滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

郭思远; 尹艳; 石颖慧; 李佳; 高伟; 张夏楠

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20210411

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

药学基础 | 更新时间：2021-03-29

- 滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达
- Cloning and Prokaryotic Expression of Glycosyltransferase Genes from Paris polyphylla var. yunnanensis
- 中国实验方剂学杂志 2021年27卷第8期页码：126-134
- 作者机构：
  
  1.首都医科大学中医药学院，北京 100069
  2.北京中医药大学中药学院，北京 102488
  3.首都医科大学药学院，北京 100069
- 作者简介：
  
  郭思远，硕士，从事中药资源与分子生药学研究，Tel：010-83950333，E-mail：854013547@qq.com
  高伟，博士，教授，从事中药资源与分子生药学研究，Tel：010-83916572，E-mail：weigao@ccmu.edu.cn
  张夏楠，博士，副教授，从事中药资源与分子生药学研究，Tel：010-83911633，E-mail：xnzhang@ccmu.edu.cn
- 基金信息：
  
  中央本级重大增减支项目(2060302-1806-03);国家自然科学基金面上项目(81974515);北京市自然科学基金面上项目(7182018)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20210411
  中图分类号： R284.2;R289;R22;R2-031
- 收稿日期：2020-11-17，
  
  网络出版日期：2021-01-25，
  
  纸质出版日期：2021-04-20
- 稿件说明：
移动端阅览
郭思远,尹艳,石颖慧等.滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(08):126-134.

GUO Si-yuan,YIN Yan,SHI Ying-hui,et al.Cloning and Prokaryotic Expression of Glycosyltransferase Genes from Paris polyphylla var. yunnanensis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(08):126-134.
郭思远,尹艳,石颖慧等.滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(08):126-134. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20210411.

GUO Si-yuan,YIN Yan,SHI Ying-hui,et al.Cloning and Prokaryotic Expression of Glycosyltransferase Genes from Paris polyphylla var. yunnanensis[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(08):126-134. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20210411.

摘要

目的

克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因（

PpUGT

1，

PpUGT

7），并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达。

方法

试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录，根据滇重楼转录组数据设计特异性引物，克隆基因全长，使用软件对其进行生物信息学分析，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测基因相对表达量，构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。

结果

PpUGT

1和

PpUGT

7分别长1 827 bp和1 380 bp，分别编码608和459个氨基酸，相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa，其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶，PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶。两蛋白均为亲水性蛋白，无跨膜结构，无信号肽，均与同类蛋白具有较高的保守性。实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）结果显示，

PpUGT

1的表达量由高到低依次为根

叶

花

茎，

PpUGT

7的表达量由高到低依次为茎

叶

花

根。此外，成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白。

结论

克隆得到

PpUGT

1和

PpUGT

7基因，证明其在不同植物器官中存在差异表达，并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白，为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础。

Abstract

Objective

To clone the full-length glycosyltransferase genes （

PpUGT

1，

PpUGT

7） related to saponins biosynthesis in

Paris polyphylla

var.

yunnanensis

，and perform bioinformatics analysis，relative expression analysis and prokaryotic expression analysis.

Method

Total RNA was isolated from

P. polyphylla

var.

yunnanensis

with use of the Eastep

Super Total RNA Extraction Kit and converted to cDNA. Specific primers were designed according to the transcriptome data to clone the full-length gene. Relevant software was then used for bioinformatic analysis of the protein sequences. The relative gene expression levels were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR） and the prokaryotic expression vectors were built to heterologously express recombinant protein in

Escherichia coli.

Result

The open reading frame （ORF） of

PpUGT

1 was 1 827 bp，encoding 608 amino acids，and was predicted as a steroid glycosyltransferase；the ORF of

PpUGT

7 was 1 380 bp，encoding 459 amino acids，and was predicted as a triterpenoid glycosyltransferase. The calculated relative molecular mass of two proteins were 67.6 kDa and 51.3 kDa respectively，and both of them were hydrophilic proteins，no transmembrane domain，no signal peptides，both showing high similarity and conservativeness with homologous sequences. The results of Real-time PCR showed that the expression level of

PpUGT

1 was root

leaf

flower

stem；the expression level of

PpUGT

7 was stem

leaf

flower

root. In addition，PpUGTs proteins were expressed in

E. coli

. in a soluble form.

Conclusion

The genes of

PpUGT

1 and

PpUGT

7 were cloned successfully. Real-time PCR showed the genes were expressed differently in different plant organs， and their recombinant proteins were successfully expressed in

Escherichia coli

. This study lays a foundation for functional characterization of PpUGTs and analysis of the biosynthesis pathway of saponins in

Paris polyphylla

var.

yunnanensis

关键词

Keywords

references

CHEN M H ， YE K ， ZHANG B Y ， et al . Paris saponin Ⅱ inhibits colorectal carcinogenesis by regulating mitochondrial fission and NF- κ B pathway ［J］. Pharmacol Res ， 2018 ， 139 ： 273 - 285 .

QIN X J ， SUN D J ， NI W ， et al . Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves of Paris polyphylla var. yunnanensis ［J］. Steroids ， 2012 ， 77 （ 12 ）： 1242 - 1248 .

王跃虎，牛红梅，张兆云，等 . 重楼属植物的药用价值及其化学物质基础［J］. 中国中药杂志， 2015 ， 40 （ 5 ）： 833 - 839 .

WANG G X ， HAN J ， ZHAO L W ， et al . Anthelmintic activity of steroidal saponins from Paris polyphylla ［J］. Phytomedicine ， 2010 ， 17 （ 14 ）： 1102 - 1105 .

刘星，余江丽，刘敏，等 . 近10年甾体皂苷的生物活性研究进展［J］. 中国中药杂志， 2015 ， 40 （ 13 ）： 2518 - 2523 .

