垂序商陆<italic style="font-style: italic">PaAACT</italic>基因克隆和表达分析

刘雅琳; 朱畇昊; 盛芷葳; 陈晶玉; 冯卫生; 郑晓珂; 赵乐

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20192113

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垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

资源与质量评价 | 更新时间：2021-02-09

- 垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析
- Cloning and Expression Analysis of PaAACT Gene from Phytolacca americana
- 中国实验方剂学杂志 2019年25卷第21期页码：124-131
- 作者机构：
  
  1.河南中医药大学　药学院，郑州　 450046；
  2.河南中医药大学　呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，郑州　 450046
- 作者简介：
  
  刘雅琳，硕士，讲师，从事药物分析与复方研究，E-mail：liuyalin_1984@163.com
  赵乐，博士，副教授，从事药用植物分子生物学研究，E-mail：zhaole1983@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(81603232);国家重点研发计划项目(2017YFC1702800);河南省重大科技专项(171100310500)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20192113
  中图分类号： R289; R284.1; R22; R2-031
- 收稿日期：2019-05-02，
  
  网络出版日期：2019-07-19，
  
  纸质出版日期：2019-11-05
- 稿件说明：
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刘雅琳, 朱畇昊, 盛芷葳, 等. 垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019,25(21):124-131.

Ya-lin LIU, Yun-hao ZHU, Zhi-wei SHENG, et al. Cloning and Expression Analysis of PaAACT Gene from Phytolacca americana[J]. Chinese journal of experimental traditional medical formulae, 2019, 25(21): 124-131.
刘雅琳, 朱畇昊, 盛芷葳, 等. 垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019,25(21):124-131. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20192113.

Ya-lin LIU, Yun-hao ZHU, Zhi-wei SHENG, et al. Cloning and Expression Analysis of PaAACT Gene from Phytolacca americana[J]. Chinese journal of experimental traditional medical formulae, 2019, 25(21): 124-131. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20192113.

摘要

目的：

从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase，AACT)基因，进行生物信息学分析和原核表达。

方法：

提取垂序商陆根的总RNA，然后逆转录合成cDNA，在分析垂序商陆转录组数据的基础上，设计

PaAACT

基因的特异性引物，聚合酶链式反应(PCR)扩增

PaAACT

基因的cDNA序列，通过构建原核表达载体pET-32a-PaAACT，诱导表达并且纯化目的蛋白。

结果：

PaAACT

基因开放阅读框为1 254 bp，编码417个氨基酸。生物信息学分析显示PaAACT蛋白的分子式为C

1 914

3 120

538

576

，推测其相对分子质量为43.43 kDa，理论等电点8.90，不稳定系数32.27，属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果，PaAACT蛋白属于硫解酶家族成员，在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。PaAACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示PaAACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导，在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中表达了PaAACT重组蛋白，利用Ni

2＋

亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。

结论：

该研究从垂序商陆中克隆

PaAACT

基因，为下一步测定PaAACT酶催化活性、制备抗体奠定基础，也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。

Abstract

Objective:

To clone the key enzyme gene involved in the biosynthesis of esculentoside A(EsA)

acetoacetyl-CoA transferase(AACT) gene was cloned from

Phytolacca americana

for bioinformatics analysis and prokaryotic expression.

Method:

Total RNA was extracted from the root of

americana

and then cDNA was synthesized through the reverse transcription. Based on analysis of the transcriptome data of

americana

the specific primers of

PaAACT

gene were designed

and the cDNA sequence of

PaAACT

gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR) method. Prokaryotic induction

expression and purification of the target protein were induced through the construction of the prokaryotic expression vector pET-32a-PaAACT.

Result:

The open reading frame (ORF) of

PaAACT

gene was 1 254 bp

and encoded 417 amino acid residues. Bioinformatic analysis showed that the molecular formula of PaAACT protein was C

1 914

3 120

538

576

inferring that its molecular weight was 43.43 kDa

the theoretical isoelectric point was 8.90

and the instability index of PaAACT protein was 32.27

which was a stable protein. According to bioinformatics analysis

PaAACT protein was a member of the thiolase family and contained one conserved site and one active site of the thiolase family at the C-terminal. PaAACT protein may be located in the cytoplasm

without a signal peptide or transmembrane domain. The phylogenetic analysis indicated that PaAACT protein showed the highest homology with AACT protein from polygonaceae plants (such as

Beta vulgaris

). The recombinant PaAACT protein was successfully expressed in

Escherichia coli

BL21(DE3) strain through IPTG induction

and the purified target protein was obtained by Ni

affinity chromatography.

Conclusion:

In this study

the

PaAACT

gene was cloned from

americana

which lays a foundation for further determination of enzyme activity assay of PaAACT and preparation of antibody

and provides the theoretical basis for studying its role in the biosynthesis pathway of EsA.

关键词

Keywords

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