PI3K/Akt/mTOR 자가포식 관련 경로를 기반으로 한 화어해독방의 저혈당 저산소 뇌 미세혈관 내피세포 손상에 대한 영향 연구
摘要
목적은 저혈당 및 저산소(OGD) 손상 후 뇌 미세혈관 내피세포(BMECs)에 대한 화어해독방의 영향 및 중재 메커니즘을 탐구하는 것이다. 방법: 세포 증식 및 활성 검출(CCK-8)법을 사용하여 OGD 시간을 결정하고, 화어해독방 약물 혈청의 작용 농도를 선택하였다. 세포는 완전 무작위로 백혈청 배양기(무처리, KBXQ), 모델군(OGD), 화어해독방군(OGD+화어해독방 약물 혈청), 3-메틸아데닌(3-MA)군(OGD+3-MA)으로 나누었다. 도립현미경 하에서 세포 형태를 관찰하였으며, 전자현미경 하에서 세포 내 자가포식소체와 자가포식용해소체 수를 관찰하였다. CCK-8법으로 세포 생존율을 측정하였고, 현장 말단 표지법(TUNEL)으로 세포 아폽토시스율을 검출하였으며, 면역형광법으로 미세관 관련 단백질 1 소쇄쇄 3(LC3), 폐쇄단백질(Occludin) 단백질 발현을 측정하였다. 단층 세포 투과성을 측정하였다. 세포를 완전 무작위로 KBXQ군, 모델군(OGD), 화어해독방군, 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K) 억제제(LY294002)군(OGD+LY294002), 화어해독방+LY294002군(OGD+화어해독방 약물 혈청+LY294002)으로 나누었으며, 웨스턴 블롯법으로 자가포식 핵심 분자인 효모 Atg6 동종체 1(Beclin1), LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, 선택적 자가포식 접합 단백질(p62), Occludin, 인산화(p)-PI3K, PI3K, p-단백질 키나제 B(Akt), Akt, p-mTOR 및 mTOR 단백질 발현 수준을 측정하였다. 결과: OGD 6시간을 최적 모델 조건으로, 화어해독방 약물 혈청 5%를 최적 작용 농도로 선정하였다. KBXQ군과 비교했을 때, 모델군은 도립현미경 하에서 세포 손상이 뚜렷하게 관찰되었고, 전자현미경 하에서는 자가포식소체와 자가포식용해소체 수가 뚜렷하게 증가하였으며, 세포 생존율이 유의하게 감소(P<0.01), 아폽토시스율이 유의하게 증가(P<0.01), LC3 단백질 형광 강도가 유의하게 증가(P<0.01), Occludin 단백질 형광 강도가 유의하게 감소(P<0.01), 단층 세포 투과성이 유의하게 증가(P<0.01)하였다. 모델군과 비교하여 화어해독방군과 3-MA군은 세포 손상이 뚜렷하게 개선되었고, 세포 내 자가포식소체와 자가포식용해소체 수가 뚜렷하게 감소하였으며, 생존율이 유의하게 증가(P<0.01), 아폽토시스율이 유의하게 감소(P<0.01), LC3 단백질 형광 강도가 유의하게 감소(P<0.01), Occludin 단백질 형광 강도가 유의하게 증가(P<0.01), 단층 세포 투과성은 감소(P<0.05)하였다. 웨스턴 블롯 결과, KBXQ군과 비교했을 때 모델군은 Beclin1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 발현이 유의하게 증가(P<0.01), p62, Occludin, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt 및 p-mTOR/mTOR 발현 수준이 유의하게 감소(P<0.01)하였다. 모델군과 비교했을 때 화어해독방군은 Beclin1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 발현이 유의하게 감소(P<0.01), p62, Occludin, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt 및 p-mTOR/mTOR 발현이 유의하게 증가(P<0.01)하였다. LY294002군은 Beclin1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 발현이 뚜렷하게 증가(P<0.05, P<0.01), p62, Occludin, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt 및 p-mTOR/mTOR 발현이 유의하게 감소(P<0.01)하였다. LY294002군과 비교했을 때 화어해독방+LY294002군은 Beclin1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 발현이 유의하게 감소(P<0.01), p62, Occludin, p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt 및 p-mTOR/mTOR 발현이 유의하게 증가(P<0.01)하였다. 결론: 화어해독방은 OGD 손상된 BMECs에 보호작용을 가지며, 이는 PI3K/Akt/mTOR 자가포식 관련 경로를 활성화하여 자가포식 과다 발현을 억제하고 Occludin 단백질 및 내피 장벽 기능을 보호하는 것으로 보인다.
关键词
뇌 미세혈관 내피세포; 자가포식; 화어해독방; 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K); 단백질 키나제 B(Akt)