基于Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡探究甘草含药血清对LPS诱导的Caco2细胞炎症的影响

孔金融; 施高翔; 侯静; 冯烨; 项庆镇; 王运来; 宣自华; 许钒

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230601

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基于Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡探究甘草含药血清对LPS诱导的Caco2细胞炎症的影响

药理 | 更新时间：2023-07-18

- 基于Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡探究甘草含药血清对LPS诱导的Caco2细胞炎症的影响
- Effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma-containing Serum on LPS-induced Inflammation in Caco2 Cells Based on Inhibition of Ferroptosis by Nrf2/HO-1 Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第16期页码：144-153
- 作者机构：
  
  安徽中医药大学药学院，中药复方安徽省重点实验室，合肥 230012
- 作者简介：
  
  孔金融，在读硕士，从事中药复方药理作用机制研究，E-mail：2020205225048@stu.ahtcm.edu.cn
  宣自华，硕士，讲师，从事中药复方药理作用机制研究，Tel：0551-68129182，E-mail：35736511@qq.com； *
  许钒，博士，教授，博士生导师，从事中药复方药理作用机制研究，Tel：0551-68129295，E-mail：845570851@qq.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(82274375;81974536);安徽省高校科学研究项目(YJS20210493);安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2019A0449;KJ2020A0387)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230601
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2022-10-31，
  
  网络出版日期：2023-02-14，
  
  纸质出版日期：2023-08-20
- 稿件说明：
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孔金融,施高翔,侯静等.基于Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡探究甘草含药血清对LPS诱导的Caco2细胞炎症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):144-153.

KONG Jinrong,SHI Gaoxiang,HOU Jing,et al.Effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma-containing Serum on LPS-induced Inflammation in Caco2 Cells Based on Inhibition of Ferroptosis by Nrf2/HO-1 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):144-153.
孔金融,施高翔,侯静等.基于Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡探究甘草含药血清对LPS诱导的Caco2细胞炎症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(16):144-153. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230601.

KONG Jinrong,SHI Gaoxiang,HOU Jing,et al.Effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma-containing Serum on LPS-induced Inflammation in Caco2 Cells Based on Inhibition of Ferroptosis by Nrf2/HO-1 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(16):144-153. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230601.

摘要

目的

探讨甘草含药血清激活核因子E

相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路抑制铁死亡对脂多糖（LPS）诱导的人结肠上皮腺癌细胞（Caco2）炎症的影响。

方法

将Caco2细胞分为正常组、模型组（LPS，200 μg·L

-1

）、甘草含药血清低、中、高浓度组（5%、10%、20%）、铁死亡抑制剂组（3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯，Fer-1，10 μmol·L

-1

）。正常组细胞正常培养，其他组建立炎症模型，甘草含药血清低、中、高浓度组分别加入5%、10%、20%含药血清处理24 h，铁死亡抑制剂组给予Fer-1处理24 h。透射电镜观察各组线粒体形态；流式细胞术检测细胞内Fe

水平；微板法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测白细胞介素-1

（IL-1

）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-

（TNF-

）含量；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Nrf2、HO-1、铁蛋白重链1（FTH1）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GSH-Px4）蛋白的表达水平。运用小干扰核糖核酸（siRNA）的方式来观察Nrf2在铁死亡调控中的作用。将干扰后细胞分为空载体组（NC）、Si-Nrf2组、含药血清（20%）+Si-Nrf2组、含药血清（20%）+NC组。微板法检测MDA、SOD、GSH-Px水平；Western blot检测Nrf2、HO-1、FTH1、GSH-Px4蛋白表达水平。

