肝纤维化是由各种病因导致肝内细胞释放细胞因子、活性氧簇等，进而刺激静止期的肝星状细胞（HSC）活化成肌成纤维细胞，产生细胞外基质（ECM），形成纤维间隔，改变肝内结构，影响肝脏正常生理功能的一种病理变化，其存在于大多数慢性肝病过程中［1］，随着ECM沉积增多与降解减少，肝实质被ECM侵占，导致肝硬化甚至肝癌的发生，但由于肝纤维化具有可逆性，所以逆转肝纤维化对于肝硬化、肝癌的治疗显得尤为关键。祖国医学原无“肝纤维化”病名的记载，但根据其食欲不振、疲倦乏力、胁肋部胀痛等临床表现，将其归属于“胁痛”“癥积”“积聚”“臌胀”等范畴［2］。由于肝纤维化复杂的病理机制，目前尚无特效药供临床使用，而经过临床和实践验证，中医药在抗肝纤维化方面有着突出优势［3］。甘肃省国医大师周信有教授认为慢性肝病多表现出肝强脾弱、邪实正虚、虚实夹杂等特点，且“瘀、毒、虚”贯穿其发生发展，基于此并结合周老临床经验拟舒肝化癥方，全方共奏“解毒化湿、补虚、袪瘀”之效［4］。有研究表明，肝脏损伤常伴有缺氧的发生［5］，缺氧会激活缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），进而诱导血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子-β1（TGF-β1）过表达［6］，致使HSC活化，产生大量的ECM，导致肝窦毛细血管化和病理性血管增生，这是肝纤维化过程中的重要病理基础［2］，且HIF-1α/VEGF/TGF-β1信号通路与周老强调的“瘀、毒、虚”理论相吻合。故本实验旨在探索舒肝化癥方对四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠模型的治疗效果，并探讨其是否通过调控HIF-1α/VEGF/TGF-β1信号通路发挥作用，为该复方的临床应用提供实验数据支撑和理论依据。1 材料1.1　动物SPF级雄性SD大鼠54只，体质量（200±20） g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供，饲养于甘肃中医药大学SPF级科研实验动物中心，实验动物合格证号SCXK（京）2019-0010，实验动物使用许可证号SYXK（甘）2020-0009，实验方案由甘肃中医药大学伦理委员会批准，动物伦理批准号2022-543。1.2　药物与试剂舒肝化癥方由柴胡9 g、茵陈20 g、板蓝根15 g、当归9 g、丹参20 g、莪术9 g、党参9 g、炒白术9 g、黄芪20 g、女贞子20 g、五味子15 g、茯苓9 g组成。中药饮片经甘肃中医药大学中药学院中药鉴定学教研室杨扶德教授鉴定为合格，将其按照临床用药比例进行混合，并加入5倍量的纯净水浸泡，进行回流提取0.5 h后过滤掉。再将药渣加入4倍量纯净水回流提取0.5 h后再次过滤，将2次过滤得到的液体合并。其中，舒肝化癥方高剂量组药液浓缩至每1 mL含有5 g生药，中剂量组浓缩至每1 mL含有2.5 g生药，低剂量组浓缩至每1 mL含有1.2 g生药。CCl4（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号C12773729）；橄榄油（陇南市祥宇油橄榄开发有限责任公司，批号SC10262262100100）；秋水仙碱片（西双版纳药业有限责任公司，国药准字H53021369，批号180101）；伊红染液（天津市光复精细化工研究所，批号17372-87-1）；苏木素染液（上海如吉生物技术有限公司，批号517-28-2）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔抗多克隆抗体、HIF-1α兔抗多克隆抗体、VEGF兔抗多克隆抗体、TGF-β1兔抗多克隆抗体、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G-辣根过氧化物酶（HRP）（美国ImmunoWay公司，批号分别为YN5585、YT2133、YN5444、YT4632、RS0002）；SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro TaqHS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号分别为AG21022、AG11728、AG11718）；大鼠羟脯氨酸（HYP）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技股份有限公司，批号分别为YJ669833、YJ533874）。1.3　仪器D37520型低温高速离心机（德国Kendro公司）；BX53型显微镜及图像采集系统（日本Olympus公司）；CFX96型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）系统、Powerpac Basic 164-5050型电泳仪、Trans-BlotTurbo型全能型蛋白转印系统、ChemiDocMP型全能型成像系统、Mark 1509型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；DW-861338型-80 ℃超低温冰箱（中国海尔公司）。