从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制

马成勇; 张宝云; 邓蓓蕾; 姚丽秋; 王安安; 厉瑶; 王丽新; 张天嵩

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230815

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从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制

药理 | 更新时间：2023-08-07

- 从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制
  增强出版
- Effect Mechanism of Modified Baitouwengtang Treating Colorectal Cancer by Regulating CSF1R/STING/TBK1 Signaling to Polarize Phenotype of Tumor-associated Macrophages （TAMs）
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第17期页码：96-108
- 作者机构：
  
  1.上海市静安区中医医院，上海 200072
  2.同济大学附属上海市肺科医院，上海 200433
  3.复旦大学附属静安区中心医院，上海 200040
- 作者简介：
  
  马成勇，硕士，住院医师，从事肿瘤免疫与免疫衰老及中医药干预研究，E-mail：mcy1991_immunity@126.com
  王丽新，博士，主任医师，从事肺系肿瘤的中西医结合临床与机制研究，E-mail：1701005@tongji.edu.cn
  张天嵩，博士，主任医师，从事张仲景学术思想挖掘与临床应用研究，E-mail：ztsdoctor@126.com；
- 基金信息：
  
  上海市科委引导类科技支撑项目(18401901500);上海市中医药三年行动计划中医临床重点专科培育项目(ZY-FWTX-7001);静安区名老中医专家传承创新工作室建设项目(JA2021-MLZZ005);静安区医学科研课题项目(2022ZY04;2022ZY05)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230815
  中图分类号： R285;R289;R287;R22;R2-031;R33;R24
- 收稿日期：2023-05-04，
  
  网络出版日期：2023-07-10，
  
  纸质出版日期：2023-09-05
- 稿件说明：
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马成勇,张宝云,邓蓓蕾等.从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(17):96-108.

MA Chengyong,ZHANG Baoyun,DENG Beilei,et al.Effect Mechanism of Modified Baitouwengtang Treating Colorectal Cancer by Regulating CSF1R/STING/TBK1 Signaling to Polarize Phenotype of Tumor-associated Macrophages （TAMs）[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(17):96-108.
马成勇,张宝云,邓蓓蕾等.从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(17):96-108. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.

MA Chengyong,ZHANG Baoyun,DENG Beilei,et al.Effect Mechanism of Modified Baitouwengtang Treating Colorectal Cancer by Regulating CSF1R/STING/TBK1 Signaling to Polarize Phenotype of Tumor-associated Macrophages （TAMs）[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(17):96-108. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230815.

摘要

目的

观察加味白头翁汤对结直肠癌MC38细胞荷瘤小鼠瘤体生长及肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润数量的影响，探析加味白头翁汤是否介导TAMs表型重塑以发挥抗肿瘤免疫调节效应。

方法

首先构建鼠源MC38细胞株C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型，设立模型组、阳性药奥沙利铂组（3 mg·kg

-1

）及加味白头翁汤高、低剂量组23.43、46.86 g·kg

-1

，每组各10只，另设立10只健康小鼠为空白组，观察各组小鼠体质量、瘤体体积及生存状态变化，摘取肿瘤组织、脾脏及外周血，计算瘤体体积变化、抑瘤率及脾脏质量；苏木素-伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理形态学变化，免疫荧光实验检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4、CD8、CD206表达水平，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测荷瘤小鼠外周血清中细胞因子转化生长因子（TGF）-

、白细胞介素（IL）-6、趋化因子配体2（CCL2）的分泌水平；其次，使用MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7细胞在体外构建IL-4诱导的共培养模型，细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测加味白头翁汤含药血清的细胞增殖抑制作用，Transwell实验检测IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响，流式细胞术检测加味白头翁汤含药血清对IL-4诱导的M2型巨噬细胞干预后膜上CD86的表达变化，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测加味白头翁汤含药血清对共培养后M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-12及M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平的影响；最后，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测荷瘤小鼠肿瘤组织中集落刺激因子1受体（CSF1R）、干扰素基因刺激蛋白（STING）、TANK结合激酶1（TBK1）蛋白表达水平。

结果

体内实验结果表明，与模型组比较，加味白头翁汤能明显抑制荷瘤小鼠瘤体的生长。免疫荧光实验结果表明加味白头翁汤能增加荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8

T细胞浸润数量，降低CD206

TAMs浸润数量，且能下调荷瘤小鼠外周血清中细胞因子IL-6、TGF-

、CCL2的分泌水平；在体外实验结果中，加味白头翁汤含药血清无明显的细胞增殖抑制作用，但与RAW264.7细胞共孵育后的细胞上清液却能抑制MC38细胞的增殖活性，且IL-4诱导的M2型巨噬细胞能增强MC38细胞的侵袭能力，这一效应却能被加味白头翁汤含药血清呈浓度依赖性抑制。同时，Real-time PCR检测结果发现加味白头翁汤含药血清能上调M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平，下调M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平，流式细胞术结果也证实了加味白头翁汤含药血清能增加CD86

