基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响

张静; 张宇; 唐露露; 陈怀珍; 金姗; 杨文明

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20221236

您当前的位置：

首页 >

文章列表页 >

基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响

肝豆状核变性中医病因病机理论创新及中医药干预机制研究专题 | 更新时间：2022-05-18

- 基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响
- Effect of Gandou Decoction on Mitophagy in Toxic Milk （TX） Mouse Model of Wilson Disease Based on Pink1/Parkin Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2022年28卷第12期页码：111-118
- 作者机构：
  
  1.安徽中医药大学第一附属医院，合肥 230031
  2.安徽中医药大学新安医学中心，合肥 230012
- 作者简介：
  
  张静，博士，副主任医师，从事神经系统变性疾病研究，E-mail：zj5125115@163.com
  杨文明，教授，主任医师，博士生导师，从事神经系统变性疾病研究，E-mail：yangwm8810@126.com
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金青年基金项目(82104783)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20221236
  中图分类号： R2-0;R33;R289
- 收稿日期：2021-11-18，
  
  网络出版日期：2022-03-24，
  
  纸质出版日期：2022-06-20
- 稿件说明：
移动端阅览
张静,张宇,唐露露等.基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(12):111-118.

ZHANG Jing,ZHANG Yu,TANG Lu-lu,et al.Effect of Gandou Decoction on Mitophagy in Toxic Milk （TX） Mouse Model of Wilson Disease Based on Pink1/Parkin Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(12):111-118.
张静,张宇,唐露露等.基于Pink1/Parkin通路探讨肝豆汤对Wilson病TX模型小鼠的线粒体自噬的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(12):111-118. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221236.

ZHANG Jing,ZHANG Yu,TANG Lu-lu,et al.Effect of Gandou Decoction on Mitophagy in Toxic Milk （TX） Mouse Model of Wilson Disease Based on Pink1/Parkin Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2022,28(12):111-118. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221236.

摘要

目的

观察肝豆汤（GDD）对Wilson病毒奶小鼠（TX）模型海马神经元细胞的线粒体自噬影响，并通过研究PTEN诱导激酶1（Pink1）/E3泛素连接酶（Parkin）介导的线粒体自噬通路，探讨肝豆汤对神经元细胞损伤的保护机制。

方法

60只小鼠分为空白组、模型组、肝豆汤低、中、高剂量组（5.5、11、22 g·kg

-1

）和青霉胺组（0.09 g·kg

-1

），予以相应灌胃8周。采用Morris水迷宫、悬挂实验及爬杆实验检测行为学；苏木素-伊红（HE）染色结合透射电镜观测细胞凋亡、超微结构、细胞自噬及线粒体结构。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测神经元细胞Pink1、Parkin、自噬标记蛋白（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）、p62的mRNA表达水平，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62蛋白的表达。

结果

与空白组比较，模型组小鼠定位巡航时间延长，穿越平台次数减少，悬挂得分降低，爬杆时间显著延长（

0.01）；与模型组比较，肝豆汤中、高剂量及青霉胺组小鼠定位巡航时间缩短，穿越平台次数增多，悬挂得分上升，爬杆时间缩短（

0.01）。与空白组比较，模型组神经元细胞损伤显著，自噬体增多；与模型组比较，肝豆汤中、高剂量组及青霉胺组神经元细胞损伤改善显著，自噬体减少。与空白组比较，模型组MDA、ROS水平升高，SOD水平下降（

0.01）；与模型组比较，肝豆汤低、中、高剂量组MDA、ROS下降，SOD水平显著上升（

0.01）。与空白组比较，模型组Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA表达水平上升，p62表达水平下降（

0.05）；与模型组比较，肝豆汤中、高剂量组Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白及mRNA表达水平下降，p62明显上升（

0.05，

0.01）。

结论

肝豆汤显著的抑制TX小鼠海马神经元线粒体过度自噬，保护神经元细胞的损伤，其机制考虑可能为通过调控Pink1/Parkin通路而实现。

Abstract

Objective

To investigate the effects of Gandou decoction （GDD） on the mitophagy of hippocampal neurons in toxic milk （TX） mouse model of Wilson disease and explore the protective mechanism of GDD against neuron injury through the PTEN induced kinase 1 （Pink1） /E3 ubiquitin ligase （Parkin） pathway.

