癌症已成为全球主要的公共卫生问题，目前癌症治疗方案以放化疗、靶向治疗和中医药辅助治疗的综合疗法为主。中药天然产物能够在癌症临床中发挥显著的减毒增效作用，大量研究已经证实，中药单体在体外和体内均具有抗肿瘤活性，包括抗增殖、促凋亡、抗转移、抗肿瘤血管生成以及调节自噬、逆转多药耐药、平衡免疫、增强化疗等作用［1-2］。葫芦素来源于中药葫芦科植物，是一种高度氧化的四环三萜类化合物，目前葫芦素家族已经分离到葫芦素A-T共12类化合物，涉及到200多种衍生物［3］。葫芦素具有广泛的药理学活性，除抗菌、抗炎、护肝、抗心肌纤维化、抗疟、增强细胞免疫功能以外，抗肿瘤作用显著［4-11］。早在20世纪80年代，葫芦素片［含葫芦素B（CuB）和葫芦素E（CuE）］已在中国研发并应用于临床，当时主要用于肝炎和原发性肝癌的辅助治疗［12］。近几年，天然和半合成的葫芦素越来越受到重视，因其具有显著的细胞毒性而有望开发成为抗癌新药的候选药物［3，13-14］。本文主要对葫芦素的抗肿瘤作用研究进展进行综述，为葫芦素类抗肿瘤新药研发提供参考。1葫芦素的抗肿瘤作用在葫芦素家族中，CuB占有重要地位，其次为CuE，近几年，对葫芦素D（CuD）和葫芦素I（CuI）的研究也逐渐增多。在单独及联合用药进行体内、体外实验研究中发现，以上几种葫芦素的抗肿瘤作用相当广泛，特别是在消化系统、呼吸系统、生殖系统、血液系统、泌尿系统等肿瘤疾病中发挥了重要作用［15-42］。见表1。.T001表1葫芦素抗肿瘤作用Table 1Anti-tumor effect of cucurbitines疾病分类细胞类型葫芦素种类消化系统人结肠癌SW480细胞，Caco-2细胞；人肝癌BEL-7402细胞，HepG2细胞；胰腺癌细胞，人胃癌BGC-823细胞，AGS细胞；食管癌Eca109，EC9706细胞CuB，CuE呼吸系统人肺癌NCI-H460细胞，H-460细胞，非小细胞肺癌A549和NSCLC-N6细胞；喉鳞状细胞癌Hep-2细胞；人鼻咽癌KB，CNE2细胞；人口腔鳞癌SAS，Bca，Tca8113，CD885细胞；人喉癌干细胞CuB，CuE，CuD生殖系统人卵巢癌ES-2细胞，人乳腺癌Bcap-3细胞，人宫颈癌HeLa细胞，子宫内膜癌细胞，宫颈癌移植瘤CuB，CuE，CuD血液系统淋巴瘤细胞，T细胞白血病细胞，急性髓系粒细胞白血病CuB，CuD泌尿系统前列腺癌细胞，人膀胱癌T24细胞CuE其他黑色素瘤细胞，皮肤鳞状细胞癌，多形性胶质母细胞瘤细胞，骨肉瘤SW 1353，143B，MG63，HOS，SAOS-2和HUO9细胞，人类表皮样癌，人神经癌SF-268细胞CuB，CuD，CuI抑制肿瘤细胞增殖一直是肿瘤治疗的重要方面，葫芦素能够明显抑制肿瘤细胞增殖，对于罕见恶性肿瘤甚至有特异性作用。KONG等［34］对于12种葫芦素类化合物的抗癌活性进行了比较研究，最终证实CuE对癌细胞的抑制作用最强而且广泛，对人乳腺癌MCF7细胞，前列腺癌PC3细胞，胃癌NCI-N87细胞，三阴乳腺癌中5种细胞MDA-MB-468，MDA-MB-231，HCC1806，HCC1937，SW527的增殖皆有明显的抑制作用。何翠颖［38］的研究对比了CuD与CuI对人T细胞淋巴瘤细胞株Hu T78，Hu T102，MT-2，MT-4及T细胞淋巴瘤患者外周血淋巴细胞增殖抑制作用，发现CuI作用强于CuD。骨肉瘤（OS）作为一种罕见的恶性肿瘤，CuI对于5种常见骨肉瘤细胞系143B，MG63，HOS，SAOS-2，HUO9细胞均有明显的增殖抑制作用，很有可能作为一种新型的骨肉瘤治疗药物［40］。葫芦素不仅可以单独使用直接杀伤肿瘤细胞，还可以与放化疗联合使用起到增效减毒的作用。研究证实，CuB与吉西他滨，阿霉素、多西他赛等化疗药物联合使用达到协同抗肿瘤作用，它可以通过下调磷酸化信号转导与转录激活因子3（p-STAT3），B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2），细胞周期蛋白B1（cyclinB1）蛋白的表达，显著抑制胰腺癌细胞、肝癌H22细胞、喉癌细胞、非小细胞肺癌A549细胞等的增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡［43-45］。相关报道CuB可以增加食管癌、乳腺癌对放射治疗的敏感性，提高放疗效果［26，36］。