中药核酸检测技术体系的应用专题
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蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别 增强出版
摘要：目的为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。关键词：蜈蚣;配方颗粒;单核苷酸多态性（SNP）位点;聚合酶链式反应217|367|7<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15- 摘要：目的建立聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法快速鉴别香加皮与其混淆品五加皮、地骨皮，避免因基原混乱影响用药安全。方法从CGIR数据库获取的香加皮DSS标记序列，对香加皮DSS序列进行酶切位点分析，筛选香加皮与五加皮、地骨皮间差异位点，选择香加皮的特异性酶切位点Cla I，设计PCR-RFLP反应引物，对影响PCR-RFLP反应的退火温度、循环数、Taq酶、不同型号PCR仪、酶切时间等条件进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地香加皮与五加皮、地骨皮进行适用性考察。结果在退火温度59 ℃、循环数为40个时，香加皮与五加皮、地骨皮样品经过特异性引物进行PCR扩增后，可出现清晰明亮的片段，酶切时间30 min，香加皮药材及其基原物种均可产生约140 bp和290 bp的目的片段，而2种混淆品五加皮和地骨皮药材及其基原物种只在250~500 bp有一条约430 bp的目的片段。该方法能对香加皮及其混淆品五加皮、地骨皮进行准确鉴别。结论建立了香加皮与五加皮、地骨皮的PCR-RFLP鉴别方法，稳定性好、灵敏度高、适用性好，为香加皮与五加皮、地骨皮的质量控制提供参考。关键词：香加皮;五加皮;地骨皮;聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性;分子鉴定193|106|1<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
- 摘要：目的使用多重位点特异性聚合酶链式反应（PCR）的方法，简单高效地鉴定地骨皮（Lycii Cortex）的2种基原植物枸杞（Lycium chinense）和宁夏枸杞（L. barbarum）。方法在使用植物叶绿体基因组数据库（CGIR）获取枸杞和宁夏枸杞叶绿体基因组序列的基础上，利用IdenDSS软件筛选出两基原间特定的单核苷酸多态性（SNP）位点，并利用Primer 5.0软件设计获得特异性鉴别引物，包括鉴别枸杞的引物GQ-F/R、鉴别宁夏枸杞的引物NX-F/R。对引物浓度比、退火温度、循环次数、Taq酶进行优化，形成最适的PCR鉴别体系和条件，并对采集自不同地区的地骨皮进行适用性考察。结果对影响PCR结果的各个条件进行考察优化后，最终确定枸杞和宁夏枸杞的引物浓度比为2∶1、退火温度为59 ℃、循环次数为30次时，来自不同产区地骨皮的2个基原枸杞和宁夏枸杞分别在183、295 bp的位置出现特异性鉴别条带。结论通过一次PCR即可方便、快捷、高效地鉴定地骨皮的基原，为枸杞和宁夏枸杞的专属性鉴别提供新方法，同时对含有地骨皮成分的经典名方的研发提供一定的技术支撑。关键词：地骨皮;枸杞;宁夏枸杞;分子鉴定;聚合酶链式反应184|202|4<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
- 摘要：目的建立一种快速评估千里香种质材料杂合度的方法，为制定千里香的优异种质繁育策略和促进种质创新提供依据。方法以65株千里香重测序数据为基础，检测并筛选单核苷酸多态性（SNPs），利用其中20个SNP位点，通过自编脚本将其转化为限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记；采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）法对12份千里香种质的20个RFLP标记进行检测，根据RFLP标记位点酶切片段数目计算千里香种质的杂合度；采用plink软件计算12份千里香种质的全基因组杂合度，并比较不同种质杂合度评估方法得到的结果。结果PCR-RFLP法和基因组重测序法计算的杂合度间差异无统计学意义。利用PCR-RFLP法筛选获得了8份杂合度<30%的种质材料，利用基因组重测序法筛选获得9份杂合度<30%的种质材料，2种方法计算杂合度均<30%的种质材料共7份。结论该文建立了千里香种质杂合度评估的PCR-RFLP法，其精确度为87.5%，准确率为77.8%，该法可为其他药用植物种质杂合度评估方法研究提供借鉴。关键词：千里香;聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）;单核苷酸多态性（SNPs）;杂合度;全基因组重测序243|119|0<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