Method

Sixty mice were randomly divided into a blank group， a model group， a penicillamine group （0.09 g·kg

-1

）， and low- （5.5 g·kg

-1

）， medium- （11 g·kg

-1

）， and high-dose （22 g·kg

-1

） GDD groups， and treated correspondingly by gavage for 8 weeks. Morris water maze， traction test， and pole test were used for the evaluation of animal behaviors. Hematoxylin-eosin （HE） staining and transmission electron microscopy were used to observe cell apoptosis， ultrastructure， autophagy， and mitochondrial structure. The levels of superoxide dismutase （SOD）， reactive oxygen species （ROS）， and malondialdehyde （MDA） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Real-time fluorescence-based quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR） was used to detect the mRNA expression of Pink1， Parkin， autophagy-associated protein Beclin-1， microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ （LC3Ⅱ）， and p62. Western blot was conducted to detect the protein expression of Pink1， Parkin， Beclin-1， LC3Ⅱ/Ⅰ， and p62.

Result

Compared with the blank group， the model group showed prolonged escape latency， decreased times of platform crossing， lower score in the traction test， and longer pole climbing time （

0.01）. Compared with the model group， the medium- and high-dose GDD groups and the penicillamine group showed shortened escape latencies， increased times of platform crossing， higher scores in the traction test， and shortened pole climbing time （

0.01）. Compared with the blank group， the model group displayed severely damaged neurons and increased autophagosomes. Compared with the model group， the medium- and high-dose GDD groups and the penicillamine group showed improved neuron damage and reduced autophagosomes. The levels of ROS and MDA were higher and SOD was lower in the model group than those in the blank group （

0.01）， while the levels of the above indicators were reversed by GDD intervention as compared with the model group （

0.01）. Compared with the blank group， the model group exhibited up-regulated mRNA and protein expression of Pink1， Parkin， LC3Ⅱ， and Beclin-1 and down-regulated p62 （

0.05）. Compared with the model group， the medium- and high-dose GDD groups showed reduced mRNA and protein expression of Pink1， Parkin， LC3Ⅱ， and Beclin-1 and increased p62 （

0.05，

0.01）.

Conclusion

GDD can significantly inhibit the excessive mitophagy in neurons of TX mice and protect neurons from damage. The mechanism may be related to the regulation of the Pink1/Parkin pathway.

关键词

Keywords

references

CZLONKOWSKA A ， LITWIN T ， DUSKE P ， et al . Wilson disease ［J］. Nat Rev Dis Primers ， 2018 ， 4 （ 1 ）： 21 .

ALA A ， WALKER A P ， ASHKAN K ， et al . Wilson's disease ［J］. Lancet ， 2007 ， 369 （ 9559 ）： 397 - 408 .

ZHANG S W ， FENG J N ， CAO Y ， et al . Autophagy prevents autophagic cell death in Tetrahymena in response to oxidative stress ［J］. Zool Res ， 2015 ， 36 （ 3 ）： 167 - 173 .

MATSUI Y ， TAKAGI H ， QU X ， et al . Distinct roles of autophagy in the heart during ischemia and reperfusion：Roles of AMP-activated protein kinase and Beclin-1 in mediating autophagy ［J］. Circ Res ， 2007 ， 100 （ 6 ）： 914 - 922 .

POLISHCHUK E V ， MERROLLA A ， LICHTMANNEGGER J ， et al . Activation of autophagy，observed in liver tissues from patients with wilson disease and from ATP7B-deficient animals，protects hepatocytes from copper-induced apoptosis ［J］. Gastroenterology ， 2019 ， 156 （ 4 ）： 1173 - 1189 .

