Mechanism of Ferroptosis in Cerebral Ischemia-reperfusion and Interventional Mechanism of Huoxue Huayu Jiedu Prescription Based on "Blood Stasis and Toxin" Pathogenesis

HAN Jiayue; PAN Danyi; XIAO Jiaxuan; LIU Yuchen; LIU Jiyong; ZENG Yidi; LI Jinxia; ZHENG Caixing; LI Hua; LIU Wanghua

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20250102

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Mechanism of Ferroptosis in Cerebral Ischemia-reperfusion and Interventional Mechanism of Huoxue Huayu Jiedu Prescription Based on "Blood Stasis and Toxin" Pathogenesis

更新时间：2025-03-20

- Mechanism of Ferroptosis in Cerebral Ischemia-reperfusion and Interventional Mechanism of Huoxue Huayu Jiedu Prescription Based on "Blood Stasis and Toxin" Pathogenesis
- Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 31, Issue 8, Pages: 51-60(2025)
- 作者机构：
  
  湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，长沙 410208
- 作者简介：
- 基金信息：
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20250102
  CLC： R289;R285;R259
- Received：04 November 2024，
  
  Accepted：23 December 2024，
  
  Online First：25 December 2024，
  
  Published：20 April 2025
- 稿件说明：
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韩佳悦,潘单依,肖佳璇等.从“瘀毒”病机探讨脑缺血再灌注铁死亡机制及活血化瘀解毒方干预机制[J].中国实验方剂学杂志,2025,31(08):51-60.

HAN Jiayue,PAN Danyi,XIAO Jiaxuan,et al.Mechanism of Ferroptosis in Cerebral Ischemia-reperfusion and Interventional Mechanism of Huoxue Huayu Jiedu Prescription Based on "Blood Stasis and Toxin" Pathogenesis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2025,31(08):51-60.
韩佳悦,潘单依,肖佳璇等.从“瘀毒”病机探讨脑缺血再灌注铁死亡机制及活血化瘀解毒方干预机制[J].中国实验方剂学杂志,2025,31(08):51-60. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20250102.

HAN Jiayue,PAN Danyi,XIAO Jiaxuan,et al.Mechanism of Ferroptosis in Cerebral Ischemia-reperfusion and Interventional Mechanism of Huoxue Huayu Jiedu Prescription Based on "Blood Stasis and Toxin" Pathogenesis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2025,31(08):51-60. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20250102.

摘要

目的

探讨脑缺血再灌注损伤“瘀毒互结”病机物质基础及活血化瘀解毒方对脑缺血再灌注损伤铁死亡的保护作用。

方法

将60只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表分为6组：假手术组，模型组，去铁胺（DFO）组（100 mg·kg

-1

），活血化瘀解毒方低、中、高剂量组（4.52、9.04、18.07 g·kg

-1

），每组各10只。除假手术组外，其余各组采用改良线栓法复制大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。采用改良神经功能评分（m-NSS）对再灌注后1、3、5、7 d的大鼠进行神经功能评分；苏木素-伊红（HE）染色及透射电镜观察脑组织及线粒体病理形态，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测缺血侧脑组织中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、亚铁离子（Fe

）和组织活性氧（ROS）含量；免疫组化及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测脑组织中铁死亡标志性蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、膜铁转运蛋白-1（FPN1）、转铁蛋白受体1（TfR1）及线粒体铁蛋白（FtMt）蛋白的表达。

结果

与正常组比较，模型组mNSS评分显著升高（

0.01）；HE染色可见脑组织皮质出现神经元数量严重减少、细胞间隙增宽、细胞胞核碎裂、胞质空泡化等病理学改变；透射电镜结果显示胞浆中线粒体收缩变圆，线粒体嵴减少，基质丢失，呈空泡化，线粒体双层膜密度增加；ELISA结果显示GSH含量显著下降（

0.01），MDA、Fe

和ROS含量显著增加（

0.01）；免疫组化及Western blot实验结果显示GPX4、FPN1蛋白表达显著降低（

0.01），FtMt、TfR1蛋白表达显著增加（

0.01）。与模型组比较，活血化瘀解毒方高、中剂量组m-NSS评分分别在3 d和5 d时开始降低（

0.05，

0.01）；HE及透射电镜结果显示活血化瘀解毒方的干预改善了神经元及线粒体的病理改变；ELISA结果显示活血化瘀解毒方中、高剂量组的GSH含量显著增加（

0.01），MDA、Fe

和ROS含量明显下降（

0.05，

0.01），活血化瘀解毒方低剂量组中GSH含量显著增加（

0.01），MDA、ROS含量显著下降（

0.01）；免疫组化结果显示活血化瘀解毒方高剂量组的GPX4、FPN1表达显著增加（

0.01），FtMt、TfR1表达显著下降（

0.01），活血化瘀解毒方中剂量组的GPX4、FPN1表达明显增加（

0.05），TfR1表达显著下降（

0.01）；Western blot结果显示活血化瘀解毒方高

、中、低剂量组FPN1和GPX4蛋白表达水平显著上调（

0.01），FtMt和TfR1蛋白表达水平显著下调（

0.01）。

结论

活血化瘀解毒方能够显著改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能障碍症状，改善梗死区脑组织病理形态结构，对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织具有一定的保护作用。神经细胞铁死亡参与了脑缺血再灌注损伤，MDA、Fe