M1型巨噬细胞复极化数量，这表明加味白头翁汤能诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化以发挥抗肿瘤生长作用。最后，Western blot检测结果表明加味白头翁汤能下调荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R蛋白表达，上调STING、TBK1蛋白表达。

结论

加味白头翁汤能下调CD206

TAMs浸润数量，增加CD8

T细胞浸润，从而发挥对结直肠癌生长抑制的抗肿瘤免疫调节效应，这可能与其调节CSF1R信号，进而活化STING/TBK1信号通路，诱导TAMs表型重塑有关。

Abstract

Objective

This study aims to investigate the effect of modified Baitouwengtang （MBTWD） on tumor growth and the number of tumor-associated macrophages （TAMs） in tumor tissue of MC38 cell tumor-bearing mice with colorectal cancer and explores whether MBTWD mediates the remodeling of TAM phenotype to play an immunologically antitumor effect.

Method

Firstly， The C57BL/6 mouse tumor model grafted subcutaneously was established， and then model mice were classified into a model group， positive control group（3 mg·kg

-1

）， and MBTWD groups with high and low dosages（23.43、46.86 g·kg

-1

）， with 10 mice in each group. In addition， 10 healthy mice were set as the blank group， and the changes in body weight， tumor volume， and survival status of mice in each group were observed. Tumor tissue， spleen， and peripheral blood were collected to calculate the tumor volume change， tumor inhibition rate， and spleen mass. Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe the morphological changes of tumor tissue， and an immunofluorescence assay was used to detect the expression levels of CD4， CD8， and CD206 in tumor tissues of tumor-bearing mice. The secretion levels of transforming growth factor （TGF）-

， interleukin （IL）-6， and chemokine （C-C Motif） ligand 2 （CCL2） in peripheral serum were measured by using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Secondly， a co-culture model induced by IL-4

in vitro

of MC38 cells and murine monocytic macrophage RAW264.7 cells was established. Cell proliferation and activity assay （CCK-8） was used to detect the inhibitory effect of MBTWD containing serum on cell proliferation. A transwell experiment was used to detect the effect of IL-4-induced M2 macrophages on the invasion of MC38 cells. Flow cytometry was used to detect the expression of CD86 on the membrane of M2 macrophages induced by IL-4 with MBTWD containing serum. Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR） was used to detect the effect of MBTWD containing serum on the mRNA expression levels of M1 macrophage-related polarization factors CD86， nitric oxide synthase （iNOS）， and IL-12， as well as M2 macrophage-related polarization factors CD206， CD163， and IL-10 after co-cultivation. Finally， the protein expression levels of colony-stimulating factor 1 receptor （CSF1R）， stimulator of interferon genes （STING）， and TANK binding kinase 1 （TBK1） in tumor tissues of tumor-bearing mice were detected by Western blot.

Result

In vivo

experimental results show that compared with the model group， the MBTWD can significantly inhibit the tumor growth of tumor-bearing mice. Immunofluorescence experiments show that the MBTWD can increase the number of CD8

T cell infiltration in tumor tissue of tumor-bearing mice， reduce the number of CD206

TAMs infiltration， and down-regulate the secretion levels of cytokines IL-6， TGF-

， and CCL2 in peripheral blood of tumor-bearing mice. The results of in vitro experiments show that the MBTWD containing serum has no obvious inhibitory effect on cell proliferation， but the cell supernatant after co-cultivation with RAW264.7 cells can inhibit the proliferation activity of MC38 cells， and the invasion ability of MC38 cells is enhanced by IL-4-induced M2 macrophages. However， this effect can be inhibited in a concentration-dependent manner by the MBTWD containing serum. At the same time， the results of Real-time PCR show that the MBTWD containing serum can up-regulate the mRNA expression levels of M1 macrophage-related polarization factors CD86， iNOS， and IL-12 and down-regulate those of M2 macrophage-related polarization factors CD206， CD163， and IL-10. Flow cytometry results also confirm that the MBTWD containing serum can increase the number of repolarized CD86

M1 macrophages， indicating that MBTWD can induce M2 macrophages to repolarized M1 macrophages to play an anti-tumor growth role. Finally， Western blot results show that MBTWD can down-regulate the expression of CSF1R protein and up-regulate that of STING and TBK1 proteins in tumor tissue of tumor-bearing mice.

Conclusion

MBTWD can down-regulate the infiltration number of CD206

TAMs and increase the infiltration of CD8

T cells， thereby playing an immunologically antitumor effect on the growth inhibition of colorectal cancer， which may be related to regulating CSF1R signaling and then activating STING/TBK1 signaling pathway to induce phenotypic remodeling of TAMs.

关键词

Keywords

references

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