基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响

吴俏兰; 宋婷; 陈泽涛; 陈修保; 张宜晨; 陈维达

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20212121

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基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响

药理 | 更新时间：2021-10-21

- 基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响
- Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2021年27卷第22期页码：65-75
- 作者机构：
  
  1.山东中医药大学第一临床医学院，济南 250014
  2.山东中医药大学附属医院，济南 250014
- 作者简介：
  
  吴俏兰，在读硕士，从事中西医结合老年医学相关疾病的研究，E-mail：wuqiaolan717@163.com
  陈维达，博士，副主任医师，从事中西医结合老年医学病防治研究，Tel：0531-68617056，E-mail：chenweida_2000@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(82004281)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20212121
  中图分类号： R22;R242;R2-031;R285.5
- 收稿日期：2021-07-27，
  
  网络出版日期：2021-09-02，
  
  纸质出版日期：2021-11-20
- 稿件说明：
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吴俏兰,宋婷,陈泽涛等.基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(22):65-75.

WU Qiao-lan,SONG Ting,CHEN Ze-tao,et al.Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(22):65-75.
吴俏兰,宋婷,陈泽涛等.基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(22):65-75. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212121.

WU Qiao-lan,SONG Ting,CHEN Ze-tao,et al.Effect of Yiqi Fuzheng Jiedu Decoction on Autophagy and Growth of A549 Cells： An Exploration Based on p53/AMPK Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2021,27(22):65-75. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20212121.

摘要

目的

探讨益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的作用及机制。

方法

制备益气扶正解毒汤含药血清干预A549肺癌细胞。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测A549细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3），自噬关键分子酵母Atg6同系物1（Beclin1），p62，p53蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），磷酸化AMPK（p-AMPK），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白的水平，免疫荧光（IF）检测微管相关蛋白1A/1B轻链3B（MAP1LC3B）蛋白水平，5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EDU）染色、侵袭实验（Transwell）和

-半乳糖苷酶染色分别检测含药血清对细胞增殖、侵袭、衰老情况的影响；设置自噬抑制剂甲基腺嘌呤（3-MA，5 mmol·L

-1

）干预组，即分为10%胎牛血清组（空白组），10%正常血清组（正常组），10%含药血清低、中、高剂量组，10%高剂量含药血清加3-MA（高剂量+3-MA）组，检测各组细胞增殖、侵袭、衰老水平；并设置p53抑制剂（PFT-

， 10 μmol·L

-1

）组，即分为正常组，PFT-

组，高剂量组，高剂量+PFT-

组，检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin1表达水平和MAP1LC3B免疫荧光强度及各组细胞增殖、侵袭、衰老的情况。

结果

与空白组、正常组比较，干预A549细胞48 h，益气扶正解毒汤中、高剂量组LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白水平呈剂量依赖性升高（

0.01）；益气扶正解毒汤低、中、高剂量组p62，p-mTOR/mTOR蛋白下降（

0.05，

0.01），p53，p-AMPK/AMPK蛋白表达升高（

0.01）；益气扶正解毒汤低、中、高剂量组A549细胞增殖、侵袭数量明显降低，细胞衰老数量显著增多（

0.01），同时MAP1LC3B免疫荧光强度增强，且益气扶正解毒汤高剂量组效果最佳；与益气扶正解毒汤高剂量组比较，益气扶正解毒汤高剂量+3-MA组、益气扶正解毒汤高剂量+PFT-

组发生增殖、侵袭的细胞数量均增加，而发生衰老的细胞数量明显减少（

0.05，

0.01），同时，高剂量+PFT-

组的MAP1LC3B免疫荧光强度减弱及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ，Beclin1蛋白表达水平降低（

0.05，

0.01）。

结论

益气扶正解毒汤可经p53/AMPK信号通路上调A549细胞自噬水平，进而抑制A549细胞增殖、侵袭迁移，促进细胞衰老，在抑制肺癌进展中具有重要作用。

Abstract

Objective

To investigate the effect and mechanism of Yiqi Fuzheng Jiedu decoction （YQFZJDD） on autophagy and growth of A549 cells.

