哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用

张怡; 郑冉; 于奇; 焦丽丽; 李波; 刘达; 李宜平

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20211404

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哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用

药理 | 更新时间：2021-07-15

- 哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用
- Effect of Ranae Oviductus Protein Hydrolysate on Ethanol-induced L-02 Cell Injury
- 中国实验方剂学杂志 2021年27卷第15期页码：43-50
- 作者机构：
  
  长春中医药大学，长春 130117
- 作者简介：
  
  张怡，硕士，从事中药新药研究与开发研究，E-mail：280005049@qq.com
  * 李宜平，教授，从事中药资源与开发研究，E-mail：czdliyiping@163.com
- 基金信息：
  
  吉林省科技发展项目(20170309005YY)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20211404
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R33
- 纸质出版日期：2021-08-05，
  
  网络出版日期：2021-05-26，
  
  收稿日期：2021-03-31，
- 稿件说明：
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张怡,郑冉,于奇等.哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(15):43-50.

ZHANG Yi,ZHENG Ran,YU Qi,et al.Effect of Ranae Oviductus Protein Hydrolysate on Ethanol-induced L-02 Cell Injury[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(15):43-50.
张怡,郑冉,于奇等.哈蟆油蛋白酶解物对乙醇诱导的L-02细胞损伤的作用[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(15):43-50. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211404.

ZHANG Yi,ZHENG Ran,YU Qi,et al.Effect of Ranae Oviductus Protein Hydrolysate on Ethanol-induced L-02 Cell Injury[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(15):43-50. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211404.

摘要

目的

研究哈蟆油蛋白酶解物（ORPH）对乙醇诱导的L-02细胞损伤相关通路蛋白表达影响的作用机制研究。

方法

复合酶解法制备ORPH，以400 mmol·L

-1

乙醇建立L-02肝细胞损伤模型，细胞增殖与活性检测试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡、周期变化，JC-1/Hochest染色观察形态学变化；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路及细胞焦亡相关蛋白在L-02肝细胞中的表达变化，研究ORPH对乙醇所致肝细胞损伤的保护作用及机制。

结果

CCK-8法结果表明400 mmol·L

-1

乙醇可在12 h内明显引起L-02肝细胞损伤；与空白组比较，模型组L-02细胞活力显著下降（

0.01），细胞处于G

期的细胞占比显著升高（

0.01），细胞总凋亡率显著升高（

0.01），线粒体膜电位下降；B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax），细胞色素C（Cyt C），半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）凋亡相关蛋白的表达明显升高（

0.05，

0.01），MAPK信号通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶（JNK），p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）明显上调（

0.05，

0.01），且焦亡蛋白Caspase-1，白细胞介素-1

（IL-1

）表达明显增强（

0.05），Bcl-2显著下降（

0.01）；与模型组比较，ORPH处理组细胞周期阻滞有所改善（

0.05，

0.01），细胞总凋亡率显著下降（

0.01），线粒体膜电位升高，呈剂量相关性；Bax，Cyt C，Caspase-3蛋白表达明显降低（

0.05，

0.01），Bcl-2蛋白表达升高（

0.05，

0.01），MAPK信号通路相关蛋白及焦亡相关蛋白表达均呈下降趋势（

0.05，

0.01）。

结论

ORPH可通过抑制乙醇诱导L-02肝细胞引起的氧化应激肝细胞损伤，改善恢复线粒体膜电位，降低线粒体介导的细胞凋亡通路蛋白的表达，并抑制MAPK信号通路相关蛋白、焦亡通路相关蛋白表达，从而降低乙醇诱导L-02肝细胞的线粒体功能障碍及炎症反应并减轻氧化应激，对酒精性肝损伤起到治疗作用。

Abstract

Objective

To study the protective effect and mechanism of Ranae Oviductus protein hydrolysate （ROPH） on the expression of pathway-related proteins in ethanol-induced L-02 cell injury.

Method

The ROPH was prepared by compound enzymatic hydrolysis. L-02 cell injury model was induced with 400 mmol·L

-1

ethanol. Cell viability was detected by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Cell cycle and apoptosis were examined by flow cytometry. JC-1/Hochest staining was employed for qualitative investigation. The expression of related proteins in apoptosis， mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway， and pyroptosis in L-02 cells was detected by Western blot.

Result

The results of the CCK-8 assay showed that 400 mmol·L

-1

ethanol could induce L-02 cell injury within 12 hours. Compared with the blank group， the model group showed decreased viability of L-02 cells （

0.01）， elevated percentage of the cell cycle in the G

phase （

0.01）， increased total cell apoptosis rate （

0.01）， reduced mitochondrial membrane potential （

0.01）， up-regulated expression of apoptosis-related proteins ［B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）-associated X protein （Bax）， Cytochrome C （Cyt C）， and cysteine-dependent aspartate specific protease-3 （Caspase-3）］（

0.05，

0.01） and MAPK signaling pathway-related proteins ［C-Jun amino-terminal kinase （JNK） and p38 MAPK］（

0.05，

0.01）， and potentiated expression of pyrolysis-related proteins Caspase-1 and interleukin-1

（IL-1

）（

0.05）. Compared with the model group， the ROPH treatment group exhibited improved cell cycle arrest （

0.05，

0.01）， diminished total cell apoptosis rate （

0.01）， elevated mitochondrial membrane potential in a dose-dependent manner， down-regulated expression of Bax， Cyt C， and Caspase-3 proteins （

0.05，

0.01）， up-regulated expression of Bcl-2 protein （

0.05，

0.01）， and a downward trend in expression of proteins related to MAPK signaling pathway and pyrolysis （

0.05，

0.01）.

Conclusion

ROPH could inhibit oxidative stress-triggered liver injury in ethanol-induced cells by improving mitochondrial membrane potential， reducing the expression of proteins in the mitochondria-mediated apoptosis pathway， and inhibiting the expression of proteins related to the MAPK signaling pathway and pyrolysis pathway to reduce the mitochondrial dysfunction and inflammatory response in ethanol-induced L-02 liver cells and inhibit oxidative stress， thereby exerting a therapeutic role in alcoholic liver injury.

关键词

哈蟆油蛋白酶解物（ORPH）酒精性肝细胞损伤氧化应激线粒体凋亡炎症反应

Keywords

Ranae Oviductus protein hydrolysate （ROPH）alcoholic liver cell injuryoxidative stressmitochondrial apoptosisinflammatory response

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