基于Wnt/<italic style="font-style: italic">β</italic>-catenin通路探讨加味黄芪甘草汤对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响

滕港; 张芮; 周静; 芮红丽; 胡燕灵; 周雨婷; 宋金香; 张念志

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.202202023

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基于Wnt/β-catenin通路探讨加味黄芪甘草汤对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响

经典名方 | 更新时间：2022-09-30

- 基于Wnt/β-catenin通路探讨加味黄芪甘草汤对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响
- Effect of Modified Huangqi Gancaotang on Proliferation， Apoptosis， Invasion， Migration， and Epithelial-mesenchymal Transition of Non-small Cell Lung Cancer Cells Based on Wnt/β-catenin Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2022年28卷第21期页码：10-22
- 作者机构：
  
  1.安徽中医药大学第一临床医学院，合肥 230031
  2.安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031
- 作者简介：
  
  滕港，硕士，医师，从事中医药防治呼吸系统疾病研究，E-mail：tenggangahtcm@163.com
  张念志，博士，主任医师，从事中医药防治呼吸系统疾病研究，E-mail：zhangnz@ahtcm.edu.cn
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(82174312);安徽省中医肺病临床医学研究中心项目(皖科社［2020］41号);安徽省应急科研攻关项目(202004a07020005)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.202202023
  中图分类号： R22;R242;R2-031;R285.5
- 收稿日期：2022-06-08，
  
  网络出版日期：2022-08-17，
  
  纸质出版日期：2022-11-05
- 稿件说明：
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滕港,张芮,周静等.基于Wnt/β-catenin通路探讨加味黄芪甘草汤对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(21):10-22.

TENG Gang,ZHANG Rui,ZHOU Jing,et al.Effect of Modified Huangqi Gancaotang on Proliferation， Apoptosis， Invasion， Migration， and Epithelial-mesenchymal Transition of Non-small Cell Lung Cancer Cells Based on Wnt/β-catenin Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(21):10-22.
滕港,张芮,周静等.基于Wnt/β-catenin通路探讨加味黄芪甘草汤对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(21):10-22. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.202202023.

TENG Gang,ZHANG Rui,ZHOU Jing,et al.Effect of Modified Huangqi Gancaotang on Proliferation， Apoptosis， Invasion， Migration， and Epithelial-mesenchymal Transition of Non-small Cell Lung Cancer Cells Based on Wnt/β-catenin Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(21):10-22. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.202202023.

摘要

目的

探究加味黄芪甘草汤冻干粉对人非小细胞肺癌细胞A549、PC9增殖、凋亡、侵袭、迁移及上皮间质转化的影响及可能的机制。

方法

采用细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测1.0，2.0，4.0，8.0，12.0 g·L

-1

加味黄芪甘草汤冻干粉对非小细胞肺癌细胞增殖的影响；将A549、PC9细胞分为空白组和加味黄芪甘草汤低、中、高组（2.0，4.0，8.0 g·L

-1

）；平板克隆检测加味黄芪甘草汤对细胞克隆能力的影响；Hoechst 33342染色检测加味黄芪甘草汤对细胞凋亡的影响；划痕实验和Transwell小室实验分别检测其迁移与侵袭能力；微球体形成实验观察加味黄芪甘草汤对肿瘤细胞成球能力的影响，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测多能干细胞维持基因八聚体转录因子（Oct-4）、人性别决定区y框蛋白2（Sox2）、同源盒转录因子（Nanog）的mRNA表达水平，评估肿瘤干细胞活性；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2），Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白（Bad），Bcl-2相关X蛋白（Bax），活化与非活化的胱天蛋白酶-3（cleaved Caspase-3、Caspase-3），E-钙黏连蛋白（E-cadherin），N型钙黏蛋白（N-cadherin），波形蛋白（Vimentin），基质金属蛋白酶-2（MMP-2），

-连环蛋白（

-catenin），c-核蛋白类基因（c-Myc），细胞周期蛋白D

（Cyclin D

），锌指转录因子（Slug）蛋白表达水平。

结果

与空白组比较，A549、PC9细胞经1.0，2.0，4.0，8.0，12.0 g·L

-1

加味黄芪甘草汤冻干粉处理24 、48 h，细胞增殖能力均被明显抑制，并呈浓度与时间依赖性（

0.05，

0.01）；加味黄芪甘草汤低、中、高组均能抑制A549、PC9细胞的克隆能力（

0.05，

0.01）；加味黄芪甘草汤高组均能诱导A549、PC9细胞凋亡（

0.01）；加味黄芪甘草汤低、中、高组均能抑制A549、PC9细胞侵袭、迁移能力（

0.05，

0.01）；经加味黄芪甘草汤低、中、高组处理后，A549细胞的微球体体积明显缩小，A549、PC9细胞Oct-4、Sox2和Nanog mRNA表达量均降低（

0.05，

0.01）；加味黄芪甘草汤中、高组均能下调A549、PC9细胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（

