基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制

刘姣; 杨阳; 何悦双; 尤凤鸣; 石丹宁; 赵丕文

doi:10.13422/j.cnki.syfjx.20230104

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基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制

药理 | 更新时间：2023-02-15

- 基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制
- Regulatory Mechanism of Berberine in Inhibiting Apoptosis and Autophagy in Ovarian Granulosa Cells Based on SIRT1/FoxO1 Pathway
- 中国实验方剂学杂志 2023年29卷第6期页码：79-87
- 作者机构：
  
  北京中医药大学生命科学学院，北京 102488
- 作者简介：
  
  刘姣，在读硕士，从事中医药防治女性生殖内分泌疾病研究，E-mail：20200931185@bucm.edu.cn
  赵丕文，教授，博士生导师，从事中医药防治女性生殖内分泌疾病研究，E-mail：pwzhao@263.net
- 基金信息：
  
  国家自然科学基金项目(81673764);北京中医药大学科研创新团队项目(2019-JYB-TD-006)
- DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20230104
  中图分类号： R2-0;R22;R285.5;R289;R33
- 收稿日期：2022-08-29，
  
  网络出版日期：2022-11-29，
  
  纸质出版日期：2023-03-20
- 稿件说明：
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刘姣,杨阳,何悦双等.基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(06):79-87.

LIU Jiao,YANG Yang,HE Yueshuang,et al.Regulatory Mechanism of Berberine in Inhibiting Apoptosis and Autophagy in Ovarian Granulosa Cells Based on SIRT1/FoxO1 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(06):79-87.
刘姣,杨阳,何悦双等.基于SIRT1/FoxO1通路探究小檗碱抑制卵巢颗粒细胞凋亡与自噬的调节机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(06):79-87. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230104.

LIU Jiao,YANG Yang,HE Yueshuang,et al.Regulatory Mechanism of Berberine in Inhibiting Apoptosis and Autophagy in Ovarian Granulosa Cells Based on SIRT1/FoxO1 Pathway[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2023,29(06):79-87. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230104.

摘要

目的

通过观察小檗碱（BBR）对卵巢颗粒细胞衰老的影响，探究其保护作用及调节机制。

方法

应用H

诱导建立人卵巢颗粒样肿瘤（KGN）细胞衰老模型；设置空白组、模型组、BBR高剂量（1 μmol·L

-1

）组和BBR低剂量（0.5 μmol·L

-1

）组，模型组与BBR组加入浓度为10 μmol·L

-1

，孵育40 min。通过细胞增殖与活性检测（CCK-8）分析检测BBR对KGN细胞增殖的影响；通过

-半乳糖苷酶染色检测BBR对KGN细胞衰老状态的影响；应用流式细胞术检测BBR对KGN细胞凋亡和ROS含量的影响；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测BBR对KGN细胞抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）/促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bax）比值、胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、叉头框转录因子O1（FoxO1）及过氧化氢酶（CAT）mRNA表达的影响；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测BBR对KGN细胞沉默信息调节因子1（SIRT1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、FoxO1、自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3BⅡ）、自噬关键分子酵母Atg6（Beclin-1）及泛素结合蛋白p62蛋白表达的影响。

结果

诱导40 min后，与空白组比较，模型组细胞增殖率显著下降（

0.01）；与模型组比较，BBR干预组细胞增殖率明显上升（

0.05）；

-半乳糖苷酶染色结果显示，与空白组比较，模型组细胞呈现明显的衰老状态（

0.01），BBR干预组细胞衰老情况较模型组显著降低（

0.01）；流式细胞术检测显示，与空白组比较，模型组细胞凋亡率显著上升（

0.01），BBR干预组细胞凋亡率较模型组明显降低（

0.05）；同时，与空白组比较，模型组ROS含量显著增加（

0.01）；与模型组比较，BBR干预组细胞ROS含量显著降低（

0.01）；Real-time PCR结果显示，与空白组比较，模型组KGN细胞CAT、Bcl-2/Bax mRNA表达明显降低，Caspase-3与FoxO1 mRNA表达明显增加（

