农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化

滕夕莹; 韩鹏杰; 张雪艳; 周骏辉; 赵玉洋; 黄璐琦; 袁媛

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20220314

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农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化

药学基础 | 更新时间：2022-02-15

- 农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化
- Optimization of Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation System of Armillaria gallica
- 中国实验方剂学杂志 2022年28卷第6期页码：124-130
- 作者机构：
  
  1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013
  2.中国中医科学院中药资源中心，北京 100700
- 作者简介：
  
  滕夕莹，在读硕士，从事中药资源与分子生药学研究，E-mail：xiyingteng@163.com
  黄璐琦，研究员，博士生导师，从事中药资源与分子生药学研究，Tel：010‐84044340，E‐mail：huangluqi01@126.com； *
  袁媛，研究员，博士生导师，从事中药鉴定与分子生药学研究，Tel：010-64087649，E-mail：y_yuan0732@163.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金重大项目(81891013/81891010);中国中医科学院科技创新工程重大攻关项目“分子生药学”;国家科技性基础资源调查专项(2018FY100800);中央本级重大增减支项目(2060302)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20220314
  中图分类号： R284.2;R289;R22;R2-031;R33
- 收稿日期：2021-11-08，
  
  网络出版日期：2021-12-30，
  
  纸质出版日期：2022-03-20
- 稿件说明：
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滕夕莹,韩鹏杰,张雪艳等.农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(06):124-130.

TENG Xi-ying,HAN Peng-jie,ZHANG Xue-yan,et al.Optimization of Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation System of Armillaria gallica[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(06):124-130.
滕夕莹,韩鹏杰,张雪艳等.农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(06):124-130. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.

TENG Xi-ying,HAN Peng-jie,ZHANG Xue-yan,et al.Optimization of Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation System of Armillaria gallica[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(06):124-130. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20220314.

摘要

目的

该研究在已有高卢蜜环菌遗传转化体系的基础上，对遗传转化体系进行优化以提高转化效率，为后续蜜环菌分子标记辅助育种、基因功能的研究奠定基础。

方法

首先构建遗传转化的质粒pH101-PAgGPD-GFP-TrpC，将其转化到大肠埃希菌中扩大培养并提取质粒。提取的质粒分别转化LBA4404，EHA105，GV3101，AGL-1共4种不同的农杆菌。用转化后的农杆菌浸染高卢蜜环菌，筛选出转化率最高的农杆菌。再分别从抗生素种类及浓度、共培养时间、菌液浓度和浸染方法5个方面对农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系进行优化。采用Synbiosis ProtoCol 3测量影像分析仪观察蜜环菌在不同条件下的表型谱。

结果

优化后高卢蜜环菌遗传转化条件为农杆菌菌株采用EHA105，菌液浓度为吸光度

600 nm

=0.6；共培养时间为2 d，浸染方式为负压浸染10 min，初筛培养基为含400 mg·L

-1

头孢噻肟钠，10 mg·L

-1

潮霉素的PDA培养基，复筛培养基为含12 mg·L

-1

潮霉素的PDA培养基。

结论

该研究在已经建立的高卢蜜环菌的遗传转化体系的基础上成功对该体系进行了优化，且优化前后的转化率差异存在明显统计学意义（

0.05），即优化后高卢蜜环菌的转化效率约为4.33%，相比于优化前提高了约8倍。

Abstract

Objective

To optimize the existing genetic transformation system of

Armillaria gallica

to improve the transformation efficiency and lay a foundation for the follow-up research on

Armillaria

molecular marker-assisted breeding and gene function.

Method

The genetically transformed plasmid pH101-PAgGPD-GFP-TrpC was constructed，transformed into

Escherichia coli

，amplified， and cultured，and the plasmid was extracted. The extracted plasmid was transformed into four different agrobacteria LBA4404，EHA105，GV3101，and AGL-1，respectively. The transformed agrobacteria were used for impregnating

A. gallica

，and the agrobacteria with the highest conversion rate were screened out. Then the agrobacterium-mediated genetic transformation system of

A. gallica

was optimized from the type and concentration of antibiotics，co-culture time，concentration of bacterial solution， and impregnation method. The phenotype profiles of

A. gallica

under different conditions were observed using Synbiosis ProtoCol 3.

Result

The optimized genetic transformation conditions of

A. gallica

were as follows： the

Agrobacterium

strain of EHA105 at absorbance

600 nm

=0.6， the co-culture time of 2 d， the infection mode of negative pressure impregnation for 10 min， the primary screening medium of PDA medium containing 400 mg·L

-1

cefotaxime sodium and 10 mg·L

-1

hygromycin，and the secondary screening medium of PDA medium containing 12 mg·L

-1

hygromycin.

Conclusion

In this study，the existing genetic transformation system of

A. gallica

was optimized，and there was a significant difference in the transformation rate before and after optimization （

0.05）. After optimization，the transformation efficiency of

A. gallica

was about 4.33%，which was about eight times higher than that before optimization.

关键词

Keywords

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