Method

A549 cells were intervened with YQFZJDD-containing serum prepared in advance. The levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC3）， homologue of yeast autophagy-related gene 6 （Beclin1）， p62， p53， adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase （AMPK）， phosphorylated AMPK （p-AMPK）， mammalian target of rapamycin （mTOR）， and phosphorylated mTOR （p-mTOR） were detected by Western blot assay， and microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3B （MAP1LC3B） by immunofluorescence （IF） assay. The proliferation， invasion， and senescence of A549 cells were separately measured by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine （EDU） staining， Transwell assay， and

-galactosidase staining. In the presence of autophagy inhibitor 3-methyladenine （3-MA， 5 mmol·L

-1

）， the cells were divided into the 10% fetal bovine serum （blank） group， 10% control serum （control） group， low-， medium-， and high-dose 10% YQFZJDD-containing serum groups， and high-dose 10% YQFZJDD-containing serum + 3-MA group， followed by the measurement of A549 cell proliferation， invasion， and senescence. In the adoption of p53 inhibitor Pifithrin-

（PFT-

， 10 μmol·L

-1

）， the cells were divided into the control group， PFT-

group， high-dose YQFZJDD-containing serum group， and high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group. Then the LC3-Ⅱ and Beclin1 expression， MAP1LC3B fluorescence intensity， as well as A549 cell proliferation， invasion and senescence were determined.

Result

Compared with the blank group and control group， YQFZJDD-containing serum at the medium and high doses up-regulated the protein expression levels of LC3-Ⅱ and Beclin1 in A549 cells after 48-h intervention in a dose-dependent manner （

0.01）. Besides， YQFZJDD-containing serum at the low-， medium-， and high-doses down-regulated p62 and p-mTOR/mTOR expression （

0.05，

0.01）， elevated p53 and p-AMPK/AMPK （

0.01）， decreased the number of proliferative and invasive cells， increased the number of senescent cells （

0.01）， and enhanced the IF intensity of MAP1LC3B， with the optimal effect observed in the high-dose YQFZJDD-containing serum group （

0.01）. Compared with the high-dose YQFZJDD-containing serum group， the high-dose YQFZJDD-containing serum + 3-MA group and high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group exhibited significantly increased proliferative and invasive cells but decreased senescent cells （

0.05，

0.01）. Meanwhile， the IF intensity of MAP1LC3B in the high-dose YQFZJDD-containing serum + PFT-

group was weakened and the LC3-Ⅱ and Beclin1 protein expression levels declined （

0.05，

0.01）.

Conclusion

YQFZJDD promotes the autophagy of A549 cells through the p53/AMPK signaling pathway to inhibit their proliferation， invasion and migration but accelerate senescence， thus playing a crucial role in inhibiting the progression of lung cancer.

关键词

Keywords

references

GAO S ， LI N ， WANG S ， et al . Lung cancer in people's republic of China ［J］. J Thorac Oncol ， 2020 ， 15 （ 10 ）： 1567 - 1576 .

叶松山，刘云鹤，李文涛，等 . 基于网络药理学和生物信息学探究黄芪抗非小细胞肺癌的关键靶点和分子机制［J］. 实用药物与临床， 2020 ， 23 （ 10 ）： 876 - 885 .

王信，马传江，杨培民，等 . 白花蛇舌草抗炎、抗肿瘤作用研究进展［J］. 中国现代应用药学， 2020 ， 37 （ 19 ）： 2420 - 2427 .

曹慧娟，李君，孙淑军，等 . 黄芩素对人肺腺癌A549细胞的药效作用及机制探讨［J］. 中国实验方剂学杂志， 2017 ， 23 （ 2 ）： 98 - 103 .

陈旭，王娟，蒋晓山，等 . 莪术醇对肺癌A549细胞凋亡诱导因子、聚ADP核糖聚合酶及Caspase-3表达的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2011 ， 17 （ 19 ）： 157 - 159 .