此外，CuB的衍生物与3种化疗药物顺铂、伊立替康和紫杉醇协同作用，通过调控凋亡抑制基因存活素（Survivin），p53表达，细胞骨架蛋白（F-actin）发挥对非小细胞肺癌A549细胞的抗增殖作用，导致G2/M细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡［46］。对于同一类型细胞，葫芦素与化疗药物联合应用的效果也不尽相同。杨艳等［27］研究了CuE联合顺铂（DDP）或紫杉醇（PTX）对非小细胞肺癌A549和H460细胞增殖的抑制作用，CuE与DDP合用有协同抗肿瘤作用，CuE与PTX合用在较低剂量时表现为协同作用，而中高剂量时则表现为拮抗作用。此外，CuE对于乳腺癌化疗过程中出现多重耐药现象表现出了显著的细胞毒活性，研究发现CuE是P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）的底物，是乳腺癌耐药蛋白ABCB5转运蛋白的有效抑制剂，通过比较得出CuA，CuB，CuE，CuD，CuI和CuK皆参与了调控了细胞周期、细胞黏附和细胞内通讯相关的共同基因［47］。2葫芦素抗肿瘤作用相关机制2.1抑制增殖，阻滞细胞周期细胞死亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。肿瘤细胞周期调控点失调，凋亡抑制，造成肿瘤细胞失控性生长，因此肿瘤是一类细胞周期疾病［48］。CuB［21，26，28-29，41，49-51］，CuD ［19，25，33］，CuE ［34，52-54］和CuA［55］等能够明显阻滞肿瘤细胞周期，抑制细胞分裂和增殖。见表2。.T002表2葫芦素对肿瘤细胞周期的阻滞作用Table 2Tumor cell cycle arrest by cucurbitines葫芦素细胞类型抑制增殖，阻滞细胞周期CuB人胃癌BGC-823细胞阻滞在G0/G1期食管癌Eca109细胞阻滞在G1/S期；诱导p21的表达人肺癌A549细胞阻滞在G2/M期；抑制STAT3的磷酸化，下调cyclinB1的表达喉鳞癌细胞及裸鼠移植瘤阻滞在G2/M期；抑制STAT3信号通路的活化，抑制cyclinB1的表达神经母细胞瘤SH-SY5Y阻滞在G2/M期人白血病K562细胞阻滞在G2/M期；抑制STAT3的激活和Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路髓性白血病细胞阻滞在G1/S期卵巢癌SKOV3细胞阻滞在G2/M期；抑制STAT3的表达CuD子宫颈癌细胞阻滞在G1/S期；抑制E6，细胞周期蛋白D1（cyclinD1），CDK4，pRb，Rb的表达，诱导p21，p27蛋白水平非小细胞肺癌NSCLC-N6细胞阻滞在G1/S期；诱导周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）过表达乳腺癌MCF7/ADR细胞阻滞在G2/M期CuE三阴性乳腺癌MDA-MB-468和SW527细胞阻滞在G2/M期；下调CDK1，Survivin，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白人口腔鳞癌SAS细胞阻滞在G0/G1期人白血病HL-60细胞，K562细胞阻滞在G2/M期；诱导真核细胞起始因子2α(eIF2α)的磷酸化，下调CDK1，上调p21肝癌Bel7402，HepG2细胞阻滞在G2/M期；下调CDK1，上调p21CuA卵巢癌SKOV3细胞阻滞在G2/M期；抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/抑制蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路关键蛋白的表达2.2 　诱导细胞凋亡和自噬性死亡肿瘤细胞的生成与丢失是导致肿瘤生长速度的一个重要因素，细胞凋亡和自噬是细胞丢失的主要形式，二者都属于程序性细胞死亡。凋亡异常可以使突变细胞增殖失控而导致肿瘤发生；自噬对于肿瘤细胞存在双向效应，正常的细胞自噬可以抑制肿瘤的形成，而自噬障碍则会增加氧化应激和致瘤性突变的积累［56］。在肿瘤发展的不同阶段，自噬活性不同，并且在肿瘤转移期间自噬活性显著增加［57］。CuB［58-61］，CuE［62-63］，CuD［20，32-33，37，64］和CuI［65］已被公认为多种癌细胞系的凋亡诱导物，通过不同的途径在诱导自噬中也发挥了重要作用。