2 方法2.1　动物分组与给药SD大鼠经过3 d的适应性喂养后，按照随机数字表法分为6组：空白组、模型组、秋水仙碱组、舒肝化癥方高、中、低剂量组，每组9只。除空白组大鼠外，其余各组大鼠均腹腔注射2.0 mg·kg-1 CCl4橄榄油溶液诱导肝纤维化模型，每周3次，持续8周［7］。首次注射次日开始给药，模型组用与实验组等量的0.9%生理盐水灌胃，秋水仙碱组给予秋水仙碱溶液0.2 mg·kg-1灌胃，舒肝化癥方高、中、低剂量组分别用中药水煎剂以29.52、14.76、7.38 g·kg-1灌胃，每日1次，持续8周；空白组不作任何处理，期间正常喂食喂水，作为对照观察使用［7］。给药量计算方法参照《药理实验方法学》［8］，大鼠剂量=人临床剂量/70 kg×6.3。2.2　样品制备与动物处理末次给药后当天，大鼠禁食禁水，次日，大鼠以45 mg·kg-1体质量腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉。随后通过穿刺腹主动脉抽取血液，并将其保存在-80 ℃冰箱中作为备用。切取肝右叶，浸泡在4%多聚甲醛固定液中进行苏木素-伊红（HE）染色并制作切片；切取肝左叶，进行提取总蛋白和总RNA。2.3　大鼠生理状况的观察每天观察并记录各组大鼠生长状况、饮食进水、毛色光泽、精神状态、粪尿量以及死亡等一般状况。2.4　HE染色检测大鼠肝组织病理变化将肝组织进行固定后，经过脱水、包埋和切片处理，最后进行常规HE染色。显微镜镜检，每张切片选取３个不同视野，观察纤维化程度，综合参考临床肝脏炎症分级（G）和肝纤维化分期标准（S）对肝脏损伤程度进行评分，评分越高代表肝纤维化程度越严重［9］。具体标准表述如下：分期为S0，评分为G0：无纤维化改变；分期为S1，评分为G1：轻微，门静脉扩张伴门脉区局限性纤维化；分期为S2，评分为G2：轻度，门静脉纤维化伴少量纤维间隔；分期为S3，评分为G3：中度，门脉纤维变性伴大量纤维间隔（假小叶）；分期为S4，评分为G4：重度（肝硬化），在门静脉和门静脉之间、门静脉和中央静脉之间造成明显的桥接坏死并伴有再生结节，形成假小叶。2.5　ELISA检测肝组织中HYP、AngⅡ含量严格按照大鼠HYP、AngⅡ ELISA检测试剂盒操作说明，测定各孔的吸光度A，根据曲线方程计算各个样本浓度。2.6　Real-time PCR检测肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1的mRNA表达切取肝纤维化模型大鼠肝组织15 mg，用液氮研磨成粉末，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并测定其含量和纯度。然后按照反转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA（反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s）。用Real-time PCR检测HIF-1α、VEGF和TGF-β1的mRNA表达水平，PCR反应条件20 μL体系，（反应条件：95 ℃预变性30 s，1次循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40次循环），以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。PCR引物均由湖南艾科瑞生物工程有限公司设计和合成，序列见表1。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.T001表1引物序列Table 1Primer sequence引物序列（5′-3′）长度/bpHIF-1α上游GCGAGAACGAGAAGAAAAATAGG134下游GTTGTGGGGAAGTGGCAAVEGF上游AGGGTCAAAAACGAAAGCGC139下游CGCGAGTCTGTGTTTTTGCATGF-β1上游CATTGCTGTCCCGTGCAGA103下游AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTAβ-actin上游GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA143下游GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG2.7　免疫组化（IHC）法检测肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1的蛋白表达情况肝组织切片脱水、包埋、脱蜡和抗原修复，滴加一抗（HIF-1α、VEGF，1∶200；TGF-β1，1∶500），4 ℃过夜，使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗涤，加入二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，1∶200），DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。