米雪，亓润智，花宝金 . 肺癌中医证治规律分析探讨［J］. 时珍国医国药， 2020 ， 31 （ 6 ）： 1510 - 1512 .

陈婷婷，王应天，田甜 . 数据挖掘法浅析中医治疗肺癌用药规律及相关机制［J］. 中国实验方剂学杂志， 2018 ， 24 （ 11 ）： 206 - 210 .

LIU G ， PEI F ， YANG F ， et al . Role of autophagy and apoptosis in non-small-cell lung cancer ［J］. Int J Mol Sci ， 2017 ， 18 （ 2 ）： 367 - 370 .

KRUSE J P ， GU W . Modes of p53 regulation ［J］. Cell ， 2009 ， 137 （ 4 ）： 609 - 622 .

LEVINE B ， KROEMER G . Biological functions of autophagy genes： a disease perspective ［J］. Cell ， 2019 ， 176 （ 1/2 ）： 11 - 42 .

GALLUZZI L ， PIETROCOLA F ， BRAVO-SAN P J ， et al . Autophagy in malignant transformation and cancer progression ［J］. EMBO J ， 2015 ， 34 （ 7 ）： 856 - 880 .

KOCATURK N M ， AKKOC Y ， KIG C ， et al . Autophagy as a molecular target for cancer treatment ［J］. Eur J Pharm Sci ， 2019 ， 134 （ 6 ）： 116 - 137 .

RUSSO M ， RUSSO G L . Autophagy inducers in cancer ［J］. Biochem Pharmacol ， 2018 ， 153 （ 14 ）： 51 - 61 .

程伟，陈新梅 . 中药抗非小细胞肺癌作用机制研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志， 2020 ， 26 （ 24 ）： 227 - 234 .

CICCHINI M ， KARANTZA V ， XIA B . Molecular pathways： autophagy in cancer--a matter of timing and context ［J］. Clin Cancer Res ， 2015 ， 21 （ 3 ）： 498 - 504 .

NAIR A ， JACOB S . A simple practice guide for dose conversion between animals and human ［J］. J Basic Clin Pharma ， 2016 ， 7 （ 2 ）： 27 - 31 .

CHEN X ， MAO R ， SU W ， et al . Circular RNA circHIPK3 modulates autophagy via MIR124-3p-STAT3-PRKAA/AMPKalpha signaling in STK11 mutant lung cancer ［J］. Autophagy ， 2020 ， 16 （ 4 ）： 659 - 671 .

LI X ， QU Z ， JING S ， et al . Dioscin-6'- O -acetate inhibits lung cancer cell proliferation via inducing cell cycle arrest and caspase-dependent apoptosis ［J］. Phytomedicine ， 2019 ， 53 ： 124 - 133 .

SUNG H ， FERLAY J ， SIEGEL R L ， et al . Global Cancer Statistics 2020： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries ［J］. CA Cancer J Clin ， 2021 ， 71 （ 3 ）： 209 - 249 .

王雄文，周岱翰 . 肺癌病发病的病因及藏象经络机制［J］. 时珍国医国药， 2009 ， 20 （ 10 ）： 2641 - 2642 .

ZHANG X ， LIU W ， JIANG H ， et al . Chinese herbal medicine for advanced non-small-cell lung cancer： a systematic review and Meta-analysis ［J］. Am J Chin Med ， 2018 ， 46 （ 5 ）： 923 - 952 .

XIAO Z ， WANG C ， ZHOU M ， et al . Clinical efficacy and safety of Aidi injection plus paclitaxel-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer： a Meta-analysis of 31 randomized controlled trials following the PRISMA guidelines ［J］. J Ethnopharmacol ， 2019 ， 228 （ 1 ）： 110 - 122 .

WANG K ， CHEN Q ， SHAO Y ， et al . Anticancer activities of TCM and their active components against tumor metastasis ［J］. Biomed Pharmacother ， 2021 ， 133 （ 1 ）： 111044 - 111060 .