0.05，

0.01），上调促凋亡蛋白Bad、Bax及cleaved Caspase-3/Caspase-3的表达（

0.05，

0.01）；加味黄芪甘草汤中、高组均能下调A549、PC9细胞MMP-2、N-cadherin及Vimentin的表达（

0.05，

0.01），上调E-cadherin的表达（

0.05，

0.01）；加味黄芪甘草汤中、高组均能下调A549、PC9细胞

-catenin、c-Myc、Cyclin D

及Slug表达（

0.01）。

结论

加味黄芪甘草汤可抑制人非小细胞肺癌A549、PC9细胞的增殖、侵袭、迁移、肿瘤干细胞活性及上皮间质转化，并能诱导凋亡，作用机制可能与Wnt/

-catenin信号通路有关。

Abstract

Objective

To investigate effect of lyophilized powder of modified Huangqi Gancaotang on proliferation， apoptosis， invasion， migration， and epithelial-mesenchymal transition of human non-small cell lung cancer cells （A549， PC9） and possible mechanism.

Method

Effect of 1.0， 2.0， 4.0， 8.0， 12.0 g·L

-1

modified Huangqi Gancaotang on the proliferation of non-small cell lung cancer cells was detected by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. A549 and PC9 cells were classified into the blank group and the low-， medium-， and high-dose Huangqi Gancaotang groups （2.0， 4.0， 8.0 g·L

-1

）. Plate cloning assay was used to examine the effect of modified Huangqi Gancaotang on cell cloning ability. Hoechst 33342 staining and flow cytometry were employed to detect the apoptosis， and scratch assay and Transwell migration assay were applied to examine cell migration and invasion abilities， respectively. Mammosphere assay was used to examine the sphere-forming ability of tumor cells， and real-time polymerase chain reaction （Real-time PCR） to detect the mRNA expression of stemness-related molecules octamer-binding transcription factor 4 （Oct-4）， human sex-determining region Y-box 2 （Sox2）， and homeobox transcription factor （Nanog） to assess cancer stem cell activity. The protein expression of B-cell lymphoma 2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated death promoter （Bad）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， cleaved Caspase-3， Caspase-3， E-cadherin， N-cadherin， vimentin， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2），

-catenin， c-Myc， Cyclin D

， and zinc-finger transcription factor （Slug） was determined by Western blot.

Result

The proliferation ability of A549 and PC9 cells was significantly inhibited after 24 h and 48 h treatment with 1.0， 2.0， 4.0， 8.0， and 12.0 g·L

-1

lyophilized powder of modified Huangqi Gancaotang compared with that in the blank group and the inhibition was dose- and time-dependent （

0.05，

0.01）. Compared with the blank group， the low-， medium-， and high-dose modified Huangqi Gancaotang suppressed the cloning ability of A549 and PC9 cells （

0.05，

0.01）， and high-dose modified Huangqi Gancaotang induced apoptosis of A549 and PC9 cells （

0.01）. In comparison with the blank group， the low-， medium-， and high-dose modified Huangqi Gancaotang inhibited the invasion and migration of A549 and PC9 cells （

0.05，

0.01）. Compared with the blank group， the low-， medium-， and high-dose modified Huangqi Gancaotang significantly decreased volume of the microspheres of A549 cells and the mRNA expression of Oct-4， Sox2， and Nanog in A549 and PC9 cells （

0.05，

0.01）. Compared with the blank group， the medium- and high-dose modified Huangqi Gancaotang down-regulated the expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 （

0.05，

0.01）， up-regulated the expression of pro-apoptotic proteins Bad， Bax， and cleaved Caspase-3/Caspase-3 （

0.05，

0.01） in A549 and PC9 cells， decreased the expression of MMP-2， N-cadherin， and vimentin （

0.05，

0.01）， and raised the E-cadherin expression （

0.05，

0.01）. Moreover， the medium-dose and high-dose modified Huangqi Gancaotang all reduced the expression of

-catenin， c-Myc， Cyclin D

， and Slug in A549 and PC9 cells （

0.01）.

Conclusion

Modified Huangqi Gancaotang can inhibit the proliferation， invasion， migration， activity of cancer stem cells， and epithelial-mesenchymal transition of human non-small cell lung cancer （A549， PC9） cells and induce apoptosis， and the mechanism is the likelihood that it regulates Wnt/

-catenin signaling pathway.

关键词

Keywords

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