补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力

秦彬喻; 彭冬; 王逸雪; 章时杰; 王奇; 关莉

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补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力

经典名方 | 更新时间：2021-05-17

- 补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力
- Buyang Huanwutang Promoted Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells via Regulating Autophagy Following Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation Injury
- 中国实验方剂学杂志 2021年27卷第11期页码：9-18
- 作者机构：
  
  广州中医药大学基础医学院，广州 510006
- 作者简介：
  
  秦彬喻，硕士，从事中医药防治心脑血管疾病的研究，E-mail：20181104430@stu.gzucm.edu.cn
  关莉，博士，教授，硕士生导师，从事中医药防治心脑血管疾病研究，E-mail：guanli@gzucm.edu.cn
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(8167140990)
- DOI：
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2021-01-05，
  
  网络出版日期：2021-03-31，
  
  纸质出版日期：2021-06-05
- 稿件说明：
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秦彬喻,彭冬,王逸雪等.补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(11):9-18.

QIN Bin-yu,PENG Dong,WANG Yi-xue,et al.Buyang Huanwutang Promoted Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells via Regulating Autophagy Following Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation Injury[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(11):9-18.
秦彬喻,彭冬,王逸雪等.补阳还五汤通过调节自噬促进OGD/R损伤大鼠NSCs增殖、分化能力[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(11):9-18. DOI：

QIN Bin-yu,PENG Dong,WANG Yi-xue,et al.Buyang Huanwutang Promoted Proliferation and Differentiation of Neural Stem Cells via Regulating Autophagy Following Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation Injury[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(11):9-18. DOI：

摘要

目的

探讨补阳还五汤（BDT）对神经干细胞（NSCs）糖氧剥夺/复氧（OGD/R）损伤后增殖、分化的影响。

方法

从SD大鼠海马区域分离培养NSCs，将细胞随机分为5组，分别为常氧组，模型组，BDT组，雷帕霉素（Rapa）组和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合BDT组，常氧组和模型组使用20%空白血清，BDT组使用20%含药血清，Rapa剂量1 μmol·L

-1

，3-MA剂量5 mmol·L

-1

。除常氧组外，其余各组进行糖氧剥夺/复氧。光镜观察细胞形态的变化；免疫荧光检测巢蛋白（nestin）表达，鉴定NSCs；细胞增殖与活性检测法（CCK-8）检测NSCs的存活率；5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶苷（EdU）标记法检测NSCs增殖；Ad-mCherry-GFP-LC3B检测自噬活性；蛋白免疫印记法检测BDT对自噬相关蛋白的影响；免疫荧光法检测脑源性神经营养因子（BDNF），

-微管蛋白Ⅲ（

-tubulin Ⅲ）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。

结果

与常氧组比较，糖氧剥夺/复氧会显著降低大鼠NSCs的细胞活力，与模型组比较，20%BDT含药血清明显改善了大鼠NSCs存活（

0.01）。BDT可以诱导OGD后NSCs自噬小体的产生，与常氧组比较，微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ），Beclin-1表达升高（

0.05，

0.01），p62变化不明显；与模型组比较，BDT组LC3Ⅱ，Beclin-1明显上调（

0.05，

0.01），p62表达下调（

0.01）；Rapa组起到类似效果（

0.05，

0.01），3-MA组抑制了自噬的活性（

0.01）。Ad-mCherry-GFP-LC3B结果显示，与常氧组比较，模型组荧光强度显著增加（

0.01）；与模型组比较，20%BDT含药血清和Rapa组显著增加自噬荧光强度（

0.01），3-MA抑制了自噬活性（

0.01）。免疫荧光结果显示，与常氧组比较，EdU，

β-

tubulin Ⅲ，GFAP和BDNF阳性细胞数显著减少（

0.01）；与模型组比较，20%BDT含药血清和Rapa起到了类似的保护和促进作用（

0.05，

0.01）；3-MA组可以部分阻断BDT的神经保护和分化能力（

0.05）。

结论

BDT预保护可以通过上调自噬减少糖氧剥夺造成的大鼠NSCs损伤，促进增殖、分化。

Abstract

Objective

To investigate the effect of Buyang Huanwutang （BHT） on proliferation and differentiation in neural stem cells （NSCs） after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） injury.

Method

NSCs isolated from the hippocampus of SD rats were cultured and randomly divided into a normoxia group， a model group， a BHT group， a rapamycin （Rapa） group， and a combination group ［autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA） combined with BHT］. The 20% blank serum was used in the normoxia group， and 20% BHT-medicated serum in the BHT group. The doses of Rapa and 3-MA were 1 μmol·L

-1

and 5 mmol·L

-1

， respectively. The cells were subjected to OGD/R except those in the normoxia group. The cell morphology was observed under a light microscope. NSCs were confirmed by immunofluorescence detection of nestin expression. The viability and proliferation of NSCs were assessed by cell counting kit-8 （CCK-8） assay and 5-ethynyl-2-deoxyuridine （EdU） labeling， respectively. Furthermore， Ad-mCherry-GFP-LC3B fluorescence assay was performed to investigate autophagy. The effect of BHT on autophagy-related protein expression was detected by western blot assay. Brain derived neurotrophic factor （BDNF），

-tubulin Ⅲ， and glial fibrillary acidic protein （GFAP） were evaluated by immunofluorescence assay.

Result

OGD/R significantly reduced the cell viability of rat NSCs as compared with the normoxia group. Compared with the model group， the BHT group exhibited significantly improved viability of rat NSCs （

0.01）. BHT induced the production of autophagosomes in NSCs after OGD. The BHT group showed increased expression of microtuble-associated protein 1 light chain 3Ⅱ (LC3Ⅱ） and Beclin-1 （

0.05，

0.01） and slightly changed p62 compared with the normoxia group， and significantly up-regulated LC3Ⅱ and Beclin-1 （

0.05，

0.01） and down-regulated expression of p62 （

0.01） compared with the model group. The Rapa group had similar effect as the BHT group （

0.05，

0.01）， while the combination group inhibited the activity of autophagy （

0.01）. As indicated by the results of ad-mCherry-GFP-LC3B， compared with the normoxia group， the model group showed increased fluorescence intensity （

0.01）， and the BHT and Rapa groups could further increased the fluorescence intensity of autophagy （

0.01）， while the combination group inhibited autophagy activity （

0.01）. Immunofluorescence results revealed that compared with the normoxia group， the model group displayed significantly reduced positive cells of EdU，

-tubulin Ⅲ， GFAP， and BDNF （

0.01）， and the BHT and Rapa groups exerted similar protective and promoting effects （

0.05，

0.01）， while the combination group partially blocked the neuroprotection and differentiation ability of BHT （

0.05）.

Conclusion

BHT pretreatment can effectively protect rat NSCs against OGD-induced injury and promoted proliferation and differentiation by up-regulating autophagy.

关键词

Keywords

references

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