CASSIDY L D ， YOUNG A R ， PEREZ-MANCERA P A ， et al . A novel Atg5-shRNA mouse model enables temporal control of autophagy in vivo ［J］. Autophagy ， 2018 ， 14 （ 7 ）： 1256 - 1266 .

WANG W ， FAN H ， ZHOU Y ， et al . Knockdown of autophagy-related gene BECLIN1 promotes cell growth and inhibits apoptosis in the A549 human lung cancer cell line ［J］. Mol Med Rep ， 2013 ， 7 （ 5 ）： 1501 - 1505 .

ISLAM M ， SOORO M ， ZHANG P . Autophagic regulation of p62 is critical for cancer therapy ［J］. Int J Mol Sci ， 2018 ， 19 （ 5 ）： 1405 - 1419 .

LIU J ， LIN Y ， YANG H ， et al . The expression of p33ING1， p53， and autophagy-related gene Beclin1 in patients with non-small cell lung cancer ［J］. Tumour Biol ， 2011 ， 32 （ 6 ）： 1113 - 1121 .

PIFFOUX M ， ERIAU E ， CASSIER P A . Autophagy as a therapeutic target in pancreatic cancer ［J］. Br J Cancer ， 2021 ， 124 （ 2 ）： 333 - 344 .

SHAN H ， ZHENG X ， LI M . The effects of astragalus membranaceus active extracts on autophagy-related diseases ［J］. Int J Mol Sci ， 2019 ， 20 （ 8 ）： 1 - 12 .

XIA C ， HE Z ， CAI Y . Quantitative proteomics analysis of differentially expressed proteins induced by astragaloside Ⅳ in cervical cancer cell invasion ［J］. Cell Mol Biol Lett ， 2020 ， 25 （ 1 ）： 1 - 14 .

LU Z ， WANG H ， ZHU M ， et al . Ophiopogonin D'， a natural product from radix ophiopogonis， induces in vitro and in vivo RIPK1-dependent and caspase-independent apoptotic death in androgen-independent human prostate cancer cells ［J］. Front Pharmacol ， 2018 ， doi： 10.3389/fphar.2018.00432 http://dx.doi.org/10.3389/fphar.2018.00432 .

DENG X ， LIU J ， LIU L ， et al . Drp1-mediated mitochondrial fission contributes to baicalein-induced apoptosis and autophagy in lung cancer via activation of AMPK signaling pathway ［J］. Int J Biol Sci ， 2020 ， 16 （ 8 ）： 1403 - 1416 .

GAO J ， MORGAN W A ， SANCHEZ-MEDINA A ， et al . The ethanol extract of Scutellaria baicalensis and the active compounds induce cell cycle arrest and apoptosis including upregulation of p53 and Bax in human lung cancer cells ［J］. Toxicol Appl Pharmacol ， 2011 ， 254 （ 3 ）： 221 - 228 .

赵明哲，刘海英，张晓玲 . 莪术对肺癌大鼠肿瘤抑制作用及对JAK-STAT信号通路的影响［J］. 现代中西医结合杂志， 2020 ， 29 （ 33 ）： 3658 - 3661 .

刘发英，邹阳，杨必成，等 . 莪术醇对人宫颈癌SiHa和HCC94细胞增殖、自噬及凋亡的影响［J］. 中药药理与临床， 2018 ， 34 （ 1 ）： 62 - 66 .

杨培伟 . 半枝莲和白花蛇舌草提取物对HBV相关性肝细胞癌的作用及对circRNAs差异表达的影响［D］. 上海：上海中医药大学， 2019 .

LI Y L ， ZHANG J ， MIN D ， et al . Anticancer effects of 1，3-dihydroxy-2-methylanthraquinone and the ethyl acetate fraction of hedyotis diffusa willd against HepG2 carcinoma cells mediated via apoptosis ［J］. PLoS One ， 2016 ， 11 （ 4 ）： e151502 - e151521 .

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