在正置荧光显微镜下镜检，每张切片选取３个不同视野，使用Image J软件分析HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达水平。2.8　蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达取大鼠肝组织120 mg，剪碎后加RIPA裂解液，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min（离心半径24 cm），取上清液进行BCA法测定蛋白浓度，确定上样量，加入5×Loading Buffer上样缓冲液，放入振荡恒温金属浴中。依次进行电泳、转膜和封闭。分别孵育HIF-1α、VEGF、TGF-β1、GAPDH（1∶2 000），加入二抗（1∶5 000），ECL发光显影，凝胶成像，使用Image J和GraphPad Prism 9.5软件进行HIF-1α、VEGF、TGF-β1和GAPDH显影条带的相对灰度值分析。2.9　统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以x¯±s表示，数据进行正态性和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用最小显著性差异法（LSD）-t检验；方差不齐采用非参数秩和检验。P0.05为差异具有统计学意义。3 结果3.1　对大鼠生理状况的影响观察发现，空白组大鼠的生长状况良好，正常饮食进水，毛色光亮、光滑，精神状态良好；而模型组大鼠精神状态消沉，食量和饮水量减少，体质量减轻，毛色暗淡，粪便稀软，尿色发黄；用药组健康状况各方面较模型组明显改善，其中尤以秋水仙碱组和舒肝化癥方高、中剂量组改善突出。实验期间，因操作不当，大鼠共死亡8只，模型组死亡3只，中药高剂量组死亡1只，中剂量组死亡2只，低剂量组死亡2只。3.2　对大鼠肝脏病理学结构变化的影响HE染色结果显示，空白组大鼠肝细胞形态正常，未见纤维组织增生，肝索和肝血窦以中央静脉为中心呈放射状分布；模型组大鼠出现结缔组织增生，形成纤维间隔，肝细胞严重发生脂肪变，同时炎性细胞浸润，形成假小叶。与模型组比较，秋水仙碱组结缔组织增生和炎性浸润情况明显改善，有少量脂滴；舒肝化癥方高剂量组可见少许结缔组织增生，肝细胞形态较正常，可见少量脂滴，与秋水仙碱组接近；舒肝化癥方中剂量组观察到纤维间隔增生程度明显加重，炎细胞渗入增多，肝细胞的脂肪变化程度明显加深；舒肝化癥方低剂量组假小叶形成，胶原纤维增生明显伴有炎性细胞浸润，肝细胞重度脂肪变，见图1。HE染色纤维化评级表述如下：空白组S0、G0；模型组S3、G3；秋水仙碱组S1、G1；舒肝化癥方高剂量组S1、G1；舒肝化癥方中剂量组S2、G2；舒肝化癥方低剂量组S3、G3。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.F001图1舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝脏组织病理变化的影响 （HE，×400）Fig.1Effect of Shugan Huazheng prescription on pathological changes of liver tissue in rats with liver fibrosis （HE，×400）注：A.空白组；B.模型组；C.秋水仙碱组；D.舒肝化癥方高剂量组；E.舒肝化癥方中剂量组；F.舒肝化癥方低剂量组（图2和图3同）3.3　对大鼠肝组织中HYP、AngⅡ的影响ELISA实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织中HYP和AngⅡ的表达水平明显增加（P0.05）；与模型组比较，各给药组HYP和AngⅡ的表达水平均明显下降（P0.05），其中秋水仙碱组和舒肝化癥方高剂量组的下降幅度尤为显著。见表2。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.T002表2舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝组织中HYP和AngⅡ的影响 （x¯±s）Table 2Effect of Shugan Huazheng prescription on HYP and AngⅡ in liver tissue of rats with liver fibrosis （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1HYP/μg·L-1AngⅡ/ng·L-1空白组93.56±0.14151.90±7.19模型组611.22±0.321）642.70±23.621）秋水仙碱组90.000 