赵志莲，刘立敏，李海峰 . 重楼属9种植物根茎中甾体皂苷有效成分的差异［J］. 中国实验方剂学杂志， 2020 ， 26 （ 8 ）： 176 - 181 .

杨远贵，张霁，张金渝，等 . 重楼属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 中草药， 2016 ， 47 （ 18 ）： 3301 - 3323 .

WU X ， WANG L ， WANG G C ， et al . Triterpenoid saponins from rhizomes of Paris polyphylla var. yunnanensis ［J］. Carbohydr Res ， 2013 ， 368 ： 1 - 7 .

张玉波，吴霞，李药兰，等 . 云南重楼的化学成分［J］. 暨南大学学报：自然科学与医学版， 2014 ， 35 （ 1 ）： 66 - 72 .

WANG X ， FAN R ， LI J ， et al . Molecular cloning and functional characterization of a novel （Iso）flavone 4'，7- O -diglucoside glucosyltransferase from Pueraria lobata ［J］. Front Plant Sci ， 2016 ， 7 ： 387 .

HOFER B . Recent developments in the enzymatic O-glycosylation of flavonoids ［J］. Appl Microbiol Biotechnol ， 2016 ， 100 （ 10 ）： 4269 - 4281 .

DAI Y Q ， ZHANG S S ， LIU D C ， et al . Enzymatic biosynthesis of novel bavachin glucosides via Bacillus UDP-glycosyltransferase ［J］. Phytochem Lett ， 2018 ， 23 ： 9 - 14 .

CHEN K ， HE J ， HU Z ， et al . Enzymatic glycosylation of oleanane-type triterpenoids ［J］. J Asian Nat Prod Res ， 2018 ， 20 （ 7 ）： 615 - 623 .

郭溆，罗红梅，宋经元，等 . 糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展［J］. 世界科学技术—中医药现代化， 2012 ， 14 （ 6 ）： 2126 - 2130 .

秦晶晶，孙春玉，张美萍，等 . 植物UDP-糖基转移酶分类、功能以及进化［J］. 基因组学与应用生物学， 2018 ， 37 （ 1 ）： 440 - 450 .

MA B W ， LIU X H ， LU Y ， et al . A specific UDP-glucosyltransferase catalyzes the formation of triptophenolide glucoside from Tripterygium wilfordii Hook. f ［J］. Phytochemistry ， 2019 ， 166 ： 112062 .

LU Y ， MA B W ， GAO J ， et al . Isolation and characterization of a glycosyltransferase with specific catalytic activity towards flavonoids from Tripterygium wilfordii ［J］. J Asian Nat Prod Res ， 2020 ， 22 （ 6 ）： 537 - 546 .

WEN C ， HUANG W ， ZHU X L ， et al . UGT74AN1，a permissive glycosyltransferase from Asclepias curassavica for the regiospecific steroid 3- O -glycosylation ［J］. Org Lett ， 2018 ， 20 （ 3 ）： 534 - 537 .

LOUVEAU T ， ORME A ， PFALZGRAF H ， et al . Analysis of two new arabinosyltransferases belonging to the carbohydrate-active enzyme （CAZY） glycosyl transferase family1 provides insights into disease resistance and sugar donor specificity ［J］. Plant Cell ， 2018 ， 30 （ 12 ）： 3038 - 3057 .

LI Y ， LIN H X ， WANG J ， et al . Glucosyltransferase capable of catalyzing the last step in neoandrographolide biosynthesis ［J］. Org Lett ， 2018 ， 20 （ 19 ）： 5999 - 6002 .

CHRIST B ， XU C ， XU M ， et al . Repeated evolution of cytochrome P450-mediated spiroketal steroid biosynthesis in plants ［J］. Nat Commun ， 2019 ， 10 （ 1 ）： 63 - 77 .

LIVAK K J ， SCHMITTGEN T D . Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 -ΔΔ Ct method ［J］. Methods ， 2001 ， 25 （ 4 ）： 402 - 408 .

LIU M ， KONG J Q . The enzymatic biosynthesis of acylated steroidal glycosides and their cytotoxic activity ［J］. Acta Pharm Sin B ， 2018 ， 8 （ 6 ）： 981 - 994 .

梁会超，王庆华，巩婷，等 . 人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究基本策略及进展［J］. 药学学报， 2015 ， 50 （ 2 ）： 148 - 153 .

GANTT R W ， PELTIER-PAIN P ， THORSON J S . Enzymatic methods for glyco（diversification/randomization） of drugs and small molecules ［J］. Nat Prod Rep ， 2011 ， 28 （ 11 ）： 1811 - 1853 .

王宝婕，朱灵英，周青青，等 . 野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达［J］. 中国实验方剂学杂志， 2019 ， 25 （ 22 ）： 147 - 153 .

徐永艳，孙永玉，徐荣，等 . 滇重楼3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 PpHMGR 基因的克隆及分析［J］. 分子植物育种， 2019 ， 17 （ 14 ）： 4610 - 4616 .

张雪，王希付，赵荣华，等 . 药用植物甾体皂苷生物合成途径研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2020 ， 26 （ 14 ）： 225 - 234 .

NEGI J S ， BISHT V K ， BHANDARI A K ， et al . Paris polyphylla ：chemical and biological prospectives ［J］. Anti Canc Agents Med Chem ， 2014 ， 14 （ 6 ）： 833 - 839 .

浏览量

下载量

CSCD

文章被引用时，请邮件提醒。

提交

工具集

关联资源

野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达

茯苓鲨烯环氧酶基因克隆与表达分析

当归香豆酸-3-羟化酶基因ASC3H的克隆及表达模式与阿魏酸含量相关性分析

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析