苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>诱导的H9c2细胞损伤

汤同娟; 王翔; 左梦雨; 姚娟; 李向阳; 周鹏; 王靓; 黄金玲

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20221104

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苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H₂O₂诱导的H9c2细胞损伤

经典名方 | 更新时间：2022-06-09

- 苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H₂O₂诱导的H9c2细胞损伤
- Protective Effect of Linggui Zhugantang Medicated Serum Against H₂O₂-induced Injury in H9c2 Cells by Regulating PI3K/Akt Signaling Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2022年28卷第13期页码：1-9
- 作者机构：
  
  安徽中医药大学安徽省中医药科学院中西医结合研究所中药复方安徽省重点实验室，合肥 230001
- 作者简介：
  
  汤同娟，在读博士，从事中药复方作用机制研究，E-mail：tangtongjuan@stu.ahtcm.edu.cn
  黄金玲，博士，教授，从事中药复方作用机制研究，E-mail：jinling6181@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(81973844;81373533;82004180);安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2020A0393);安徽中医药大学自然科科学金重点项目(2020zrzd06)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221104
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2022-02-01，
  
  网络出版日期：2022-03-30，
  
  纸质出版日期：2022-07-05
- 稿件说明：
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汤同娟,王翔,左梦雨等.苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H₂O₂诱导的H9c2细胞损伤[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(13):1-9.

TANG Tongjuan,WANG Xiang,ZUO Mengyu,et al.Protective Effect of Linggui Zhugantang Medicated Serum Against H₂O₂-induced Injury in H9c2 Cells by Regulating PI3K/Akt Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(13):1-9.
汤同娟,王翔,左梦雨等.苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H₂O₂诱导的H9c2细胞损伤[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(13):1-9. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221104.

TANG Tongjuan,WANG Xiang,ZUO Mengyu,et al.Protective Effect of Linggui Zhugantang Medicated Serum Against H₂O₂-induced Injury in H9c2 Cells by Regulating PI3K/Akt Signaling Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(13):1-9. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221104.

摘要

目的

研究苓桂术甘汤含药血清对H

诱导的H9c2细胞损伤的保护作用及与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的关系。

方法

采用血清药理学方法，制备空白血清及苓桂术甘汤含药血清。体外培养H9c2细胞，分为空白组、H

组、20%空白血清组、20%苓桂术甘汤含药血清组，给予相应药物处理12 h，再加入100 μmol·L

-1

继续培养6 h后进行检测。采用细胞增殖与活性检测-8（CCK-8）法检测20%苓桂术甘汤含药血清对H

诱导的H9c2细胞增殖活性的影响，荧光探针法检测线粒体活性氧（ROS）水平，比色法检测氧化应激标志物丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的蛋白表达，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测PI3K、Akt mRNA水平，流式细胞术检测细胞凋亡率。加入PI3K抑制剂LY294002后对线粒体ROS、LDH、GSH-Px水平，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达及细胞凋亡率进行检测。

结果

与空白组比较，H

诱导后细胞活力显著降低（

0.01），线粒体ROS、MDA及LDH水平显著增加（

0.01），CAT、GSH-Px水平则显著下降（

0.01），PI3K、Akt蛋白的磷酸化及mRNA水平明显降低（

0.05，

0.01），细胞凋亡率显著升高（

0.01）。与H

组比较，苓桂术甘汤含药血清能够提高H9c2细胞活力，显著降低线粒体ROS、MDA及LDH水平（

0.01），并显著提高CAT、GSH-Px水平（

0.01），促进PI3K、Akt的磷酸化及mRNA的表达（

0.05，

0.01），显著减少细胞凋亡率（

0.01）。苓桂术甘汤含药血清与抑制剂LY294002联用后，逆转了苓桂术甘汤含药血清对H9c2细胞的上述作用（

0.05，

0.01）。

结论

苓桂术甘汤含药血清保护H

诱导的H9c2细胞损伤可能与调控PI3K/Akt信号通路减轻氧化应激及细胞凋亡有关。

Abstract

Objective

To investigate the protective effect of Linggui Zhugantang （LGZGT）-medicated serum against H

-induced injury in H9c2 cells and its relationship with the phosphatidylinositol 3- kinase/protein kinase B （PI3K/Akt） signaling pathway.

Method

The LGZGT-medicated serum and blank serum were prepared based on serum pharmacology. H9c2 cells were cultured

in vitro

and divided into a normal group， an H

group， a 20% blank serum group， and a 20% LGZGT-medicated serum group. The cells were treated with corresponding drugs for 12 h and cultured with 100 μmol·L

-1

for another 6 h. The effect of 20% LGZGT-medicated serum on the proliferation activity of H9c2 cells induced by H

was detected by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. Mitochondrial reactive oxygen species （ROS） level was detected by the fluorescence probe. The levels of malondialdehyde （MDA）， lactate dehydrogenase （LDH）， catalase （CAT）， and glutathione peroxidase （GSH-Px） were detected by colorimetry. Western blot was used to detect the protein expression levels of phosphoinositide 3-kinase （PI3K）， phosphorylated-PI3K （p-PI3K）， protein kinase B （Akt）， and phosphorylated-Akt （p-Akt）. Real-time fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR） was used to detect mRNA expression of PI3K and Akt. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. After the addition of PI3K inhibitor LY294002， the levels of mitochondrial ROS， LDH， and GSH-Px， protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， and p-Akt， and cell apoptosis rate were detected.

Result

Compared with the normal group， the H

group showed blunted cell viability （

0.01）， increased levels of mitochondrial ROS， MDA， and LDH （

0.01）， decreased levels of CAT and GSH-Px （

0.01）， reduced phosphorylation and mRNA expression of PI3K and Akt （

0.05，

0.01）， and increased apoptosis rate （

0.01）. Compared with the H

group， the 20% LGZGT-medicated serum group showed potentiated cell viability， reduced levels of mitochondrial ROS， MDA， and LDH （

0.01）， increased levels of CAT and GSH-Px （

0.01）， up-regulated phosphorylation and mRNA expression of PI3K and Akt （

0.05，

0.01）， and decreased apoptosis rate （

0.01）. The combined use of LGZGT-medicated serum and inhibitor LY294002 reversed the above-mentioned effects of LGZGT-medicated serum on H9c2 cells （

0.05，

0.01）.

Conclusion

The protective effect of LGZGT-medicated serum on H

-induced H9c2 cell injury may be related to the regulation of the PI3K/Akt signaling pathway to reduce oxidative stress and apoptosis.

关键词

Keywords

references

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DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221104

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苓桂术甘汤含药血清通过PI3K/Akt信号通路保护H₂O₂诱导的H9c2细胞损伤

Protective Effect of Linggui Zhugantang Medicated Serum Against H₂O₂-induced Injury in H9c2 Cells by Regulating PI3K/Akt Signaling Pathway