26.02±0.272）381.70±31.242）舒肝化癥方高剂量组829.527.27±0.292）414.90±8.392）舒肝化癥方中剂量组714.768.34±0.272）545.80±25.632）舒肝化癥方低剂量组77.389.73±0.142）547.20±13.832）注：与空白组比较1）P0.05；与模型组比较2）P0.05（表3-表5同）3.4　对大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1 mRNA表达水平的影响Real-time PCR结果显示，与空白组比较，模型组大鼠肝组织HIF-1α、VEGF和TGF-β1 mRNA表达水平明显增加（P0.05）；与模型组比较，不同药物干预后，HIF-1α、VEGF、TGF-β1 mRNA的表达水平均下降，但程度有所不同，在HIF-1α的mRNA表达方面，只有秋水仙碱组和舒肝化癥方高剂量组的下降幅度尤为明显（P0.05），而舒肝化癥方中、低剂量组没有统计学意义；在VEGF和TGF-β1 mRNA表达水平方面，秋水仙碱组和舒肝化癥方高、中、低剂量组均与模型组之间存在显著差异（P0.05）。见表3。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.T003表3舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF和TGF-β1 mRNA的影响 （x¯±s，n=3）Table 3Effect of Shugan Huazheng prescription on HIF-1α， VEGF and TGF-β1 mRNA in liver tissue of rats with liver fibrosis （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1HIF-1αVEGFTGF-β1模型组4.25±1.101）11.00±4.041）13.78±2.351）秋水仙碱组0.000 21.92±1.042）1.46±0.502）1.01±0.212）舒肝化癥方高剂量组29.522.19±0.152）1.79±0.672）2.95±0.192）舒肝化癥方中剂量组14.763.02±0.162.20±0.672）4.45±0.592）舒肝化癥方低剂量组7.383.10±0.174.26±3.262）8.87±3.442）注：设空白组各指标mRNA表达均为13.5　对大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达的影响免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达明显增多（P0.05）；与模型组比较，秋水仙碱组和舒肝化癥方各剂量组VEGF蛋白表达明显减少（P0.05），秋水仙碱组和舒肝化癥方高、中剂量组HIF-1α、TGF-β1蛋白表达明显减少，差异具有统计学意义（P0.05）。见图2、表4。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.F002图2舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF和TGF-β1蛋白表达的影响 （免疫组化，×400）Fig.2Effect of Shugan Huazheng prescription on HIF-1α， VEGF and TGF-β1 protein expression in liver tissue of rats with liver fibrosis （IHC，×400）10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.T004表4舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF和TGF-β1蛋白阳性表达的影响 （x¯±s）Table 4Effect of Shugan Huazheng prescription on absorbance values of HIF-1α， VEGF and TGF-β1 protein in liver tissue of rats with liver fibrosis （x¯±s）组别n剂量/g·kg-1HIF-1αVEGFTGF-β1空白组90.021±0.0010.033±0.0030.028±0.001模型组60.058±0.0011）0.073±0.0021）0.063±0.0011）秋水仙碱组90.000 20.031±0.0012）0.033±0.0022）0.029±0.0012）舒肝化癥方高剂量组829.520.032±0.0022）0.034±0.0032）0.036±0.0012）舒肝化癥方中剂量组714.760.034±0.0012）0.046±0.0042）0.039±0.0052）舒肝化癥方低剂量组77.380.057±0.0010.052±0.0022）0.062±0.0023.6　对大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达水平的影响Western blot研究结果显示，与空白组比较，模型组HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达水平明显上升（P0.05）；与模型组比较，各用药组HIF-1α、VEGF、TGF-β1蛋白表达水平均下降，但程度有所不同，其中尤以秋水仙碱组和舒肝化癥方高、中剂量组下降趋势最明显（P0.05）。