0.05）；与模型组比较，BBR干预后KGN细胞CAT与Bcl-2/Bax mRNA表达明显增加（

0.05），Caspase-3与FoxO1 mRNA表达较模型组明显降低（

0.05）。Western blot结果显示，与空白组比较，模型组SIRT1、SOD2及p62蛋白水平显著降低（

0.01），JNK、FoxO1、LC3BⅡ与Beclin-1蛋白水平明显升高（

0.05）；BBR干预后，SIRT1、SOD2及p62蛋白水平较模型组显著增加（

0.01），JNK、FoxO1、LC3BⅡ与Beclin-1蛋白水平较模型组明显降低（

0.05）。

结论

BBR具有抑制卵巢颗粒细胞衰老效应，其机制与通过SIRT1/FoxO1通路介导抑制细胞凋亡与自噬有关。

Abstract

Objective

To investigate the protective effect and regulatory mechanism of berberine （BBR） against the senescence of ovarian granulosa cells.

Method

A cell senescence model in the human ovarian granulosa-like tumor （KGN） cell line was induced by H

. A control group， a model group， and high-dose （1 μmol·L

-1

） and low-dose （0.5 μmol·L

-1

） BBR groups were set up. The cells in the model group and the BBR groups were incubated with 10 μmol·L

-1

for 40 min. The effect of BBR on KGN cell proliferation was detected by cell counting kit-8 （CCK-8） assay. The effect of BBR on the senescence of KGN cells was detected by

-galactosidase staining. The effects of BBR on the apoptosis and ROS content of KGN cells were detected by flow cytometry. The effects of BBR on the mRNA expression of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）/Bcl-2-associated X protein （Bax）， cysteinyl aspartate-specific protease-3 （Caspase-3）， forkhead transcription factor O1 （FoxO1）， and catalase （CAT） was detected by Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （Real-time PCR）. Western blot was used to detect the effects of BBR on protein expression of silent information regulator1 （SIRT1）， superoxide dismutase 2 （SOD2）， c-Jun N-terminal kinase （JNK）， FoxO1， autophagy-associated protein microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ （LC3BⅡ）， mammalian ortholog of yeast Atg6 （Beclin-1）， and ubiquitin-binding protein p62.

Result

After H

induction for 40 min， the cell proliferation rate of the model group decreased compared with that of the control group （

0.01）， and the cell proliferation rates of the BBR groups increased compared with that of the model group （

0.05）. The results of

-galactosidase staining showed that the cells of the model group showed significant senescence compared with those of the control group （

0.01）， and the cellular senescence in the BBR groups was reduced compared with that of the model group （

0.01）. As revealed by flow cytometry， compared with the control group， the model group showed increased apoptosis rate （

0.01）， and compared with the model group， BBR groups showed decreased apoptosis rates （

0.05）. Meanwhile， the ROS content in the model group increased compared with that in the control group （

0.01）， and compared with the model group， the BBR groups showed reduced cellular ROS content （

0.01）. The Real-time PCR results showed that compared with the control group， the model group showed decreased mRNA expression of CAT and Bcl-2/Bax in KGN cells and increased mRNA expression of Caspase-3 and FoxO1 （

0.05）， and compared with the model group， the BBR groups showed increased mRNA expression of CAT and Bcl-2/Bax （

0.05） and reduced mRNA expression of Caspase-3 and FoxO1 in KGN cells （

0.05）. As revealed by Western blot results， SIRT1， SOD2， and p62 protein levels decreased in the model group compared with those in the control group （

0.01）， and JNK FoxO1， LC3BⅡ， and Beclin-1 protein levels increased （

0.05）. After BBR intervention， SIRT1， SOD2， and p62 protein levels increased （

0.01）， and JNK， FoxO1， LC3BⅡ， and Beclin-1 protein levels decreased compared with those in the model group （

0.05）.

Conclusion

BBR has an inhibitory effect on ovarian granulosa cell senescence， and the mechanism is related to the inhibition of apoptosis and autophagy mediated by the SIRT1/FoxO1 pathway.

关键词

Keywords

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