微管相关蛋白1轻链3（LC3）和自噬相关蛋白7重组蛋白（Atg7）是细胞自噬过程中的关键蛋白和重要基因。炎症等不利因素可激活细胞自噬，Atg7被磷酸化，导致LC3-Ⅰ的泛素化，最终形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ常被用作自噬标志物［66］。葫芦素不仅能影响LC3-Ⅱ的表达，诱导活性氧（ROS）介导的自噬，还能通过腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）依赖的蛋白激酶（AMPK）/mTOR/p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）信号通路调节自噬的上游机制［61，65，67-71］。除了LC3和Atg7以外，STAT3信号通路也与自噬过程的多个方面都有关联，STAT3的不同亚细胞定位模式以不同方式影响自噬，葫芦素亦会通过阻断STAT3信号来发挥抗肿瘤作用，这必然会影响自噬途径［15，65，72-73］。见表3。.T003表3葫芦素对肿瘤细胞凋亡的诱导作用Table 3Induction effect on tumor cell apoptosis by cucurbitines葫芦素细胞类型机制CuB喉鳞癌细胞及裸鼠移植瘤抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达人胃癌BGC-823细胞调控Caspase-3，Caspase-9活性；上调促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达神经母细胞瘤SH-SY5Y调控Caspase-3，Caspase-9的活性，引起SH-SY5Y细胞内的ROS积累，线粒体膜去极化和胞浆内Ca2+浓度升高人乳腺癌MCF-7细胞通过线粒体途径参与CuB诱导的细胞凋亡急性髓系淋巴细胞性白血病通过诱导癌性抑制因子（CIP2A）/蛋白磷酸酶2A（PP2A）/干细胞生长因子受体（C-KIT）信号通路下调激活凋亡人白血病K562细胞通过显著增加ROS的生成诱导凋亡乳腺癌细胞增加细胞内LC3-Ⅱ含量，诱导乳腺癌细胞自噬急性T细胞白血病Jurkat细胞诱导保护性自噬人顺铂耐药胃癌SGC7901细胞抑制CIP2A/PP2A/mTORC1信号通路诱导细胞自噬和凋亡CuE人白血病细胞上调eIF2α，Bax蛋白及p21，p27，p53基因；抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，XIAP，Survivin和髓样细胞白血病蛋白-1（Mcl-1）的表达；活化Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9人肝癌HepG2细胞诱导细胞凋亡蛋白Bax的表达和Caspase的活化人口腔鳞状细胞癌SAS细胞通过激活Caspase-3诱导凋亡三阴性乳腺癌MDA-MB-468，SW527细胞下调Bcl-2，Mcl-1蛋白表达乳腺癌Bcap-37，MDA-MB-231细胞诱导Caspase-3裂解，上调p27和p21的表达，抑制STAT3磷酸化诱导凋亡非小细胞肺癌A549细胞阻断STAT3和Raf/MEK/ERK信号通路，激活 Fas 信号通路人膀胱癌T24细胞上调LC3A/BⅡ表达，下调p62表达诱导自噬人宫颈癌HeLa细胞通过降低mTORC1下游底物ULK1S757的磷酸化水平来抑制mTORC1活性，从而诱导细胞完整的自噬进程人肺癌NCI-H460细胞降低细胞线粒体膜电位，激活CaspaseCuD肝癌 Hep3B细胞活化Caspase-3，磷酸化 c-Jun氨基末端激酶（JNK）诱导凋亡子宫内膜癌和卵巢癌抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl表达乳腺癌MCF7/ADR细胞激活Caspase，降解聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）诱导内源性细胞凋亡；抑制STAT3易位和核转录因子-κB(NF-κB)转录T细胞白血病抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl表达人胃癌AGS，SNU1，Hs746T细胞激活线粒体凋亡通路，上调Bax，释放Caspace-9和细胞色素C，下调Bcl-2CuB，CuI人宫颈癌HeLa细胞通过线粒体衍生的ROS的生成增强以及ERK和JNK的激活来介导，诱导自噬和细胞死亡2.3 　抑制细胞迁移和侵袭肿瘤细胞迁移和侵袭是造成其不良预后的关键因素，在肿瘤组织中，细胞骨架主要参与受体介导的信号传导细胞的迁移和浸润的调节。