益气温阳护卫汤调控PI3K/Akt/mTOR自噬途径治疗支气管哮喘大鼠机制

向双娣; 程林辉; 喻强强; 薛汉荣

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230637

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益气温阳护卫汤调控PI3K/Akt/mTOR自噬途径治疗支气管哮喘大鼠机制

药理 | 更新时间：2023-06-20

- 益气温阳护卫汤调控PI3K/Akt/mTOR自噬途径治疗支气管哮喘大鼠机制
- Yiqi Wenyang Huwei Decoction Regulates PI3K/Akt/mTOR Pathway to Treat Bronchial Asthma in Rats
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第14期页码：38-46
- 作者机构：
  
  1.江西中医药大学，南昌 330006
  2.江西中医药大学附属医院，南昌 330006
- 作者简介：
  
  向双娣，在读博士，从事中医肺系疾病的临床与基础研究，E-mail：hbcylyj@qq.com
  薛汉荣，二级教授，博士生导师，从事中医肺系疾病的临床与基础研究，E-mail：xuehanrong99@163.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(81960802)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230637
  中图分类号： R2-0;R33;R289;R256.12
- 收稿日期：2023-01-08，
  
  网络出版日期：2023-04-21，
  
  纸质出版日期：2023-07-20
- 稿件说明：
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向双娣,程林辉,喻强强等.益气温阳护卫汤调控PI3K/Akt/mTOR自噬途径治疗支气管哮喘大鼠机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(14):38-46.

XIANG Shuangdi,CHENG Linhui,YU Qiangqiang,et al.Yiqi Wenyang Huwei Decoction Regulates PI3K/Akt/mTOR Pathway to Treat Bronchial Asthma in Rats[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(14):38-46.
向双娣,程林辉,喻强强等.益气温阳护卫汤调控PI3K/Akt/mTOR自噬途径治疗支气管哮喘大鼠机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(14):38-46. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230637.

XIANG Shuangdi,CHENG Linhui,YU Qiangqiang,et al.Yiqi Wenyang Huwei Decoction Regulates PI3K/Akt/mTOR Pathway to Treat Bronchial Asthma in Rats[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(14):38-46. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230637.

摘要

目的

观察益气温阳护卫汤（YWHD）对哮喘大鼠及支气管上皮细胞（16HBE）自噬和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的调控，探讨YWHD治疗支气管哮喘（BA）的作用机制。

方法

48只大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组及YWHD低、中、高剂量组，每组8只。大鼠腹腔注射卵清蛋白（OVA）+氢氧化铝混悬液和OVA雾化吸入2周，建立BA动物实验模型，正常组给予等体积生理盐水。动物肺功能仪检测乙酰甲基胆碱（Mch）激发的大鼠支气管最大气道阻力（Max Rrs）；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠肺泡灌洗液中炎症因子白细胞介素（IL）-4、IL-13、IL-6、IL-33、IL-25、肿瘤坏死因子-

（TNF-

）、免疫球蛋白E（IgE）水平；苏木素-伊红（HE）及马松（Masson）染色法观察大鼠肺组织支气管病理变化；免疫荧光法检测支气管自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）、Beclin1水平，实验观察YWHD含药血清对IL-13诱导的16HBE细胞自噬作用，通过mRFP-GFP-LC3腺病毒感染示踪细胞自噬水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、磷酸化（p）-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。

结果

与正常组比较，OVA诱导的模型组大鼠Max Rrs显著增大（

0.01）；肺泡灌洗液中IL-4、IL-13、IL-6、IL-33、IL-25、TNF-

、IgE的水平明显升高（

0.05，

0.01）；支气管及血管周围伴有炎性细胞和淋巴细胞呈灶性浸润及上皮杯状细胞化生和上皮下胶原沉积增加；支气管自噬蛋白LC3B、Beclin1表达显著升高（

0.01）；IL-13诱导的16HBE细胞自噬流GFP向mRFP转变水平显著升高（

0.01）；p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达显著下降，LC3Ⅱ/Ⅰ值显著升高（

0.01）。与模型组比较，YWHD中、高剂量组大鼠Max Rrs显著减小（

0.01）；肺泡灌洗液中IL-4、IL-13、IL-6、IL-33、IL-25、TNF-

、IgE的水平明显降低（

0.05，

0.01）；经YWHD中、高剂量给药后大鼠肺组织支气管少见淋巴细胞和粒细胞浸润，上皮杯状细胞化生和上皮下胶原沉积减少；肺组织支气管LC3B、Beclin1表达水平明显降低（