结果

与正常组比较，模型组线粒体固缩，线粒体膜增厚，线粒体形态变小；模型组Fe

含量显著增加（

0.01）；SOD活性显著降低（

0.01），GSH-Px表达显著下降（

0.01），MDA含量显著增高（

0.01）；Nrf2、HO-1表达降低（

0.05），FTH1表达显著性下降（

0.01），GSH-Px4表达显著降低（

0.01）。甘草含药血清处理组，中、高浓度组Fe

含量显著降低（

0.01），SOD活性和GSH-Px活性显著升高（

0.01），MDA水平显著降低（

0.01）；高浓度组Nrf2表达明显升高（

0.05），中浓度组HO-1与GSH-Px4蛋白的表达有所增高（

0.05），低、中、高浓度组FTH1水平皆显著增加（

0.01）。机制研究发现，与NC组比较，转染Nrf2 siRNA的细胞中MDA含量增加（

0.01），SOD活性下降（

0.01），GSH-Px活性减少（

0.01）；Nrf2、HO-1表达下降（

0.01），FTH1和GSH-Px4蛋白含量降低（

0.01）；与Si-Nrf2组比较，在甘草含药血清干预后，细胞内MDA含量降低（

0.01），SOD活性提高（

0.01），GSH-Px活性上升（

0.01）；Nrf2、FTH1蛋白表达增加（

0.05），HO-1和GSH-Px4蛋白表达水平明显升高（

0.01）。

结论

甘草含药血清可降低LPS诱导的Caco2细胞炎症因子及氧化应激水平，其机制与促进Nrf2/HO-1信号通路的表达，减轻细胞内脂质过氧化从而抑制铁死亡的发生有关。

Abstract

Objective

To investigate the effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma （GR）-containing serum on lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammation in human colon epithelial adenocarcinoma cells （Caco2） based on inhibition of ferroptosis by the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/heme oxygenase-1 （HO-1） pathway.

Method

Caco2 cells were divided into a normal group， a model group （LPS， 200 μg·L

-1

）， low-， medium-， and high-dose GR-containing serum groups （5%， 10%， 20%）， and a ferroptosis inhibitor group （3-amino-4-cyclohexylamino-benzoic acid ethyl ester， Fer-1， 10 μmol·L

-1

）. The cells in the normal group were cultured normally， while those in other groups underwent the induction of an inflammation model. The cells in the low-， medium-， and high-dose GR-containing serum groups were treated with 5%， 10%， and 20% GR-containing serum for 24 hours， respectively， and the cells in the ferroptosis inhibitor group were treated with Fer-1 for 24 hours. Transmission electron microscopy was used to observe mitochondrial morphology in each group. Flow cytometry was used to detect intracellular Fe

levels. Microplate assays were performed to measure superoxide dismutase （SOD） activity， malondialdehyde （MDA） and glutathione peroxidase （GSH-Px） levels. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to measure interleukin-1

（IL-1

）， IL-6， IL-10， and tumor necrosis factor-

（TNF-

） levels. Western blot was used to measure the expression levels of Nrf2， HO-1， ferritin heavy chain 1 （FTH1）， and glutathione peroxidase 4 （GSH-Px4） proteins. Small interfering RNA （siRNA） was used to investigate the role of Nrf2 in ferroptosis regulation. The cells after interference were divided into a negative control （NC） group， a Si-Nrf2 group， a GR-containing serum （20%） + Si-Nrf2 group， and a GR-containing serum （20%） + NC group. Microplate assays were performed to measure MDA， SOD， and GSH-Px levels， and Western blot was used to measure the expression levels of Nrf2， HO-1， FTH1， and GSH-Px4 proteins.

Result

Compared with the normal group， the model group showed mitochondrial contraction， increased mitochondrial membrane thickness， and smaller mitochondrial morphology， increased Fe

content （

0.01）， blunted SOD activity （

0.01）， decreased GSH-Px expression （

0.01）， increased MDA content （

0.01）， reduced expression levels of Nrf2 and HO-1 （

0.05）， reduced FTH1 expression （

0.01）， and down-regulated GSH-Px4 expression （

0.01）. In the GR-containing serum groups， the medium- and high-dose groups showed a significant decrease in Fe

content （

0.01）， potentiated SOD and GSH-Px activities （

0.01）， and decreased MDA levels （

0.01）. The high-dose group showed a significant increase in Nrf2 expression （

0.05）， and the medium-dose group showed increased expression of HO-1 and GSH-Px4 proteins （

0.05）. The expression levels of FTH1 significantly increased in the low-， medium-， and high-dose groups （

0.01）. The study on mechanism revealed that compared with the NC group， the cells transfected with Nrf2 siRNA showed increased MDA content （

0.01）， blunted SOD activity （

0.01）， decreased GSH-Px activity （

0.01）， decreased expression of Nrf2 and HO-1 （

0.01）， and reduced levels of FTH1 and GSH-Px4 proteins （

0.01）. Compared with the Si-Nrf2 group， the cells treated with GR-containing serum showed a decrease in MDA content （

0.01）， an increase in SOD activity （

0.01）， an increase in GSH-Px activity （

0.01）， increased expression of Nrf2 and FTH1 proteins （

0.05）， and higher expression levels of HO-1 and GSH-Px4 proteins （

0.01）.

Conclusion

GR-containing serum can reduce the inflammatory cytokines and oxidative stress levels in LPS-induced Caco2 cells. Its mechanism is related to the promotion of Nrf2/HO-1 signaling pathway expression， alleviating intracellular lipid peroxidation and inhibiting ferroptosis.

关键词

Keywords

references

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