、ROS、TfR1含量升高，FtMt、FPN1、GPX4、GSH降低可能是脑缺血再灌注损伤瘀毒互结病机的物质基础。活血化瘀解毒方可能通过调控铁代谢相关蛋白，通过促使游离铁的排出，减少脑内铁沉积，缓解氧化应激损伤，并抑制铁死亡，从而发挥脑保护作用。

Abstract

Objective

To explore the material basis of the "interaction of blood stasis and toxin" mechanism in cerebral ischemia-reperfusion injury， as well as the protective role of Huoxue Huayu Jiedu prescription （HXHYJDF） against ferroptosis.

Methods

Sixty SPF-grade male SD rats were randomly divided into six groups： sham group， model group， deferoxamine （DFO） group （100 mg·kg

-1

）， low-dose HXHYJDF group （4.52 g·kg

-1

）， medium-dose HXHYJDF group （9.04 g·kg

-1

）， and high-dose HXHYJDF group （18.07 g·kg

-1

）， with ten rats in each group. Except for the sham group， the other groups were used to replicate the model of focal cerebral ischemia-reperfusion in the middle cerebral artery of rats by the reforming Longa method. Neurological function was assessed at 1

， 3

， 5

， and 7

days post-reperfusion using the modified neurological severity scores （m-NSS）. Brain tissue pathology and the morphology of mitochondria were observed using hematoxylin-eosin （HE） staining and transmission electron microscopy. The contents of malondialdehyde （MDA）， glutathione （GSH）， divalent iron ions （Fe

）， and reactive oxygen species （ROS） in the ischemic cerebral tissue were detected using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Immunohistochemistry and Western blot （WB） were used to detect the expression of iron death marker proteins glutathione peroxidase 4 （GPX4）， ferroportin-1 （FPN1）， transferrin receptor protein 1 （TfR1）， and ferritin mitochondrial （FtM

t） in brain tissue.

Results

Compared with the sham group， the mNSS score of the model group was significantly increased （

0.01）. HE staining showed that the number of neurons in the cortex of brain tissue was seriously reduced， and the intercellular space was widened. The nucleus was fragmented， and the cytoplasm was vacuolated. The results of transmission electron microscopy showed that the mitochondria in the cytoplasm contracted and rounded， and the mitochondrial cristae decreased. The matrix was lost and vacuolated， and the density of the mitochondrial bilayer membrane increased. The results of ELISA showed that the content of GSH decreased significantly （

0.01）， and the contents of MDA， Fe

， and ROS increased significantly （

0.01）. The results of immunohistochemistry and WB showed that the expression of GPX4 and FPN1 proteins was significantly decreased （

0.01）， and the expression of FtMt and TfR1 proteins was significantly increased （

0.01）. Compared with those of the model group， the m-NSS scores of the high-dose and medium-dose HXHYJDF groups began to decrease on the 3

and 5

days， respectively （

0.05，

0.01）. The results of HE and transmission electron microscopy showed that the intervention of HXHYJDF improved the pathological changes of neurons and mitochondria. The results of ELISA showed that the content of GSH in the medium-dose and high-dose HXHYJDF groups increased significantly （

0.01）， and the contents of MDA， Fe

， and ROS decreased significantly （

0.05，

0.01）. The content of GSH in the low-dose HXHYJDF group increased significantly （

0.01）， and the contents of MDA and ROS decreased significantly （

0.01）. The results of immunohistochemistry showed that the expression o

f GPX4 and FPN1 in the high-dose HXHYJDF group increased significantly （

0.01）， and the expression of FtMt and TfR1 decreased significantly （

0.01）. The expression of GPX4 and FPN1 in the medium-dose HXHYJDF group increased significantly （

0.05）， and the expression of TfR1 decreased significantly （

0.01）. WB results showed that the expression levels of FPN1 and GPX4 proteins in the high-dose， medium-dose， and low-dose HXHYJDF groups were significantly up-regulated （

0.01）， and the expression levels of FtMt and TfR1 proteins were significantly down-regulated （

0.01）.

Conclusion

HXHYJDF can significantly improve neurological dysfunction symptoms in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury， improve the pathological morphology of the infarcted brain tissue， and protect the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury to a certain extent. Neuronal ferroptosis is involved in cerebral ischemia-reperfusion injury， with increased levels of MDA， Fe

， ROS， and TfR1 and decreased levels of FtMt， FPN1， GPX4， and GSH potentially constituting the material basis of the interaction of blood stasis and toxin mechanism in cerebral ischemia-reperfusion injury. HXHYJDF may exert brain-protective effects by regulating iron metabolism-related proteins， promoting the discharge of free iron， reducing brain iron deposition， alleviating oxidative stress， and inhibiting ferroptosis.

关键词

Keywords

references

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