0.05，

0.01）；YWHD含药血清组GFP向mRFP转变的自噬流水平降低；p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高，LC3Ⅱ/Ⅰ值明显降低（

0.05，

0.01）。

结论

YWHD可以改善BA大鼠气道高反应性和气道炎症，抑制肺组织中气道上皮细胞的自噬水平，其机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关。

Abstract

Objective

To observe the regulatory effects of Yiqi Wenyang Huwei decoction （YWHD） on autophagy and phosphatidylinositol 3-kinase （PI3K）/protein kinase B（Akt）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway in asthmatic rats and bronchial epithelial cells （16HBE） and further reveal the mechanism of YWHD in treating bronchial asthma （BA）.

Method

Forty-eight rats were randomly assigned into normal group， model group， dexamethasone group， and low-， medium-， and high-dose YWHD groups， with 8 rats in each group. The rat model of BA was established by intraperitoneal injection with ovalbumin （OVA） + aluminum hydroxide suspension and atomizing inhalation with OVA for 2 weeks. The normal group was administrated with an equal dose of normal saline. The bronchial maximum airway resistance （Max Rrs） induced by methacholine chloride （Mch） was determined by an animal lung function evaluation system. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was employed to measure the levels of interleukin （IL）-4， IL-13， IL-6， IL-33， IL-25， tumor necrosis factor-

（TNF-

）， and immunoglobulin E （IgE） in the bronchial alveolar lavage fluid. Hematoxylin-eosin （HE） and Masson staining were used for observation of the pathological changes of bronchi in the lung tissue. The immunofluorescence assay was employed to measure the levels of the autophagy-associated proteins LC3B and Beclin1. The IL-13-induced autophagy of 16HBE cells exposed to the YWHD-containing serum was observed， and the autophagy level was traced by mRFP-GFP-LC3 adenovirus infection. The protein levels of LC3Ⅱ/Ⅰ， p-PI3K， p-Akt and p-mTOR were determined by Western blot.

Result

Compared with the normal group， the model group showed increased Max Rrs （

0.01） and elevated levels of IL-4， IL-13， IL-6， IL-33， IL-25， TNF-

， and IgE in the bronchial alveolar lavage fluid （

0.05，

0.01）. The modeling caused focal infiltration of inflammatory cells and lymphocytes around bronchus and blood vessels， epithelial goblet cell metaplasia， and increased subepithelial collagen deposition. Furthermore， it up-regulated the protein levels of LC3B and Beclin1 （

0.01）， promoted the autophagy flux of GFP to mRFP in 16HBE cells induced by IL-13， down-regulated the protein levels of p-PI3K， p-Akt， and p-mTOR， and increased the LC3Ⅱ/Ⅰ ratio （

0.01）. Compared with the model group， medium- and high-dose YWHD decreased Max Rrs （

0.01）， lowered the levels of IL-4， IL-13， IL-6， IL-33， IL-25， TNF-

， and IgE in the bronchial alveolar lavage fluid （

0.05，

0.01）， and reduced lymphocyte and granulocyte infiltration in bronchi of the lung tissue， epithelial goblet cell metaplasia， and subepithelial collagen deposition. Moreover， they down-regulated the protein levels of LC3B and Beclin1 （

0.05，

0.01）， decreased the autophagy flux of GFP to mRFP， up-regulated the protein levels of p-PI3K， p-Ak， and p-mTOR， and decreased the LC3Ⅱ/Ⅰ ratio （

0.05，

0.01）.

Conclusion

YWHD ameliorates airway hyperresponsiveness and airway inflammation and inhibits the autophagy of airway epithelial cells in the lung tissue of BA rats by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

关键词

Keywords

references

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