穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选

李静宇; 孙铭阳; 徐世强; 梅瑜; 顾艳; 周芳; 孙伟; 王继华

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20220313

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穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选

药学基础 | 更新时间：2022-02-07

- 穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选
- Screening of Reference Genes of Andrographis paniculata Under MeJA and Abiotic Stresses by Real-time Fluorescence-based Quantitative PCR
- 中国实验方剂学杂志 2022年28卷第5期页码：133-140
- 作者机构：
  
  1.广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广州 510640
  2.广东省道地南药资源保护与利用工程技术研究中心，广州 510640
  3.中国中医科学院中药研究所，北京 100700
- 作者简介：
  
  李静宇，硕士，助理研究员，从事南药栽培与育种研究，Tel：020-87541262，E-mail：15527258440@163.com
  王继华，博士，研究员，从事南药栽培与育种研究，E-mail：wangjihua@gdaas.cn
- 基金信息：
  
  广东省农业科学院作物研究所广东省农作物遗传改良重点实验室开放研究基金项目(202101);广东省农业科学院科技创新战略专项资金（高水平农科院建设）-金颖之星项目(R2019PY-JX003);广东省重点领域研发计划项目(2020B020221001)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20220313
  中图分类号： R284.2;R289;R22;R2-031;R33
- 收稿日期：2021-11-05，
  
  网络出版日期：2021-12-30，
  
  纸质出版日期：2022-03-05
- 稿件说明：
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李静宇,孙铭阳,徐世强等.穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(05):133-140.

LI Jing-yu,SUN Ming-yang,XU Shi-qiang,et al.Screening of Reference Genes of Andrographis paniculata Under MeJA and Abiotic Stresses by Real-time Fluorescence-based Quantitative PCR[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(05):133-140.
李静宇,孙铭阳,徐世强等.穿心莲茉莉酸甲酯及非生物胁迫下Real-time PCR内参基因的筛选[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(05):133-140. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220313.

LI Jing-yu,SUN Ming-yang,XU Shi-qiang,et al.Screening of Reference Genes of Andrographis paniculata Under MeJA and Abiotic Stresses by Real-time Fluorescence-based Quantitative PCR[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(05):133-140. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220313.

摘要

目的

筛选合适的穿心莲茉莉酸甲酯（MeJA）和非生物胁迫下实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测的内参基因。

方法

利用高温、干旱、紫外和MeJA处理的穿心莲转录组数据，挑选到7个候选内参基因肌动蛋白1（

ACT

1），肌动蛋白2（

ACT

2），转录延伸因子（

-1

），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（

GAPDH

），微管蛋白（

TUB

），多聚泛素酶（

UBQ

）和18S核糖体RNA（18

），并以上述处理后的穿心莲叶片为实验材料，进行Real-time PCR验证。利用geNorm，NormFinder 和BestKeeper 3种内参稳定性评估软件进行分析，再利用Refinder软件进行综合分析。

结果

3种软件基于不同指标进行稳定性评估，结果并不相同，综合分析得出候选内参基因在高温胁迫下表达稳定性顺序依次为

UBQ

EF-

ACT

GAPDH

TUB

；干旱胁迫下表达稳定性顺序依次为

ACT

UBQ

EF-

ACT

GAPDH

TUB

；UV胁迫下表达稳定性顺序依次为

EF-

TUB

ACT

UBQ

GAPDH

ACT

；

MeJA胁迫下表达稳定性顺序依次为

ACT

EF-

UBQ

ACT

TUB

GAPDH

。其中18

基因表达丰度较高，不适合作为内参基因。结合转录组数据对4种胁迫中穿心莲内酯合成相关基因酶羟甲基戊二酰-辅酶A合成酶（

HMGS

）的相对表达水平验证，发现合适内参基因的Real-time PCR结果更可靠。

结论

穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA胁迫时，

UBQ

，

ACT

1和

UBQ

，

EF-

和

TUB

，

ACT

1和

EF-

分别为最适内参基因组合，为后期开展穿心莲高温、干旱、紫外和MeJA处理中基因的功能调控和表达研究提供了参考。

Abstract

Objective

To screen the appropriate reference genes for real-time fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction（Real-time PCR）analysis of the

Andrographis paniculata

under methyl jasmonate（MeJA）and various abiotic stresses.

Method

The actin

1（

ACT

1），actin

2（

ACT

2），elongation factor（

EF-

），glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（

GAPDH

），tubulin（

TUB

），polyubiquitin（

UBQ

）， and

18S rRNA（18

）gene were selected as candidate reference genes based on the RNA-seq data of high temperature，drought， UV， and MeJA. The expression of seven candidate reference genes in the

A. paniculata

leaves was assessed by Real-time PCR，and the stability was analyzed by geNorm，NormFinder，BestKeeper， and Refinder.

Result

The results of stability evaluated by geNorm，NormFinder， and BestKeeper were not the same due to different indicators. As analyzed by Refinder， for the stability of the expression， the genes were ranked as

UBQ

EF-

ACT

GAPDH

TUB

under high temperature stress，

ACT

UBQ

EF-

α>

S>ACT

>GAPDH>TUB

under drought stress

，

-1

α>TUB>ACT

>UBQ>

S>GAPDH>ACT

under UV stress

，

and

ACT

EF-

α>UBQ>ACT

S>TUB>GAPDH

under MeJA stress

Among them，18

gene was not suitable as an internal reference gene duo to its high expressive abundance. This study also verified the relative expression level of andrographolide synthesis-related gene hydroxy-methylglutaryl-CoA synthase （

HMGS

） in the four stresses on the basis of transcriptome data，and found that the Real-time PCR results of appropriate internal reference genes were accurate and reliable.

Conclusion

UBQ

ACT

UBQ

，

EF-

TUB

，and

ACT

EF-

were the suitable combinations under stresses of high temperature，drought，UV， and MeJA. This study is expected to provide references for the research on function regulation and expression of genes in

A. paniculata

under high temperature，drought，UV， and MeJA stresses.

关键词

Keywords

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