KANG Z ， QIAO N ， LIU G ， et al . Copper-induced apoptosis，and autophagy through oxidative stress-mediated mitochondrial dysfunction in male germ cells ［J］. Toxicol In Vitro ， 2019 ， doi： 10.1016/j.tiv.2019.104639 http://dx.doi.org/10.1016/j.tiv.2019.104639 .

SCHILSKY M . Treatment of Wilson's disease：What are the relative roles of penicillamine，trientine，and zinc supplementation？［J］. Curr Gastroenterol Rep ， 2001 ， 3 （ 1 ）： 54 - 59 .

LITWIN T ， DZIEZYC K ， CZLONKOWSKA A . Wilson disease-treatment perspectives ［J］. Ann Transl Med， 2019 ， 7 （ 2 ）： S68 .

LI W J ， CHEN C ， YOU Z F ， et al . Current drug managements of Wilson's disease：From west to east ［J］. Curr Neuropharmacol ， 2016 ， 14 （ 4 ）： 322 - 325 .

张静，方媛，崔圣伟，等 . 肝豆汤联合二巯基丙磺酸钠对湿热内蕴型肝豆状核变性患者的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2017 ， 23 （ 17 ）： 190 - 194 .

张静，陈怀珍，李良勇，等 . 肝豆汤联合DMPS治疗对肝豆状核变性门脉血流动力学的影响［J］. 新中医， 2014 ， 46 （ 1 ）： 57 - 59 .

张静，陈怀珍，艾文龙，等 . 肝豆汤联合DMPS驱铜治疗对Wilson病湿热内蕴型认知功能障碍的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2018 ， 24 （ 15 ）： 210 - 215 .

周晟 . 肝豆汤对高铜诱导的HT-22细胞线粒体自噬效应及其作用机制的研究［D］. 合肥：安徽中医药大学， 2019 .

ROBERTS E A ， ROBINSONBH Y . Mitochondrial structure and function in the untreated Jackson toxic milk （TX-J） mouse，a model for Wilson disease ［J］. Mol Genet Metab ， 2008 ， 93 （ 1 ）： 54 - 65 .

徐叔云，卞如濂，陈修 . 药理实验方法学［M］. 人民卫生出版社， 2003 .

NUNEZ J . Morris water maze experiment ［J］. J Vis Exp ， 2008 ， 19 （ 19 ）： e897 .

ZHANG J ， TANG L L ， LI L Y ， et al . Gandouling tablets inhibit excessive mitophagy in toxic milk （TX） model mouse of Wilson disease via Pink1/Parkin pathway ［J］. Evid Based Complementary Altern Med ， 2020 ， doi： 10.1155/2020/3183714 http://dx.doi.org/10.1155/2020/3183714 .

OHNO Y ， SHIMIZU S ， IMAKI J ， et al . Evaluation of the antibradykinetic actions of 5-HT1A agonists using the mouse pole test ［J］. Prog Neuro-psychoph ， 2008 ， 32 （ 5 ）： 1302 - 1307 .

POUJOIS A ， MIKOL J ， WOIMANT F . Wilson disease：Brain pathology ［J］. Handb Clin Neurol ， 2017 ， 142 ： 77 - 89 .

SEO G H ， KIM Y M ， OH S H ， et al . Biochemical and molecular characterisation of neurological Wilson disease ［J］. J Med Genet ， 2018 ， 55 （ 9 ）： 587 - 593 .

唐露露，张静，魏涛华，等 . 肝豆扶木汤对CuCl 2 诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用和机制［J］. 中国实验方剂学杂志， 2021 ， 27 （ 12 ）： 48 - 56 .

黄雅楠，董健健，徐陈陈，等 . 肝豆汤对Wilson病模型高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应的影响及其作用机制［J］. 中国实验方剂学杂志， 2019 ， 25 （ 7 ）： 61 - 67 .

