본 연구의 목적은 태산 반석산(TSPSP)이 인간 융모막 영양층 세포(HTR-8/SVneo)의 산화 스트레스 손상을 억제하는 역할과 기전을 탐구하고, TSPSP가 자연 유산(SA)을 치료하는 기전을 이해하는 것이다. 임상 데이터베이스(GEO)를 활용하여 SA에 관한 유전자 차이 분석을 수행하고 산화 스트레스와 연관성을 분석하였다. 네트워크 약리학 방법으로 TSPSP의 활성 성분을 선별하고 “중약-성분-표적-질병” 네트워크를 구성하여 TSPSP 작용 기전을 예측하였다. 시험관 내 실험에서 HTR-8/SVneo 세포를 대조군, 모델군, TSPSP 함유 혈청 2.5%, 5%, 10% 군 및 Nrf2 억제제군(ML385, 30 μmol/L)으로 나누었다. 대조군을 제외한 모든 군에 150 μmol/L H2O2를 3시간 자극하여 세포 산화 스트레스 손상 모델을 구축하였다. 모델 구축 완료 후, 대조군과 모델군에는 10% 빈 혈청을 처리하였고, TSPSP 함유 혈청군에는 각각의 농도에 맞는 약물 혈청을 처리하였다. Nrf2 억제제군은 10% TSPSP 혈청 처리와 더불어 30 μmol/L ML385를 추가하였다. 모든 군의 세포는 상기 조건에서 24시간 배양 후 시료를 수집하여 후속 검사를 실시하였다. 세포 증식 활성(CCK-8) 검사, 세포 이동률(스크래치 실험), 말론디알데하이드(MDA), Fe2+, 글루타티온(GSH) 함량(ELISA), 세포 내 활성 산소(ROS) 수준(DCF-DA), Kelch 유사 ECH 연관 단백질 1(KEAP1), Nrf2, FoxO3 단백질 및 mRNA 발현(면역형광, 실시간 형광 정량 PCR), 단백질 면역 블로팅(Western blot)을 통한 KEAP1, Nrf2, FoxO3, GPX4, SOD 단백질 발현 수준을 평가하였다. GEO 데이터베이스 분석 결과 GSE76862 및 GSE22490에서 KEAP1, Nrf2, FoxO3 유전자가 질병과 관련 있음을 확인했고, 산화 스트레스 경로와 일치하는 9개의 유의미한 경로(P<0.05)를 확인하였다. 네트워크 약리학에서 TSPSP 활성 성분 표적 246개, SA 관련 표적 2804개를 확인하였고 교집합 결과 154개의 잠재 표적을 얻었다. 토폴로지 분석에서 KEAP1, Nrf2 등이 높은 중심성을 보였으며, GO 및 KEGG 풍부도 분석에서 교집합 표적이 산화 스트레스 반응, FoxO 및 MAPK 신호 경로와 관련됨을 나타냈다. 시험관 내 실험에서 대조군과 비교하여 모델군 세포 활력이 유의하게 감소(P<0.01)하였고, 모델군과 비교하여 TSPSP 함유 혈청군 세포 활력이 유의하게 증가(P<0.01)하였다. 10% TSPSP 함유 혈청군과 비교하여 ML385군 세포 활력이 약 70%로 감소(P<0.01)하였다. 대조군과 비교하여 모델군의 MDA, Fe2+, ROS 함량이 유의하게 증가하고 GSH 발현은 감소(P<0.01), 세포 이동률도 유의하게 저하(P<0.01)되었다. 모델군에서 KEAP1, FoxO3 단백질 및 mRNA 발현이 증가(P<0.01)하였고 Nrf2, GPX4, SOD 단백질 및 mRNA 발현 수준은 감소(P<0.01)하였다. TSPSP 함유 혈청군은 이와 반대로 MDA, Fe2+, ROS 함량을 유의하게 감소시키고 GSH 발현과 이동률을 유의하게 증가시켰으며, KEAP1, FoxO3 단백질 및 mRNA 발현은 유의하게 감소(P<0.05, P<0.01)하고 Nrf2, GPX4, SOD 단백질 및 mRNA 발현 수준은 유의하게 증가(P<0.05, P<0.01)시켰다. 10% TSPSP 함유 혈청군과 비교하여 ML385군은 각 지표가 역전되는 경향을 보였다(P<0.05, P<0.01). 결론적으로 TSPSP는 H2O2 유발 융모막 세포의 산화 스트레스 손상을 억제하며, 그 작용 기전은 KEAP1/Nrf2/FoxO3 신호 경로 활성화와 관련이 있을 가능성이 있다.

태산반석산; 자연유산; Kelch 유사 ECH 연관 단백질 1/핵인자 E2 관련 인자 2/포크헤드 박스 단백질 O3(KEAP1/Nrf2/FoxO3) 신호 경로; 인간 융모막 영양층; 산화 스트레스 손상