乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬

梁霄; 李娅兰; 张筠昊; 白皓天; 肖展; 孙鑫; 文武龙; 杨婧; 王锐

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20231121

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乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬

药理 | 更新时间：2023-06-30

- 乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬
- Volatile Oil of Linderae Radix Induces Apoptosis and Autophagy of Gastric Cancer AGS Cells via AMPK/mTOR Signaling Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第15期页码：42-50
- 作者机构：
  
  1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040
  2.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150040
- 作者简介：
  
  梁霄，在读硕士，从事新药及新剂型研究，E-mail：3153047158@qq.com
  杨婧，博士，教授，硕士生导师，从事新药开发研究，E-mail：yangjingdr@sina.com；
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(82074271;81603418);黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”科研项目(2020YQ05)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20231121
  中图分类号： R2-0;R22;R242;R2-031;R285.5
- 收稿日期：2023-02-13，
  
  网络出版日期：2023-04-10，
  
  纸质出版日期：2023-08-05
- 稿件说明：
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梁霄,李娅兰,张筠昊等.乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(15):42-50.

LIANG Xiao,LI Yalan,ZHANG Junhao,et al.Volatile Oil of Linderae Radix Induces Apoptosis and Autophagy of Gastric Cancer AGS Cells via AMPK/mTOR Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(15):42-50.
梁霄,李娅兰,张筠昊等.乌药挥发油通过AMPK/mTOR信号通路诱导胃癌AGS细胞凋亡和自噬[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(15):42-50. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20231121.

LIANG Xiao,LI Yalan,ZHANG Junhao,et al.Volatile Oil of Linderae Radix Induces Apoptosis and Autophagy of Gastric Cancer AGS Cells via AMPK/mTOR Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(15):42-50. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20231121.

摘要

目的

研究乌药挥发油对人胃癌细胞AGS凋亡和自噬的的影响，并探讨腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。

方法

利用水蒸气蒸馏法提取乌药挥发油，采用噻唑蓝（MTT）比色法检测乌药挥发油对人胃癌细胞AGS细胞活力的影响，并根据半抑制浓度（IC

）确定最佳给药浓度与时间，用于后续研究；设置空白组、乌药挥发油低、中、高质量浓度组（0、15、30、60 mg·L

-1

）及阳性药环磷酰胺（CTX）组（350 mg·L

-1

）。用不同浓度的乌药挥发油处理AGS细胞48 h，采用细胞集落形成实验检测细胞增殖能力的变化、流式细胞仪检测细胞周期的变化、细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化、苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态的变化、Annexin-V/碘化丙啶（PI）双染法检测AGS细胞凋亡率、吖啶橙（AO）染色观察自噬水平的变化、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测自噬效应蛋白Beclin-1、p62、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、B细胞淋巴瘤因子-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）、剪切的多聚ADP-核糖聚合酶（cleaved PARP）、单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、雷帕霉素机械靶蛋白（mTOR）及磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白表达水平的变化。

结果

与空白组比较，AGS细胞经乌药挥发油干预24、48 h，细胞活性被明显抑制（

0.05，

0.01），呈浓度和时间依赖性；乌药挥发油各浓度组细胞增殖与迁移能力明显降低（

0.05，

0.01），且随浓度的上升抑制能力越明显；乌药挥发油将AGS细胞周期阻滞于G

/M期（

0.05，

0.01），呈浓度依赖性；乌药挥发油各浓度组出现细胞圆化，体积变小并伴随凋亡小体形成等现象，细胞凋亡率明显增加（

0.05，

0.01）；随着乌药挥发油浓度的增加，自噬体数量增加致红色荧光逐渐增强，提示自噬水平的提升；乌药挥发油各浓度组Beclin-1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bax/Bcl-2及AMPK蛋白表达水平明显升高（

0.05，

0.01）；p62与p-mTOR蛋白表达水平明显降低（

0.05，

0.01）。

结论

乌药挥发油通过调节AMPK/mTOR信号通路诱导AGS细胞凋亡和自噬介导的生长抑制。

Abstract

Objective

To investigate the effects of the volatile oil of Linderae Radix on the apoptosis and autophagy of human gastric cancer cell line AGS， and to explore the regulatory role of adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signaling pathway in this process.

Method

The volatile oil of Linderae Radix was extracted by steam distillation， and the effect of the volatile oil on the viability of AGS cells was detected by thiazolyl tetrazolium （MTT） colorimetry. The optimal intervention dose and time were determined according to the half maximal inhibitory concentration （IC

） for subsequent research. The blank， low， medium， and high-dose volatile oil （0， 15， 30， 60 mg·L

-1

） groups and the positive drug cyclophosphamide （CTX， 350 mg·L

-1

） group were designed. AGS cells were treated with different doses of volatile oil for 48 h. The changes in cell proliferation， cycle， and migration were measured by colony formation assay， flow cytometry， and cell scratch test， respectively. Hematoxylin-eosin （HE） staining was employed to observe the changes of cell morphology， Annexin-V/propidium iodide （PI） double staining to measure the apoptosis， and acridine orange （AO） staining to measure the autophagy level of the cells. Western blotting was employed to determine the expression of the autophagy effectors Beclin-1， p62， microtubule-associated protein 1-light chain 3 （LC3）， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， cleaved Caspase-3， cleaved poly ADP-ribose polymerase （PARP）， adenosine monophosphate-activated protein kinase （AMPK）， phosphorylated AMPK （p-AMPK）， mTOR， and phosphorylated mTOR （p-mTOR）.

Result

Compared with the blank group， 24 h and 48 h of intervention with the volatile oil of Linderae Radix inhibited the viability of AGS cells in a concentration- and time-dependent manner （

0.05，

0.01）. Compared with the blank group， the volatile oil decreased the cell proliferation and migration （

0.05，

0.01） and blocked the AGS cell cycle in G

/M phase （

0.05，

0.01） in a concentration-dependent manner. The cells treated with the volatile oil became spherical and smaller， with the formation of apoptotic bodies and increased apoptosis rate （

0.05，

0.01）. As the dose of the volatile oil increased， the number of autophagosomes increased and the red fluorescence gradually enhanced， indicating the elevated level of autophagy. Compared with the blank group， different doses of volatile oil up-regulated the protein levels of Beclin-1， LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ， cleaved Caspase-3， cleaved PARP， Bax/Bcl-2， and AMPK （

0.05，

0.01） and down-regulated the protein levels of p62 and p-mTOR （

0.05，

0.01）.

Conclusion

The volatile oil of Linderae Radix induces the apoptosis and exerts the autophagy-mediated growth inhibition of AGS cells by regulating the AMPK/mTOR signaling pathway.

关键词

Keywords

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