夏金婵，从人愿，袁静，等 . 黄芩苷通过p38 MAPK/NLRP3通路对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2022 ， 28 （ 2 ）： 79 - 86 .

吴娜，万治平，曾娟，等 . 黄芩汤对溃疡性结肠炎小鼠氧化应激及铁死亡相关指标GSH-Px4，p53，SLC7A11的影响［J］. 中国实验方剂学杂志， 2021 ， 27 （ 8 ）： 17 - 24 .

ZHEND X Y ， YANG S M ， ZHANG R ， et al . Emodin-induced autophagy against cell apoptosis through the PI3K/Akt/mTOR pathway in human hepatocytes ［J］. Drug Des Dev Ther ， 2019 ， 13 ： 3171 - 3180 .

MA C ， WEN B ， ZHANG Q ， et al . Emodin induces apoptosis and autophagy of fibroblasts obtained from patient with ankylosing spondylitis ［J］. Drug des dev ther ， 2019 ， 13 ： 601 - 609 .

DAGDA R K ， CHU C T . Mitochondrial quality control：Insights on how Parkinson's disease related genes PINK1，parkin，and Omi/HtrA2 interact to maintain mitochondrial homeostasis ［J］. J Bioenerg Biomembr ， 2009 ， 41 （ 6 ）： 473 - 479 .

DEAS E ， WOOD N . Mitophagy and Parkinson's disease：The PINK1-parkin link ［J］. Biochim Biophys Acta ， 2011 ， 1813 （ 4 ）： 623 - 633 .

QUNINN P ， MOREIRA P I ， AMBROSIO A ， et al . PINK1/PARKIN signalling in neurodegeneration and neuroinflammation ［J］. Acta Neuropathol Com ， 2020 ， 8 （ 1 ）： 189 .

KANG R ， ZEH H J ， LOTZE M T ， et al . The Beclin-1 network regulates autophagy and apoptosis ［J］. Cell Death Differ ， 2011 ， 18 （ 4 ）： 571 - 580 .

HARA T ， NAKAMURA K ， MATSUI M ， et al . Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice ［J］. Nature ， 2006 ， 441 （ 7095 ）： 885 - 889 .

KHANDELWAL P J ， HOE H S ， MOUSSA C E . Parkin mediates beclin-dependent autophagic clearance of defective mitochondria and ubiquitinated A β in AD models ［J］. Hum Mol Genet ， 2011 ， 20 （ 11 ）： 2091 - 2102 .

TANIDA I ， UENO T ， KOMINAMI E . LC3 and Autophagy ［J］. Methods Mol Biol ， 2008 ， 445 ： 77 - 88 .

SETO S ， TSUJIMURA K ， HORII T ， et al . Autophagy adaptor protein p62/SQSTM1 and autophagy-related gene Atg5 mediate autophagosome formation in response to Mycobacterium tuberculosis infection in dendritic cells ［J］. PLoS One ， 2013 ， 8 （ 12 ）： e86017 .

REED E ， LUTSENKO S ， BANDMANN O . Animal models of Wilson disease ［J］. J Neurochem ， 2018 ， 146 （ 4 ）： 356 - 373 .

浏览量

下载量

CSCD

文章被引用时，请邮件提醒。

提交

工具集

关联资源

基于PINK1/LETM1信号通路探讨何首乌苷减轻脑缺血再灌注损伤的作用机制

基于PINK1/Parkin信号通路介导线粒体自噬探讨化浊解毒方治疗溃疡性结肠炎的作用机制

清心解瘀颗粒调控线粒体自噬对C57B/L6小鼠心肌梗死后心室重构的影响

基于GluR2/Parkin信号介导的线粒体自噬探讨左归降糖解郁方改善糖尿病并发抑郁症大鼠海马突触微环境损伤的机制

加味桂枝茯苓汤通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬途径减轻PDPN大鼠坐骨神经损伤的作用机制