益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响

张欣欣; 高飞; 陈素枝; 杨凤文; 檀淼; 檀金川

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20211101

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益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响

药理 | 更新时间：2021-06-25

- 益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响
- Renal Protection of Yishen Tongluo Prescription in Rats with Membranous Nephropathy and Its Influence on AMPK/mTOR/ULK1 Signaling Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2021年27卷第12期页码：57-66
- 作者机构：
  
  1.河北中医学院，石家庄 050200
  2.河北省中医院，石家庄 050011
  3.河北医科大学第四医院，石家庄 050000
- 作者简介：
  
  张欣欣，在读博士，从事中西医结合肾病研究，E-mail：1028342820@qq.com
  檀金川，教授，博士生导师，从事中西医结合肾病研究，E-mail：1955981973@qq.com
- 基金信息：
  
  河北省自然科学基金项目(H2019423037);河北省重点研发计划项目(203777400)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20211101
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2021-01-07，
  
  网络出版日期：2021-04-07，
  
  纸质出版日期：2021-06-20
- 稿件说明：
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张欣欣,高飞,陈素枝等.益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(12):57-66.

ZHANG Xin-xin,GAO Fei,CHEN Su-zhi,et al.Renal Protection of Yishen Tongluo Prescription in Rats with Membranous Nephropathy and Its Influence on AMPK/mTOR/ULK1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(12):57-66.
张欣欣,高飞,陈素枝等.益肾通络方对膜性肾病大鼠的肾保护作用及对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(12):57-66. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211101.

ZHANG Xin-xin,GAO Fei,CHEN Su-zhi,et al.Renal Protection of Yishen Tongluo Prescription in Rats with Membranous Nephropathy and Its Influence on AMPK/mTOR/ULK1 Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(12):57-66. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20211101.

摘要

目的

通过观察益肾通络方对膜性肾病大鼠自噬相关蛋白的影响，探讨其对膜性肾病大鼠肾脏保护作用的可能分子机制。

方法

80只SD大鼠随机抽取20只设为正常组，其余大鼠均采用预免疫和尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）的方法制作膜性肾病大鼠模型。将模型复制成功的SD大鼠随机分为模型组，盐酸贝那普利组（10 mg·kg

-1

）及益肾通络方低、中、高剂量组（6.61，13.22，26.44 g·kg

-1

），给予相应剂量的药物灌胃，每天1次，连续灌胃4周。灌胃结束后，检测大鼠血浆白蛋白（ALB），甘油三酯（TG），胆固醇（TC），血肌酐（SCr），尿素氮（BUN），24 h尿蛋白（UTP）定量指标的变化；苏木素-伊红（HE）染色、马松（Masson）染色、碘酸六胺银（PASM）染色及透射电镜下观测肾脏病理形态改变；免疫荧光法检测肾小球中免疫球蛋白（Ig）G和补体C3的沉积；免疫组化（IHC）法观察自噬标志蛋白Beclin-1，微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ），p62蛋白的表达情况；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测腺苷酸活化蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1（AMPK/mTOR/ULK1）信号通路相关蛋白的表达情况。

结果

与正常组比较，模型组大鼠UTP水平显著升高（

0.01），血清中TG，TC水平显著升高（

0.01），ALB水平显著下降（

0.01）；肾小球结构紊乱，体积增大，基底膜可见不同程度增厚和部分肾小管空泡样变性，大量胶原纤维和嗜复红蛋白沉积，足细胞足突广泛融合，肾小球毛细血管襻IgG和补体C3弥漫性沉积；自噬标志蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ表达显著降低（

0.01），p62蛋白表达显著升高（

0.01）；磷酸化-腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达显著降低（

0.01），磷酸化-雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR），磷酸化-Unc-51样激酶1（p-ULK1）蛋白表达显著升高（

0.01）；与模型组比较，益肾通络方各剂量组、盐酸贝那普利组大鼠TG，TC，UTP水平均有不同程度降低（

0.05，

0.01），ALB水平显著升高（

0.01），血清SCr，BUN水平均差异无统计学意义；肾脏病理损害不同程度减轻；自噬标志蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ表达水平不同程度升高（

0.05，

0.01），p62蛋白表达不同程度降低（

0.05，

0.01）；p-AMPK蛋白表达水平不同程度升高（

0.05，

0.01），p-mTOR，p-ULK1蛋白表达水平不同程度降低（

0.05，

0.01）。

结论

益肾通络方对膜性肾病大鼠具有肾脏保护作用，其机制可能与调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达，激活自噬有关。

Abstract

Objective

To observe the effects of Yishen Tongluo prescription （YTP） on autophagy-related proteins in rats with membranous nephropathy （MN） and explore its possible molecular mechanism in protecting the kidney.

Method

Twenty of 80 Sprague-Dawley （SD） rats were randomly selected as the normal control， and the rest rats were pre-immunized and injected with cationized bovine serum albumin （C-BSA） through the tail vein to induce MN. The SD rats that were successfully modeled were randomized into the model group， benazepril hydrochloride group （10 mg·kg

-1

）， and low- （6.61g·kg

-1

）， medium- （13.22 g·kg

-1

）， and high-dose （26.44 g·kg

-1

） YTP groups， and administered with the corresponding drugs by gavage， once a day， for four consecutive weeks. Then the changes in such quantitative indicators as plasma albumin （ALB）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， serum creatinine （SCr）， blood urea nitrogen （BUN）， and 24-hour urinary total protein （UTP） were detected， followed by hematoxylin and eosin （HE） staining， Masson's trichrome staining， and periodic Schiff-methenamine （PASM） staining for observing the pathological changes in kidney under the transmission electron microscope （TEM）. The deposition of immunoglobulin G （IgG） and complement 3 （C3） in the glomerulus was detected by fluorescence immunoassay. The expression levels of autophagy marker proteins Beclin-1， microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ （LC3Ⅱ）， and p62 were measured by immunohistochemistry （IHC）， and those of related proteins in the adenosine monophosphate-activated protein kinase / mechanisic target of rapamycin/Unc-51-like kinase 1 （AMPK/mTOR/ULK1） signaling pathway were determined by Western blot assy.

Result

Compared with the normal group， the model group exhibited significantly increased UTP （

0.01） and serum TG and TC （

0.01）， decreased ALB （

0.01）， disordered glomerular structure， enlarged volume， thickened basement membrane， vacuolated renal tubules， excessively deposited collagen fibers and fuchsinophilic proteins， extensively fused podocyte foot processes， and diffusely deposited IgG and C3 in glomerular capillary loops. Besides， the expression levels of Beclin-1， LC3II， and phosphorylated AMPK （p-AMPK） decreased （

0.01）， while those of p62， phosphorylated mTOR （p-mTOR）， and phosphorylated ULK1 （p-ULK1） increased （

0.01）. The comparison with the model group revealed that the TG， TC， and UTP levels in the low-， medium-， and high-dose YTP groups and the benazepril hydrochloride group were reduced to varying degrees （

0.05，

0.01）， whereas the ALB level was increased （

0.01）. There was no statistically significant difference in SCr or BUN level. The pathological damages were alleviated. The expression levels of Beclin-1， LC3Ⅱ， and p-AMPK were up-regulated （

0.05，

0.01）， while those of p62， p-mTOR， and p-ULK1 were down-regulated （

0.05，

0.01）.

Conclusion

YTP protects the kidney of rats with MN possibly by regulating related proteins in the AMPK/mTOR/ULK1 signaling pathway and activating the autophagy.

关键词

Keywords

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