细胞骨架是传导细胞内外传递信号的主要载体，包括微丝，微管和中间丝的纤维网络［74］。相关研究表明，葫芦素能够影响肌动蛋白细胞骨架，调节细胞形态，迁移，黏附和相关基因表达，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，发挥抗肿瘤作用［74-76］。在近现代研究中，已发现紫杉类，长春碱类和葫芦素B是微管靶向药物［24］。CuB［77-85］，CuE［86-91］针对抑制细胞迁移和侵袭研究最多，其次为CuI［76，92-93］和CuD［94］。见表4。.T004表4葫芦素对肿瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用Table 4Inhibitory effect of cucurbitines on tumor cell migration and invasion葫芦素细胞类型抑制细胞迁移和侵袭CuB膀胱癌T24细胞调控HERG1基因骨肉瘤143B细胞Akt信号通路的活性和上皮-间质转化乳腺癌细胞通过RAC1/CDC42/RhoA信号通路介导乳腺癌细胞骨架蛋白的重组和分布，改善细胞黏附和变形的机械性能；促进p21/（Waf1）和p27（Kip1）的表达，抑制Survivin的表达人胶质母细胞瘤U87细胞抑制整合素α5β1介导的U87细胞的黏附结直肠癌细胞抑制Yes相关蛋白（YAP）及其下游靶基因Cyr 61和c-Myc的表达，上调大肿瘤抑制基因1（LATS1）的表达非小细胞肺癌细胞抑制CIP2A/PP2A/Akt信号轴和Wnt/β-catenin信号转导轴；靶向线粒体热休克蛋白mortalin，p53，不均一性核糖核蛋白K（hnRNP-K），血管内皮生长因子（VEGF），基质金属蛋白酶2（MMP-2）和纤连蛋白CuE骨肉瘤MG63和U2OS细胞抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路结肠癌Caco-2细胞抑制LIMK/cofilin信号通路，损害细胞骨架F-actin人非小细胞肺癌脑转移抑制小鼠模型中Yes相关蛋白信号通路食管癌ECA109和EC9706细胞通过PI3K/Akt/mTOR通路抑制大鼠肉瘤病毒相关C3肉毒毒素底物1（Rac1）的表达乳腺癌细胞损害肌动蛋白相关蛋白（Arp）2/3依赖的肌动蛋白聚合，并抑制Src/黏着斑激酶（FAK）/Rac1/MMP相关通路人肝癌Huh7细胞抑制丝裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）和JAK/STAT3通路CuI结肠癌COLO205细胞下调p-STAT3和MMP-9的表达鼻咽癌细胞系激活STAT3脑胶质瘤细胞靶向LIMK-Cofilin信号通路促进细胞黏附CuD胰腺癌细胞下调黏蛋白13（MUC13）的表达2.4 　抑制肿瘤血管生成肿瘤是人体细胞分化增殖异常引起的一种恶性疾病，无论是原发性或转移性肿瘤，新生血管的形成都对其持续性生长起到了很好的促进作用，因此，抗肿瘤血管生成是治疗肿瘤的重要手段。内皮细胞的增殖是血管生成复杂过程中的重要步骤［95］。朴贤美等［96］研究表明，在体外实验中，CuD能够有效抑制内皮细胞迁移和管腔状结构的生成，从而阻碍血管生成的关键步骤。而CuB可以下调与肿瘤血管生成，肿瘤细胞转移和侵袭等相关的VEGF，MMP-2，基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和环氧化酶-2（COX-2）的表达水平，通过触发内皮细胞线粒体信号通路抑制肿瘤血管生成［41，97］。CuB通过抑制VEGF介导的黏着斑激酶（FAK）/MMP-9信号轴而抑制乳腺癌MDA-MB-231和4T1细胞转移和血管生成［98］。DONG等［99］报道，CuE通过抑制两面神激酶（JAK）/STAT3与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）介导的有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路而发挥抗肿瘤细胞血管生成的作用。