论IR是一种慢性代谢性疾病，严重威胁患者的健康［12］。其主要发病机制是胰岛素靶器官对胰岛素的反应性和敏感性降低，导致机体对葡萄糖的摄取和利用功能出现障碍，而肥胖是导致发病的最主要原因之一［13-14］。建立理想的IR动物模型可以更加了解疾病的发展过程，db/db小鼠因其瘦素受体缺失，影响下丘脑摄食中枢，是理想的自发型IR动物模型［15］。在建立模型成功的基础上，本实验采用二甲双胍作为阳性药。二甲双胍主要通过抑制糖异生关键酶改善胰岛素敏感性，具有疗效好、价格低、代谢快等优点，已成为临床上常用药物。但不良反应明显，如引起巨幼细胞性贫血、低血糖及肝肾损伤等［16-17］。目前糖尿病IR常见的治疗方法有胰岛素注射、药物干预和中医药治疗等，其中中医有着独特的理论和临床诊疗经验，为此寻找降糖效果好，不良反应低的药物，本课题组选用了中医临床常用治疗IR的药物大黄、黄连组成药对。黄连-大黄作为苦寒清热的代表性药物，大黄涤荡肠胃，推陈致新，可助黄连导火热、浊邪外出，两药配伍共逐糖脂郁浊，清阳明郁热［18-20］。现代药理学研究表明［21］，大黄中的主要化学成分，可以有效改善胰岛素功能，减轻IR。LI等［22］研究还发现大黄素具有抗炎、抗癌等功效，而黄连中的主要活性成分小檗碱，也被研究证明具有降低血糖和改善IR的作用［23］。除上述外笔者还发现二甲双胍和小檗碱联用，有效增强胰岛素敏感性的同时，可以减少二甲双胍用量，降低其不良反应，达到减毒增效的作用［24］，这为后期实验提供了新思路。本研究显示，与db/m小鼠比较，大黄和黄连联合给药可有效降低db/db小鼠体质量，减轻IR指数，HE结果表明大黄-黄连可以有效降低db/db小鼠肝脏空泡大小，改善肝脏脂肪变性，对小鼠肝脏损伤具有一定修复作用。自噬是一种细胞内的自我降解代谢机制，通过平衡能量、清除受损细胞器和脂滴，维持肝脏的平衡［25-26］。AMPK是细胞内能量传感器对AMP/腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）变化非常敏感，也是脂类和糖原代谢的重要调节因子［27］。当AMPK被激活时，会调节自噬的启动酶ULK1与Beclin1相结合，促进下游蛋白Atg5和p62等的表达，进而激活自噬的发生［28］。肥胖是导致T2DM患者全身不良变化的重要原因之一。过多的脂肪堆积不仅会引发脂肪对身体的不良反应，并且会影响β细胞的功能，导致胰岛素的分泌减少，增加肝脏对胰岛素的抵抗能力［29］。研究发现，在肥胖或糖尿病的小鼠模型中，肝脏细胞的自噬活性明显下降［30］。当自噬相关基因被敲除时，线粒体会出现肿胀和变形的现象，同时脂滴数量也会明显增加，这些变化会导致IR和葡萄糖耐量等异常情况的发生［31］。另外，一些研究表明，通过激活AMPK自噬信号通路，可以有效改善非酒精性脂肪肝病，并提高肝脏的功能［32］。上述研究与本实验结果基本相同，与db/db小鼠比较，大黄-黄连给药组可以上调肝脏组织中的LC3B、ULK1荧光含量的表达，增加AMPK、Beclin1、Atg5蛋白的含量，同时下调p62蛋白，并且Real-time PCR结果与其蛋白表达趋势相一致，这表明激活自噬的发生可以有效减轻db/db小鼠IR。综上所述，大黄-黄连可能通过上调AMPK/ULK1/Beclin1自噬信号通路，有效改善T2DM IR的体质量和血糖，降低其胰岛素敏感指数，减轻肝脏病理形态，达到改善IR的作用。但在本实验中笔者发现大黄-黄连治疗效果并不理想，后续课题组将进行体内联合给药，继续探讨大黄-黄连减毒增效及对肝细胞自噬具体机制的探寻，进一步为临床应用提供实验依据。