见表5、图3。10.13422/j.cnki.syfjx.20232140.T005表5舒肝化癥方对肝纤维化大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF和TGF-β1蛋白表达的影响 （x¯±s，n=3）Table 5Effect of Shugan Huazheng prescription on HIF-1α， VEGF and TGF-β1 protein expression in liver tissue of rats with liver fibrosis （x¯±s，n=3）组别剂量/g·kg-1HIF-1α/GAPDHVEGF/GAPDHTGF-β1/GAPDH模型组1.67±0.181）2.26±0.391）2.38±0.171）秋水仙碱组0.000 21.17±0.092）1.14±0.152）1.10±0.162）舒肝化癥方高剂量组29.521.36±0.052）1.30±0.152）1.44±0.222）舒肝化癥方中剂量组14.761.39±0.032）1.46±0.182）1.56±0.332）舒肝化癥方低剂量组7.381.48±0.041.63±0.292）1.90±0.47注：设空白组各指标蛋白表达均为110.13422/j.cnki.syfjx.20232140.F003图3肝纤维化大鼠肝组织中HIF-1α、VEGF和TGF-β1蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of HIF-1α， VEGF and TGF-β1 protein expression in liver tissue of rats with liver fibrosis4 讨论肝纤维化是存在于多数慢性肝病中的基本病理变化，而出现的肝窦毛细血管化和病理性血管增生，在肝纤维化的发展中是重要的病理学改变。这些变化的特点是肝窦内皮细胞失去窗孔，形成有组织的基底膜，从而减少了血液与组织细胞之间的物质交换，包括出现乏氧环境，导致微血管结构发生改变，微循环出现障碍。仝小林教授认为，脏器纤维化的病理基础与微循环障碍密切相关，且其可归属于中医“络病”范畴，病位在络脉，进程符合中医“久病入络”之病机［10］。“络脉”概念首见于《黄帝内经》，络脉把在经脉中线性运行的气血面性弥散到全身，起到布散气血津液、提供营养交换、连接脏腑器官和全身百骸的作用，类似于微血管［11］。肝纤维化的病理特征从中医角度来看归属于肝络病范畴，现代医学亦认为，肝络指的是分布在肝脏区域的小血管、微血管和微循环，这些肝络具有滋养肝脏和调节肝脏代谢的功能。肝的络脉从经脉别出，因与肝血、肝气相通，故可分为血络和气络。血络如肝窦，负责承载和输送血液，气络如肝窦内的细胞，作用是维持血络的结构并提供动力［12］。肝纤维化和络病之间的关系可以通过“慢性肝病-肝纤维化-肝硬化”与“气滞-入络-血瘀”相一致来解释。根据中医理论的观点来看，肝纤维化是沿着“湿-热-毒-瘀-虚”这条轴线进行的，其基本病机是“正虚血瘀，虚损生积”。肝络发病最开始为湿热等外邪使得气血运行异常，进一步诱发痰瘀的产生，久则络脉瘀阻，渐渐耗伤正气，直至肝络虚损。而在肝纤维化后期瘀和虚互结的病理阶段中，瘀血作为产生虚的病因，同时也是虚的病理产物，贯穿肝纤维化发病的全过程，随着两者的互相作用和恶性循环，使得慢性肝病中肝损较重的一种病因就是肝病血瘀证。此外，肝纤维化的进展也受到该病因的显著影响［13］。并且络病理论的“经虚络瘀”和肝纤维化的“虚损生积”相合。国医大师周信有教授认为湿热挟毒，邪毒留连是致使各种病毒性肝炎发生的主要原因；正气虚损和免疫功能低下是导致疾病发作的重要机制；肝失调达，气滞血瘀是其基本病理变化［4］，所以撷取茵陈蒿汤、四逆散、逍遥散、枳术丸、保元汤、当归补血汤诸方之长，并结合周老本人长期临床经验加减化裁出舒肝化癥方，主治各类急性和慢性病毒性肝炎、早期肝硬化、肝脾肿大和肝功能异常等疾病。方中的药物包括茵陈、板蓝根、茯苓，用于清热利湿，抑制病毒；柴胡能够调达肝气，而党参、白术、女贞子、五味子、黄芪则能够扶正补虚；当归、丹参、莪术则具有养血、调肝的作用，同时还能和血祛瘀，此外，还可以扩张肝脏血管，改善肝脏的营养和氧气供应，以预防纤维组织增生，全方共奏“解毒化湿、补虚、祛瘀”之效。