- 摘要：在中药质量控制过程中，有效成分和有毒有害成分的检测是2个重要环节，传统检测方法如高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等虽然能准确对上述物质进行定量，但往往存在操作复杂、成本过高、不能随时检测、难溶及大分子物质检测困难等缺点。酶联免疫吸附测定法（ELISA）是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性反应实现目标检测物的定性或定量分析。该方法具有操作简单、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求简单、应用范围广、成本低等众多优点。近年来，ELISA技术在中药质量控制领域运用越来越广泛，特别是在以黄曲霉毒素为代表的真菌毒素含量的检测和中药有效成分定性定量检测方面，ELISA以其独特的优势发挥着越来越重要的作用，为大批量中药的快速质量检测提供了新方法、新思路。该文对近年来ELISA用于中药质量控制的研究进展进行系统梳理，并对其技术发展和应用前景进行展望，以期为进一步应用该方法保障中药质量安全可控提供借鉴和研究思路。关键词：中药质量控制;酶联免疫吸附测定法;有毒有害成分;农药残留;有效成分341|259|6<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
- 摘要：目的基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种可以准确、快速鉴别蒙古黄芪、膜荚黄芪种子的方法。方法利用叶绿体基因组综合数据库（CGIR）及IdenDSS软件分别获取蒙古黄芪、膜荚黄芪的DNA特征片段，在此基础上筛选获得蒙古黄芪与膜荚黄芪的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据该位点设计蒙古黄芪特异性鉴别引物对MG-F/MG-R和膜荚黄芪特异性鉴别引物对MJ-F/MJ-R。分别建立蒙古黄芪和膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，优化PCR反应体系，并对该方法的专属性和适用性进行考察。结果蒙古黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MG-F/MG-R、退火温度62 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后蒙古黄芪在约220 bp处得到特异性条带，而膜荚黄芪和其他混伪品种子无条带；膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MJ-F/MJ-R、退火温度58 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后膜荚黄芪扩增得到约150 bp的条带，而蒙古黄芪及混伪品无扩增产物。结论该研究建立的特异性PCR鉴别方法，可以准确、快速对蒙古黄芪、膜荚黄芪进行种源鉴别，为黄芪种子的分类与准确鉴定提供了一定的科学依据。关键词：蒙古黄芪;膜荚黄芪;种子;聚合酶链式反应197|218|5<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
- 摘要：种子是中药材生产的源头。中药材种子的真伪、优劣直接影响到药材的有效性和安全性。中药材种子质量参差不齐，存在种源混杂、真伪混淆、陈种新卖、成熟度和净度低等问题。为保证中药产业高质量、可持续发展，亟需对中药材种子进行鉴别和质量评价，对中药材种子市场进行规范。种子鉴别的方法包括性状鉴别、显微鉴别、微性状鉴别、化学指纹图谱鉴别、分子鉴别及电子鼻、X射线衍射法、电化学指纹图谱鉴别、光谱成像与人工智能识别技术等新兴技术。各类鉴别方法的应用范围及其优缺点各有不同，根据中药材种子品种不同、检测场所要求不同，可选择合适的鉴别方法，以实现鉴别准确、时间和经济成本降低的目标。未来中药材种子鉴别技术发展的方向应基于各项快速发展的新兴技术，开展学科交叉融合，朝着智能化、无损化、单粒检测的方向发展，以满足现代中药产业的需求。该文对目前科研和生产中应用的种子鉴别技术进行系统总结，对不同技术的原理、适用范围和优缺点进行比较，同时对未来种子鉴别技术的发展前景进行展望，以期为中药材种子鉴别及质量评价提供参考。关键词：中药材种子;传统鉴别;分子鉴别;化学指纹图谱;电子鼻;光谱鉴别;人工智能440|394|1<HTML><印刷PDF><网络PDF>更新时间：2024-01-15