CuI则通过抑制VEGFR-2，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和STAT3的磷酸化水平来抑制肿瘤血管生成［100-101］，CuI是否可以作为癌症治疗中血管生成抑制剂值得进一步研究。2.5 　调节活性氧（ROS）的水平ROS主要是细胞线粒体电子传递链产生的活性含氧物质。ROS浓度不同，作用也存在差异，ROS既会导致细胞在分裂、增殖的过程中发生的基因突变，也会引起细胞DNA，蛋白质，脂质的损伤，导致细胞死亡［102］。肿瘤相关基因可以诱导活性氧物质的产生，继而激活参与肿瘤发生的信号传导途径［101］。对于葫芦素调节活性氧的研究，主要是CuB。YASUDA等［103］研究发现CuB可以引起人结肠癌SW480细胞内ROS升高，并以ROS依赖的方式诱导细胞凋亡。针对ROS介导的不同细胞过程，CuB可以起到不同的作用，通过FAK而抑制ROS介导的乳腺癌MDA-MB-231细胞转移，亦可诱导乳腺癌MCF-7细胞ROS介导的自噬和DNA损伤［104-105］。CuB对小鼠黑素瘤B16F10细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力均有抑制作用，其机制可能与促使ROS依赖性肌动蛋白在黑色素瘤细胞中聚集，诱导G-actin池的快速消耗有关［106］。除CuB外，CuE也可以诱导ROS介导的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）依赖性细胞凋亡和保护性自噬［107］。由此可见，ROS对于肿瘤来说既是矛也是盾，ROS的水平不同对细胞的影响不同。对于肿瘤而言，可通过调节ROS的水平来达到治疗的目的。2.6 　调节免疫恶性肿瘤的发生发展与免疫系统密切相关，肿瘤细胞可以通过多种机制实现免疫逃逸并诱导免疫抑制。葫芦素会影响抑制免疫系统的细胞因子和转录因子的产生，这些机制可能有助于预防癌症的发生。有研究报道，葫芦素类可抑制有丝分裂原诱导的Ｔ淋巴细胞的増殖［108］。具体而言，CuB可以促进肺癌患者树突状细胞的分化和抗肿瘤免疫，CuD在巨噬细胞中启动免疫调节活性，可导致炎性小体的激活和脂多糖（LPS）信号的增强，CuE可激发慢性肝炎患者的细胞免疫功能［109-111］。另有研究报道，CuI与白细胞介素-15（IL-15）联合治疗对人体免疫也存在影响，在分化抗原4阳性（CD4+）和分化抗原8阳性（CD8+）的T细胞分化增加的淋巴瘤中表现出免疫抗肿瘤活性，并通过上调TNF- α表达促进树突状细胞（DC）的功能［10］。目前，葫芦素提高免疫功能的机制尚不清楚，但其抗肝炎和抗肿瘤作用可能与免疫功能的改善有关［112］。3小结与展望2019年国家癌症中心发布的数据表明，癌症以逐年提升的发病率和死亡率成为威胁人类健康的重大疾病，寻找安全有效的抗癌药物是全球关注的焦点［113］。化疗药物是肿瘤治疗中最重要的方式之一，但药物毒副作用大，严重影响患者的生活质量，且存在不同程度的耐药性，疗效逐渐进入平台期。靶向药物是抗肿瘤药物研究的一大突破，但肿瘤的发生发展涉及多阶段、多个基因及多条信号通路的异常，机制复杂，使靶向药的研发和应用受到限制［114-115］。因此，具有抗肿瘤作用的植物药引起了人们的广泛关注，紫杉醇类［116］、长春碱类［117］、鬼臼素类［118］、人参皂苷和多糖［119］等药物的出现给肿瘤治疗带来了新的希望。葫芦素不仅可以显著抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和自噬性死亡、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成，调节活性氧的水平、调节免疫，有效抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为，而且有效调控肿瘤相关的多条分子信号通路，从分子水平干扰细胞的恶性转化，并控制肿瘤的形成和发展。综上所述，葫芦素是一种潜在的多靶点抗肿瘤药物，而且因剂量、细胞类型、作用时间的不同药物的作用也存在差异，甚至是双向影响，其中的机制需要进一步探讨。葫芦素对免疫系统的调控，对活性氧的影响及抑制肿瘤血管生成的机制尚不明确，对分子信号通路的调控各个癌症类型之间差异较大，不同的信号通路相互交联，呈现出网状调控结构共同发挥抗肿瘤作用。所以，要实现葫芦素的临床运用，针对不同的肿瘤类型，体内外药理作用、安全性和作用机制仍需要深入研究。