HIF-1是由α亚基与β亚基两部分组成，其中起关键作用的是α亚基，在常氧状态下，HIF-1α的含量是极低的［14］，相反，在缺氧状态下其含量很高［6］，有研究表明，在由CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠肝组织中可以检测到HIF-1α高表达。在对正常肝细胞进行缺氧处理后，可以观察到HIF-1α升高，并且VEGF和TGF-β1也有着高表达的趋势，之后，采用序列特异性siRNA抑制HIF-1α，VEGF和TGF-β1表达降低，这表明VEGF和TGF-β1可能是HIF-1α的下游靶基因［6］。VEGF是血小板衍生生长因子家族中的一个成员，具有刺激内皮细胞的分裂、增殖作用，并能够抑制内皮细胞的凋亡，同时，还可以提高血管的通透性，促进内皮细胞的迁移，诱导血管生成［15］，同时研究表明，VEGF的表达和肝纤维化的严重程度成正相关［16］。当肝脏缺氧时，HIF-1α会促进VEGF水平升高，缺氧加速病理性血管新生从而促进肝纤病程［17］。TGF-β1参与机体免疫、炎症、细胞凋亡、分化等多个领域，对肝纤维化的形成也起关键作用［6］。在肝纤维化进程中，HIF-1α可以上调VEGF和TGF-β1的表达，进而促进肝星状细胞活化，产生ECM，形成肝脏纤维化。在这一过程中，一方面HIF-1α促进VEGF上调，会导致肝窦内皮细胞失窗孔，进而发生血管重构；另一方面病理性血管新生导致血管结构改变，出现血管增生，微循环障碍，物质交换减少，出现机体缺氧状态，两者构成恶性循环，加重肝纤维化的病程［18-19］。缺氧微环境这一过程和中医辨证论治中的“气虚血瘀”息息相关［20-21］，气虚不能够给予细胞足够的氧气供应，加重了缺氧微环境状态，中医认为，气为血之帅，气可以推动血液的运行，当气虚无力推动时，血液停滞不行，形成血瘀证，相反，瘀血这个病理产物也会阻碍气的运行，且血为气之母，瘀血作为病理产物不具备生气的功能，会出现气虚的病理改变，即病理性血管新生可促进缺氧状态。在对中药复方和单味中药的研究中发现，舒肝化癥方中丹参的主要成分丹参酮ⅡA被动物实验证实可显著降低HIF-1α、VEGF、TGF-β1的表达［22-23］，也可降低HYP、AngⅡ在肝组织中的含量［23］；当归阿魏酸、五味子甲素、柴胡皂苷D能降低促纤维化因子TGF-β1在肝组织中的蛋白和基因的表达［24-26］；莪术提取物通过抑制AngⅡ的产生，减少其分泌量，以及下调TGF-β1的纤维化效应，来实现抗肝纤维化的作用［13，27］；黄芪有效成分可以抑制VEGF和TGF-β1在肝组织中的表达，抑制血管增生和减少微血管阻碍［28-29］；还有实验结果表明，当归补血方和以疏肝化瘀益气法为指导的软肝散能够降低HIF-1α和VEGF的表达水平，从而发挥抗肝纤维化作用，其作用机制涉及改善组织缺氧和抑制血管生成等方面［12，30］，化瘀通络解毒颗粒和鳖甲煎丸可以降低肝纤维化组织中TGF-β1的水平从而达到抗纤作用［31-32］。本研究中通过对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织病理切片的观察，发现明显的纤维间隔形成表明纤维化造模成功［33］，HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，其含量是反映纤维化程度的一项重要指标，且有研究证实AngⅡ是引起肝损伤肝组织纤维化的核心环节之一［34］。检测肝组织中HYP和AngⅡ的含量，发现其升高，HIF-1α、VEGF和TGF-β1的蛋白和mRNA表达水平也均升高，推测在CCl4作用下肝脏损伤，形成肝纤维化，肝脏处于缺氧状态，HIF-1α活化并激活下游靶基因VEGF和TGF-β1，使得VEGF促进病理性血管增生和重构，TGF-β1促进细胞炎性表达，出现炎性浸润。由于秋水仙碱对改善肝纤维化有益，因此在实验中选择将秋水仙碱作为阳性药，在这项研究中，笔者使用了西药秋水仙碱和不同剂量的舒肝化癥方对CCl4诱导的肝纤维化大鼠进行干预，结果显示，秋水仙碱和舒肝化癥方都能够发挥显著的抗肝纤维化的作用，使得HYP和AngⅡ的含量降低，且HIF-1α、VEGF和TGF-β1的蛋白和mRNA表达水平也下降，其中，秋水仙碱和舒肝化癥方高剂量组下降最明显，且基本等效，治疗效果优于舒肝化癥方中、低剂量。通过实验结果得出结论，舒肝化癥方能够对CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠的生理状况、肝组织病理损伤及纤维化程度、肝脏胶原纤维、缺氧状态、血管增生、炎性反应等病理表现具有改善作用，下调HIF-1α/VEGF/TGF-β1通路上关键蛋白HIF-1α、VEGF和TGF-β1的表达水平，这可能与改善肝组织缺氧状态、抑制血管增生和重构有关，是舒肝化癥方抗肝纤维化的作用机制之一，且此信号通路发挥作用的机制可能与改善肝纤维化气虚血瘀证候有关。本实验创新之处在于将HIF-1α/VEGF/TGF-β1信号通路与络病、肝纤维化气虚血瘀证候和周信有教授舒肝化癥方中侧重于益气化瘀之法联系起来，证明此条信号通路是通过改善肝组织缺氧、抑制血管增生来表达效果。但因为肝纤维化的病理机制和复方舒肝化癥方的复杂性，是否有其他信号通路可以验证舒肝化癥方抗肝纤维化的作用有待进一步研究。