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El ácido neoclorogénico mejora la proliferación de las células de formación de queratina psoriásica y la inflamación dirigida a HSP90 para regular la vía de señalización NF-κB/NLRP3

  • role： First author第一作者
  • Affiliation：

    Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100053， China

    Artemisinin Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

  • Email：434839638@qq.com
  • Introduction：江梦瑶，在读博士，执业医师，从事中医药防治皮肤病的机制研究，E-mail：434839638@qq.com
JIANG Mengyao12,  
  • Affiliation：

    Artemisinin Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

ZHANG Xinwei2,  
  • role： Corresponding author通信作者
  • Affiliation：

    Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100091， China

  • Email：bean5@126.com
  • Introduction：杨斌，硕士，副研究员，主要从事中药药理学研究，E-mail：bean5@126.com
YANG Bin3*,  
  • role： Corresponding author通信作者
  • Affiliation：

    Guang'anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100053， China

    Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medicine， Beijing 100091， China

  • Email：songping@vip.126.com
  • Introduction：宋坪，博士，主任医师，从事中西医结合防治皮肤病研究，E-mail：songping@vip.126.com；
SONG Ping13*

resumen

El objetivo del estudio es identificar las proteínas diana y el mecanismo molecular del ácido neoclorogénico (NA) unido directamente, así como mejorar la proliferación de las células de formación de queratina psoriásica y la reacción inflamatoria. Métodos Se utilizaron células HaCaT inducidas por M5 como modelo de proliferación de queratina psoriásica y de células inflamatorias. Primero, se evaluó la viabilidad celular utilizando el kit de ensayo de proliferación y actividad celular (CCK-8) para evaluar la eficacia de la sonda sintética NA (NA-P) y del fármaco NA original sobre la viabilidad celular. En el rango de concentración segura, se evaluó la eficacia del NA y del NA-P, utilizando CCK-8 para probar el efecto de 0 a 100 μmol·L-1 de NA y de la sonda en la proliferación de las células HaCaT inducidas por M5, y se utilizó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para probar el efecto de 20, 40, 80 μmol·L-1 de NA y de 80 μmol·L-1 de NA-P en la expresión de factores inflamatorios como TNF-α, interleucina (IL)-1β, IL-23, IL-17A, y se utilizó una RT-PCR en tiempo real para probar el efecto del NA sobre la expresión de ARNm de Queratina 16 (K16), Proteína de unión al calcio S100A9 (S100A9), Proteína de unión al calcio S100A7 (S100A7), IL-6, IL-17A, y del ligando de quimiocina 1 (CXCL1) en las células HaCaT. Se utilizó la sonda NA-P para el marcado fluorescente in vitro y experimentos de competencia, y se utilizó la técnica de pull-down combinada con espectrometría de masas en fase líquida (Pull-down/LC-MS/MS) para la pesca y el análisis de proteínas diana. Se utilizaron experimentos de pull-down combinados con inmunotransferencias proteicas (Pull down-WB), análisis de transferencias térmicas celulares combinados con inmunotransferencias proteicas (CETSA-WB), y mecanismos de ligadura de moléculas para la verificación de las dianas. Finalmente, se utilizó RT-PCR en tiempo real para probar el efecto de 20, 40, 80 μmol·L-1 de NA y de 80 μmol·L-1 de NA-P en la expresión de ARNm de IL-1β, del receptor NLRP3 que se une a oligómeros de factor de necrosis tumoral activado de forma nuclear (NLRP3), y de la caspasa-1 asociada a la apoptosis (Caspase-1) en las células HaCaT; y se utilizaron inmunotransferencias proteicas (Western blot) para probar la expresión de la fosforilación de p65 (p-p65), de p65, de la fosforilación del inhibidor de la kappa B nuclear alfa (p-IκBα), del inhibidor de la kappa B nuclear alfa (IκBα), y de la proteína de choque térmico 90 (HSP90) en las células. Resultados en una concentración segura de 200 μmol·L-1, en comparación con el grupo de control, la proliferación de las células HaCaT del grupo M5, la expresión de los factores inflamatorios TNF-α, IL-1β, IL-23, IL-17A aumentó, la expresión de ARNm de K16, S100A9, S100A7, IL-6, IL-17A, CXCL1 aumentó. En comparación con el grupo M5, las células de los grupos NA-L, NA-M, NA-H, NA-P-H con 5~100 μmol·L-1 de NA y NA-P fueron inhibidas, la expresión de los factores inflamatorios TNF-α, IL-1β, IL-23, IL-17A disminuyó, la expresión de ARNm de K16, S100A9, S100A7, IL-6, IL-17A, CXCL1 disminuyó (P<0.05). Una competencia entre 200 μmol·L-1 de NA y 100 μmol·L-1 de NA-P seleccionó con éxito una proteína diana HSP90 de alta fiabilidad mediante Pull-down/LC-MS/MS. En comparación con el grupo de control, la expresión de ARNm de NLRP3, de IL-1β, de ASC, de Caspase-1 de las células HaCaT del grupo M5 aumentó, la fosforilación p-p65/p65, p-IκBα/IκBα aumentó, la expresión de la proteína HSP90 aumentó (P<0.05). En comparación con el grupo M5, las células de los grupos NA-L, NA-M, NA-H, NA-P-H disminuyeron la expresión de ARNm de NLRP3, IL-1β, ASC, Caspase-1 (P<0.05); los grupos NA-M, NA-H disminuyeron la fosforilación p-p65/p65, p-IκBα/IκBα (P<0.05), el cambio de la proteína HSP90 no fue evidente. Pull down-WB mostró que el NA puede dirigirse directamente a la proteína HSP90, y que la unión del NA a la proteína HSP90 puede reforzar su estabilidad térmica, la unión molecular a la familia de proteínas HSP90 HSP90AA1, HSP90B1 y HSP90AB1 mediante el análisis. Conclusión NA podría inhibir la proliferación de las células de formación de queratina psoriásica y la inflamación, y su mecanismo podría ser realizar la regulación de la vía de señalización NF-κB/NLRP3 mediante el objetivo directo a HSP90.

palabra clave

ácido neoclorogénico; proteína de choque térmico 90 (HSP90); vía de señalización NF-κB/NLRP3; proliferación de las células de formación de queratina psoriásica; inflamación

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